陳世健，劉文俊，楊 晨，江丹莉，歐陽宏佳，黃運(yùn)茂*，田允波*

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，廣州 510225； 2. 廣東省水禽健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510225)

2000年，Tsutsui等[1]在鵪鶉下丘腦中發(fā)現(xiàn)了一種重要神經(jīng)肽類激素，命名為促性腺激素抑制激素(gonadotropin inhibitory hormone，GnIH)。GnIH神經(jīng)肽由12個氨基酸組成，其氨基酸序列為：Ser-Ile-Lys-Pro-Ser-Ala-Tyr-Leu-Pro-Leu-Arg-Phe，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及許多周邊器官中均有分布[2]。動物的繁殖活動主要受到下丘腦-垂體-性腺軸(HPG軸)調(diào)控。研究認(rèn)為，GnIH能直接或間接通過抑制下丘腦促性腺激素釋放激素(GnRH)的分泌，抑制垂體促黃體激素(LH)和促卵泡激素(FSH)的合成與分泌，實(shí)現(xiàn)對動物繁殖的調(diào)控[3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，GnIH不僅可調(diào)控動物神經(jīng)內(nèi)分泌功能，抑制生殖行為，還影響和調(diào)控鳥類和哺乳動物的其他行為，比如性行為和攻擊性行為[4-5]。

家禽的產(chǎn)卵受到卵泡發(fā)育的影響，而卵泡發(fā)育與顆粒細(xì)胞密切相關(guān)[6]。研究發(fā)現(xiàn)，顆粒細(xì)胞在FSH和LH的刺激下合成雌二醇和孕酮以調(diào)節(jié)卵泡的成熟和排卵[7-8]，GnIH可抑制FSH和LH的合成和釋放，調(diào)控卵泡的成熟和性腺的發(fā)育[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)，GnIH及其受體GPR147在性腺組織也有表達(dá)，GnIH可直接與卵泡膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞上的結(jié)合位點(diǎn)相結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡和類固醇的合成與分泌[11-13]。外周注射一定劑量的GnIH可降低小鼠的卵巢活性并抑制卵泡的發(fā)育，也可降低豬卵巢顆粒細(xì)胞中增殖相關(guān)蛋白ERK1/2、CyclinB1 和PCNA的表達(dá)量[14]，進(jìn)而促進(jìn)顆粒細(xì)胞的凋亡和抑制顆粒細(xì)胞的增殖[15]。這表明，GnIH通過調(diào)節(jié)HPG軸來調(diào)控動物繁殖性能，還可直接影響卵泡顆粒細(xì)胞的增殖和激素的分泌[16]。而在家禽上，GnIH在性腺層面如何通過直接調(diào)控卵泡顆粒細(xì)胞來調(diào)控卵泡發(fā)育的機(jī)理尚不清楚。

本試驗(yàn)通過研究不同濃度GnIH對體外培養(yǎng)鴨顆粒細(xì)胞周期、增殖及相關(guān)基因表達(dá)的影響，以探究其對顆粒細(xì)胞的直接調(diào)控作用。研究結(jié)果有助于揭示GnIH在性腺層面對家禽繁殖的直接調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物

試驗(yàn)動物為20只180日齡、體重1.5～1.6 kg的健康山麻鴨，來源于仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院鐘村教學(xué)科研基地。山麻鴨在實(shí)驗(yàn)室按動物福利原則處死后，取等級卵泡分離顆粒細(xì)胞用于細(xì)胞原代培養(yǎng)。

1.2 主要試劑

M199(C11150500BT)、胎牛血清(FBS)、胰酶(25200)、青鏈霉素(15140122)均購自美國Gibco公司；卵泡刺激素FSH(F4021)、雄烯二酮(A-084-1ML)均購自美國Sigma公司；4%多聚甲醛購自中國 Biosharp 公司；Trizol細(xì)胞裂解液(15596026)購自美國 Ambion公司；Ⅱ型膠原酶(17101-015)購自中國 Biosharp公司；細(xì)胞周期試劑盒(JX17-50T)、EdU細(xì)胞增殖檢測試劑盒(C10310-1/-2/-3)均購自廣州銳博生物科技有限公司。鴨GnIH多肽序列(SIKPIANMPLRF)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 顆粒細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

采集山麻鴨的等級卵泡，置于裝有PBS緩沖液(含2%雙抗)的無菌燒杯中，然后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞房超凈臺內(nèi)，剝凈卵泡表面結(jié)締組織，用鑷子撕開膜層，倒置在培養(yǎng)皿上剝離顆粒層。將顆粒層收集到15 mL離心管后加入5 mL培養(yǎng)基反復(fù)吹打，隨后600 r·min-1離心3 min， 收集上清液備用。再向離心管內(nèi)加入5 mL 0.1% Ⅱ型膠原酶，重懸沉淀，置于37 ℃恒溫水浴鍋中消化20 min，每5 min震蕩1次。消化結(jié)束后加入5 mL M199完全培養(yǎng)基(含10% FBS)，用70 μm 細(xì)胞篩過濾(同時過濾上清液)至50 mL離心管，1 000 r·min-1離心10 min，棄上清，沉淀用M199 洗1次，1 000 r·min-1室溫離心10 min后加入3 mL的M199完全培養(yǎng)基(含10% FBS 及2%雙抗)，重懸后以每孔1×106個細(xì)胞的密度接種于6孔 細(xì)胞培養(yǎng)板，置于39 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)液含不同濃度GnIH(0、0.1、1、10和100 ng·mL-1)、5% FBS、2%雙抗、終濃度為1 ng·mL-1的FSH、終濃度為0.1 μmol·mL-1的雄烯二酮。

1.4 細(xì)胞周期檢測

將分離到的顆粒細(xì)胞以每孔5×105個細(xì)胞的密度接種于12孔板，用不同濃度GnIH(0、0.1、1、10和100 ng·mL-1)處理24 h后進(jìn)行細(xì)胞周期檢測。用胰酶消化吹打細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液,用1.5 mL 離心管收集細(xì)胞，1 000 r·min-1離心5 min后棄上清，細(xì)胞沉淀用1 mL預(yù)冷的PBS重懸后1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，細(xì)胞沉淀用1 mL 預(yù)冷的75%乙醇輕輕混勻，-20 ℃固定過夜。固定細(xì)胞后加入1 mL PBS室溫水合15 min。離心收集細(xì)胞，棄上清，每管加入500 μL碘化丙啶染色液，37 ℃避光條件下孵育30 min。以標(biāo)準(zhǔn)程序用流式細(xì)胞儀檢測，一般計數(shù)2萬～3萬個細(xì)胞，結(jié)果用FlowJo 7.6軟件分析細(xì)胞周期。

1.5 EdU細(xì)胞增殖檢測

將分離到的顆粒細(xì)胞以每孔5×105個細(xì)胞的密度接種于12孔板，用不同濃度GnIH(0、0.1、1、10和100 ng·mL-1)處理24 h后進(jìn)行EdU細(xì)胞增殖檢測。每孔加入1 mL 50 μmol·L-1EdU培養(yǎng)基孵育2 h，棄培養(yǎng)基，PBS清洗細(xì)胞2次，每次5 min。然后加入500 μL細(xì)胞固定液室溫孵育30 min，棄固定液。再加入500 μL甘氨酸(2 mg·mL-1)，脫色搖床孵育5 min后用PBS清洗5 min。添加1 mL滲透劑(0.5% TritonX-100的PBS)脫色搖床孵育10 min后用PBS清洗5 min，每孔加入1 mL的Apollo?染色反應(yīng)液，避光、室溫、脫色搖床孵育30 min。然后，加入1 mL滲透劑脫色搖床清洗3次，每次10 min。 每孔加入1 mL Hoechst33342反應(yīng)液，避光、室溫、脫色搖床孵育30 min后用PBS清洗2次。最后，每孔加入1 mL PBS，在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞。

1.6 增殖相關(guān)基因表達(dá)的檢測

取不同濃度GnIH(0、0.1、1、10和100 ng·mL-1)處理24 h后的6孔板細(xì)胞，棄培養(yǎng)液后用Trizol試劑從顆粒細(xì)胞中提取總RNA，根據(jù)東洋紡反轉(zhuǎn)錄試劑盒ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得顆粒細(xì)胞cDNA。熒光定量檢測增殖相關(guān)基因IGF-2、IGFBP-2、CyclinD1、CDK6、p27kip1的基因序列從NCBI 獲得，利用軟件Primer 5.0設(shè)計引物，引物序列見表1，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。熒光定量使用Power UPTM SYBR?Green Master Mix 試劑，反應(yīng)體系為20 μL：Mix 10 μL，水 8.6 μL，上、下游引物各0.2 μL，cDNA 1 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，共40個 循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參基因，每個樣品進(jìn)行3次 重復(fù)，檢測結(jié)果用2-△△CT法進(jìn)行統(tǒng)計分析。

表1 qRT-PCR 相關(guān)引物Table 1 The related primers of qRT-PCR

1.7 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)處理采用GraphPad Prism 7.0的單因素方差分析，不同處理間的顯著性檢驗(yàn)采用Tukey式多重比較。數(shù)據(jù)結(jié)果采用“Mean±SEM”表示(n=3)，P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度GnIH對顆粒細(xì)胞生長狀態(tài)的影響

在倒置熒光顯微鏡下觀察不同濃度GnIH處理后顆粒細(xì)胞的生長狀態(tài)。結(jié)果顯示(圖1)，各GnIH處理組細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞輪廓清晰，視野內(nèi)有極少量細(xì)胞碎片化，呈漂浮死亡狀態(tài)；隨著GnIH處理濃度的升高，死亡細(xì)胞的數(shù)量增加，但組間差異不顯著(P>0.05)。

A. 對照組(400×)；B. 0.1 ng·mL-1 GnIH處理組(400×)；C. 1 ng·mL-1 GnIH處理組(400×)；D. 10 ng·mL-1 GnIH處理組(400×)；E. 100 ng·mL-1 GnIH處理組(400×)；F. 視野區(qū)域內(nèi)死細(xì)胞個數(shù)。紅色箭頭指死細(xì)胞A. Control group (400×); B. 0.1 ng·mL-1 GnIH treatment group (400×); C. 1 ng·mL-1 GnIH treatment group (400×); D. 10 ng·mL-1 GnIH treatment group (400×); E. 100 ng·mL-1 GnIH treatment group (400×); F. The number of dead cells in visual field. The red arrows indicate dead cells圖1 不同濃度GnIH對顆粒細(xì)胞生長狀態(tài)的影響Fig.1 Effects of different concentrations of GnIH on growth of granulosa cells

2.2 不同濃度GnIH對顆粒細(xì)胞周期的影響

用流式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度GnIH處理對顆粒細(xì)胞周期的影響。結(jié)果顯示(圖2)，與對照組相比，各GnIH處理組細(xì)胞在G1期的比例有所下降，其中，1 ng·mL-1GnIH處理組細(xì)胞在G1期的比例顯著降低(P<0.05)；在0.1 和1 ng·mL-1GnIH處理組，細(xì)胞在G2期的比例顯著升高(P<0.05)；各GnIH處理組細(xì)胞在S期的比例均無顯著差異(P>0.05)。

A. 對照組流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果圖；B. 0.1 ng·mL-1 GnIH處理組流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果圖；C. 1 ng·mL-1 GnIH處理組流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果圖；D. 10 ng·mL-1 GnIH處理組流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果圖；E. 100 ng·mL-1 GnIH處理組流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果圖；F. GnIH處理組處于不同周期細(xì)胞所占百分比。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，下同A. The flow cytometry results of control group; B. The flow cytometry results of 0.1 ng·mL-1 GnIH treatment group; C. The flow cytometry results of 1 ng·mL-1 GnIH treatment group; D. The flow cytometry results of 10 ng·mL-1 GnIH treatment group; E. The flow cytometry results of 100 ng·mL-1 GnIH treatment group; F. The percentage of cells in different cell cycles in GnIH treatment groups. Different lowercase letters indicate significant differences (P<0.05), and the same lowercase letter indicates no significant differences (P>0.05), the same as below圖2 不同濃度GnIH對顆粒細(xì)胞周期的影響Fig.2 Effects of different concentrations of GnIH on cycle of granulosa cells

2.3 不同濃度GnIH對顆粒細(xì)胞增殖的影響

用EdU方法檢測不同濃度GnIH處理對顆粒細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示(圖3)，與對照組相比，隨著GnIH處理濃度的升高，EdU陽性細(xì)胞所占的百分比逐步降低；在1、10和100 ng·mL-1GnIH處理組中EdU陽性細(xì)胞率顯著降低(P<0.05)。

A.從各GnIH處理組中隨機(jī)選擇5張合并圖像(400×)；B. 從熒光圖像中獲得EdU陽性細(xì)胞數(shù)，計算EdU相對陽性率A.Five merged images randomly selected from each GnIH treanment group(400×); B. The number of EdU-positive cells obtained from the fluorescence image, and the relative positive rate of EdU was calculated圖3 不同濃度GnIH對顆粒細(xì)胞增殖的影響Fig.3 Effects of different concentrations of GnIH on proliferation of granulosa cells

2.4 不同濃度GnIH對顆粒細(xì)胞增殖相關(guān)基因表達(dá)的影響

用qRT-PCR方法檢測不同濃度GnIH處理對顆粒細(xì)胞增殖相關(guān)基因表達(dá)的影響。結(jié)果顯示(圖4)，與對照組相比，在0.1和1 ng·mL-1GnIH處理組中，CDK6、CyclinD1、IGF-2、IGFBP-2和p27kip1基因的相對表達(dá)量均下降，但差異不顯著(P>0.05)；在10 和100 ng·mL-1GnIH處理組中，CyclinD1、IGFBP-2和p27kip1基因的相對表達(dá)量均顯著上升(P<0.05)。

圖4 不同濃度GnIH對顆粒細(xì)胞增殖相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.4 Effects of different concentrations of GnIH on proliferation-associated genes expression in granulosa cells

3 討 論

GnIH及其同源物RFRP-3是一種重要的神經(jīng)肽類激素，可抑制性腺激素的產(chǎn)生和影響生殖細(xì)胞的分化與成熟[17-19]。研究表明，GnIH可直接或間接通過下丘腦GnRH調(diào)控垂體促性腺激素的分泌，對禽類繁殖性能發(fā)揮重要調(diào)控作用，并且在下丘腦能與褪黑素、kisspeptin等生殖相關(guān)神經(jīng)肽互作共同調(diào)節(jié)動物的生殖活性[20-21]。除了在垂體層面,GnIH可降低垂體前葉LH和FSH的分泌[22]，有研究顯示，在性腺層面，GnIH可直接抑制卵泡顆粒細(xì)胞中類固醇激素E2和T的分泌水平，對動物卵泡發(fā)育、閉鎖及排卵等發(fā)揮重要作用[23-25]。但目前在家禽上，關(guān)于GnIH直接在性腺層面調(diào)控卵泡發(fā)育及閉鎖的機(jī)理仍不清楚。因此，本試驗(yàn)在體外培養(yǎng)條件下，研究了不同濃度GnIH對卵泡發(fā)育緊密相關(guān)的顆粒細(xì)胞周期、增殖及相關(guān)基因表達(dá)的影響，所得結(jié)果一定程度上揭示了GnIH通過調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞影響卵泡發(fā)育的機(jī)理。

細(xì)胞周期進(jìn)程對家禽卵泡顆粒細(xì)胞的增殖有至關(guān)重要的影響。研究表明，在細(xì)胞增殖過程中，周期蛋白依賴性蛋白激酶(CDKs)對細(xì)胞周期產(chǎn)生重要的調(diào)控作用[26]，其中CyclinD1與CDK6 在G1期形成復(fù)合物促使細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的增殖[27]。CKI家族因子p27kip1對CDK則具有廣譜的抑制作用，與CDK-Cyclin復(fù)合物結(jié)合來調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程[28]。本研究中，用外源性GnIH處理鴨顆粒細(xì)胞后，EdU陽性細(xì)胞所占百分比下降，細(xì)胞死亡數(shù)增多，G2期細(xì)胞所占百分比增加，結(jié)果表明，GnIH處理導(dǎo)致鴨顆粒細(xì)胞增殖受到抑制，且細(xì)胞凋亡增多，其中主要原因是GnIH處理將細(xì)胞周期阻滯在G2期。檢測與細(xì)胞周期緊密相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，GnIH處理導(dǎo)致細(xì)胞周期促進(jìn)因子CDK6和CyclinD1的表達(dá)降低，細(xì)胞周期抑制因子p27kip1的表達(dá)升高。這揭示了GnIH處理是通過影響與細(xì)胞周期緊密相關(guān)因子CDK6、CyclinD1和p27kip1的表達(dá)來抑制鴨顆粒細(xì)胞的細(xì)胞周期以及增殖。本結(jié)果在相關(guān)研究中得到進(jìn)一步驗(yàn)證，有研究表明，GnIH處理豬卵巢顆粒細(xì)胞后降低了細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，并導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯在G2/M期[29]；也有研究證實(shí)，GnIH能降低顆粒細(xì)胞活力，并調(diào)控周期蛋白CyclinB1、PCNA以及其他多種周期因子的表達(dá)來阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程，影響顆粒細(xì)胞的增殖和分化[30-31]。此外，細(xì)胞增殖相關(guān)基因IGFBP-2屬于IGFBPs家族的重要成員之一，能直接或間接地影響IGF-2的功能，進(jìn)而影響細(xì)胞的有絲分裂和增殖[32]。有研究報道，在豬卵泡顆粒細(xì)胞上，IGF-2和IGFBP-2基因表達(dá)的上調(diào)會促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖[33]。本研究中，GnIH處理下調(diào)了鴨顆粒細(xì)胞中IGF-2和IGFBP-2的表達(dá)，且變化趨勢與CDK6和CyclinD1一致，結(jié)果與國內(nèi)外相關(guān)的研究報道一致。這進(jìn)一步揭示，IGF-2和IGFBP-2參與了顆粒細(xì)胞增殖的調(diào)控。另外，在本研究中，高濃度GnIH處理組會導(dǎo)致鴨顆粒細(xì)胞中部分增殖相關(guān)基因表達(dá)的上升，其中原因還不得而知。一方面可能是與本研究在體外培養(yǎng)條件下開展有關(guān)，另一方面可能與這種高劑量外源性GnIH所引起的一些細(xì)胞內(nèi)非正常作用有關(guān)，具體原因還需進(jìn)一步研究。

動物的繁殖行為和能力受多種環(huán)境因素的影響，但環(huán)境因子都需要通過神經(jīng)-內(nèi)分泌信號傳導(dǎo)影響HPG軸來調(diào)控動物繁殖活性。而GnIH作為下丘腦重要的內(nèi)分泌激素，通過生殖軸對禽類繁殖行為發(fā)揮重要調(diào)控作用[34]。GnIH不僅在生殖軸上游的下丘腦和垂體通過抑制促性腺激素的分泌調(diào)控動物繁殖活性，而且還可以在性腺層面直接調(diào)控禽類卵泡發(fā)育。大量研究表明，外周注射GnIH可抑制成年雞的性腺活性，誘導(dǎo)睪丸細(xì)胞凋亡，降低睪丸的生精活性[35-36]；在鵝的繁殖調(diào)控中，GnIH在繁殖后期維持高水平表達(dá)，促進(jìn)鵝由繁殖期向休產(chǎn)期轉(zhuǎn)變[37-38]；在鵪鶉繁殖期中，GnIH與褪黑素具有協(xié)同作用，能降低血漿睪酮水平，影響繁殖性能[39-40]；GnIH處理還可引起成年小鼠精子發(fā)生的劑量依賴性組織學(xué)變化，如生殖細(xì)胞增殖、存活標(biāo)志物下降、睪丸凋亡標(biāo)志物增加[41-42]。本研究結(jié)果也表明，在體外培養(yǎng)條件下，GnIH處理能通過影響周期相關(guān)因子的表達(dá)來抑制鴨顆粒細(xì)胞周期和增殖。因此，GnIH作為禽類生殖調(diào)控的重要因子，系統(tǒng)揭示了GnIH在生殖軸3個層面的作用機(jī)制，對深入了解禽類繁殖機(jī)理和開發(fā)提高禽類繁殖性能的技術(shù)均具有積極意義。

4 結(jié) 論

在體外培養(yǎng)的鴨顆粒細(xì)胞中，添加外源性GnIH能降低細(xì)胞周期促進(jìn)因子CDK6、CyclinD1、IGF-2、IGFBP-2的表達(dá)，提高細(xì)胞周期抑制因子p27kip1的表達(dá)，并且將細(xì)胞周期阻滯在G2期，降低EdU陽性細(xì)胞百分率，進(jìn)而抑制顆粒細(xì)胞的增殖。本結(jié)果對GnIH在性腺層面通過影響顆粒細(xì)胞調(diào)控禽類繁殖性能機(jī)理的研究具有積極意義。