劉曉曦，馬云飛，李煥榮，劉鳳華，鮑明隆，張繼東，林紅英，許劍琴*

(1.廣東海洋大學濱海農業(yè)學院動物醫(yī)學系，湛江 524000； 2.中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京 100193；3.北京農學院動物科學技術學院，北京 102200)

新生仔豬的胃腸道疾病是限制全球養(yǎng)豬業(yè)經濟效益的重要因素，仔豬泄瀉是養(yǎng)殖者特別關注的問題。調查結果顯示，北京、山東、河北等地區(qū)部分豬場的仔豬腹瀉發(fā)病率約為20%，有的甚至高達100%[1]?，F(xiàn)代獸醫(yī)學認為，仔豬腹瀉主要分為兩大類：一類是由營養(yǎng)不良、消化功能失調等生理性因素導致的腹瀉，另一類是由產腸毒大腸桿菌、傳染性胃腸炎病毒等引起的病原性腹瀉[2]。中(獸)醫(yī)學認為，以排便次數(shù)增多，糞便稀溏，甚至泄出如水樣為主癥的病證是泄瀉，基本病機是脾胃受損，濕困脾土，腸道功能失司[3-4]。泄瀉的病證主要分急性暴瀉和慢性久瀉，急性暴瀉分寒濕證、濕熱證、食滯證；慢性久瀉主要包括脾胃虛弱證、腎陽虛衰證等[5]。一般來說，生理性因素導致的仔豬泄瀉多由機體脾胃虛弱所致，而病原性仔豬泄瀉則需要根據仔豬的口色、脈象、臨床癥狀表現(xiàn)辨證分析確定為寒證或熱證后方可論治。

本試驗將圍繞著仔豬濕熱泄瀉展開研究。仔豬濕熱泄瀉證的癥狀表現(xiàn)為：煩熱口渴喜飲、糞色黃褐而臭、小便短赤、舌質紅、苔黃膩等，治療原則是清熱運脾，化濕止瀉[6]。濕熱病邪可破壞大鼠腸道上皮的完整性，使上皮細胞發(fā)生變性、壞死和脫落等現(xiàn)象[7]，濕熱泄瀉模型中大鼠的血清促炎因子如TNF-α、IL-1β和IL-6的含量均升高，機體發(fā)生炎癥反應[8-9]。此外，濕熱泄瀉還會減弱仔豬受損小腸的修復功能[10]。東漢張仲景所著《傷寒論》中的葛根芩連湯，是治療濕熱泄瀉的經典組方。葛根芩連湯可用于治療仔豬的細菌性痢疾和中毒性腸炎[11]，現(xiàn)代臨床運用中，可在葛根芩連湯原方基礎上酌情加減運用行氣燥濕健脾、清熱解毒類藥物[12]。本研究所用的加味葛根芩連湯，以經典方葛根芩連湯為基礎方，加金銀花增強葛根的清熱解毒功效，加白術、茯苓增強健脾利水和止瀉功效，清熱燥濕，健脾止瀉，兼顧解表。葛根芩連湯可通過抗炎、抗氧化、調節(jié)腸道微生物等途徑治療泄瀉[13-14]，但葛根芩連湯加金銀花、白術等藥物后對濕熱泄瀉仔豬腸道功能的調控作用尚不清楚?；诖?，本研究將探討加味葛根芩連湯對濕熱泄瀉仔豬腸道炎癥和損傷修復的調控作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

葛根、黃芩、黃連、金銀花、白術、茯苓和甘草均購自北京鶴延嶺藥業(yè)發(fā)展有限公司；4%多聚甲醛、蘇木精、伊紅、鹽酸酒精分化液、氯仿、異丙醇等均購自美國Sigma 公司；無水乙醇、95%乙醇、甲醛、二甲苯等均購自中國國藥集團化學試劑有限公司；鼠源PCNA抗體(2586)購自美國Cell Signaling Technology公司；生物素標記的驢抗鼠IgG(715-065-151)購自美國Jackson公司；Trizol reagent(15596-026) 購自美國Invitrogen公司；反轉錄試劑盒(A3500) 購自美國Promega公司；SYBR Green QPCR試劑盒(600828) 購自美國Agilent公司。

石蠟切片機(美國Amersham optical公司)；生物顯微鏡(日本Olympus公司，BH2型)；全自動熒光免疫分析儀(法國Biomèrieux MiniVidas公司，VIDAS30型)；病理圖像分析系統(tǒng)(日本Olympus公司，Olympus 6.0型)；超微量核酸蛋白測定儀(美國Thermo公司，ND2000型)；實時熒光定量PCR儀(美國STRATAGENE，MX3005P)。

1.2 葛根芩連湯的制備

加味葛根芩連湯 (Jiawei Gegen Qinlian Decoction, JGQLD)由葛根、黃連、黃芩、金銀花、白術、茯苓和甘草按一定比例組成。加水沒過藥材浸泡30 min， 煎煮2 h。經紗布濾取藥液，加水后再煎煮1次，將濾液合并，旋轉蒸發(fā)儀真空抽濾，分別濃縮藥液至生藥量為0.5、1.0和2.0 g·mL-1。4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試驗動物及分組

選8～15日齡產房未斷奶仔豬(大白×長白)30頭, 來自北京市順義區(qū)某豬場。其中健康仔豬6頭， 為對照組。選取有糞色黃褐而臭、小便短赤、舌質紅等癥狀的泄瀉仔豬24頭，分為濕熱泄瀉組(damp-heat diarrhea group, DHD group)、加味葛根芩連湯低劑量組(low dose of JGQLD group)、加味葛根芩連湯中劑量組(middle dose of JGQLD group)和加味葛根芩連湯高劑量組(high dose of JGQLD group)，每組6頭。仔豬自由采食，飲水。對照組和濕熱泄瀉組仔豬每天灌服5 mL生理鹽水，加味葛根芩連湯低劑量組每天灌服為0.5 g·mL-1的藥液5 mL(共2.5 g生藥，生藥劑量約為0.625 g·kg-1)，中劑量組每天灌服生藥濃度1.0 g·mL-1的藥液5 mL (共5.0 g生藥，生藥劑量約為1.25 g·kg-1), 高劑量組每天灌服生藥濃度為2.0 g·mL-1的藥液5 mL (共10.0 g生藥，生藥劑量約為2.50 g·kg-1)。每天1次，連續(xù)灌服5 d。

1.4 糞便評分

根據Hu等[15]介紹的5分法對仔豬糞便進行主觀視覺評分，即根據仔豬糞便形態(tài)外觀進行評分(1～5分)，糞便評分標準見表1。在服用加味葛根芩連湯的第0、3、5 天，記錄仔豬的糞便評分。

表1 糞便評分標準Table 1 Standard of fecal score

1.5 樣品采集、處理與保存

第6天，將對照組、濕熱泄瀉組和加味葛根芩連湯中劑量組內的仔豬全部頸部放血處死，打開腹腔，采集各組仔豬的十二指腸、空腸、回腸和結腸組織的中段，每段約4 cm，置于4%多聚甲醛液中固定備用。取各組仔豬的空腸，剪刀分割成每段1 cm，放入凍存管，液氮速凍后，置于-80 ℃冰箱保存。

1.6 腸道組織石蠟切片和H.E.染色

取出固定的十二指腸、空腸、回腸和結腸組織，雙蒸水沖洗干凈，然后切成0.5 cm的長度，乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，常規(guī)方法H.E.染色，生物顯微鏡鏡下觀察，并用病理圖像分析系統(tǒng)拍照。

1.7 十二指腸增殖性細胞核抗原免疫組織化學染色

選十二指腸切片經PBS洗滌，1% H2O2孵育后PBS洗滌，加增殖性細胞核抗原(PCNA)一抗(1∶5 000 稀釋)孵育過夜。PBS洗滌后滴加二抗 1∶100 生物素標記的驢抗鼠IgG，室溫孵育2 h，PBS洗滌后滴加1∶100 ABC復合物，室溫孵育1 h，PBS洗滌后滴加DAB顯色液，逐滴滴入1% H2O2，觀察十二指腸切片顏色變化，顯色3～5 min后終止染色。常規(guī)脫水、透明、封片，室溫保存。生物顯微鏡鏡下觀察，用全自動熒光免疫分析儀拍照。

1.8 RNA提取、反轉錄及熒光定量PCR

分段的仔豬空腸放入凍存管，液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存。取空腸用TRIzol總RNA提取試劑盒提取仔豬空腸總RNA。用兩步法進行RNA逆轉錄，總反應體系為25 μL。首先配備反應體系13 μL(總RNA模板1.0 μg，Oligo (dT) 18為 1.0 μL，DEPC水11 μL)，PCR儀中70 ℃進行變性反應5 min， 立即冰浴3 min。接著，在反應體系中加入以下試劑：1.25 μL的dNTPs (10 mmol·μL-1)，0.5 μL 的RNasin (Ribonuclease Inhibitor, 40 U·μL-1)， 5.0 μL的M-MLV逆轉錄酶 5 × Buffer，1.0 μL的M-MLV逆轉錄酶 (200 U·L-1)，以及4.25 μL的DEPC水。PCR儀中42 ℃反應1 h， 將產物 cDNA立即使用或-20 ℃保存。

用熒光定量PCR (SYBR Green I)方法對各組內空腸TLR4、TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA的表達量進行測定。目的基因TLR4、TNF-α、IL-1β和IL-6 的引物序列見表2。

表2 熒光定量PCR引物表Table 2 Primers for fluorescence quantitative PCR

按照SYBR Green qPCR試劑盒說明書配制20 μL 反應體系：Mix (2 ×) 10 μL，cDNA模板+DEPC 水8.0 μL，上游引物1.0 μL，下游引物1.0 μL。 反應體系混勻后立即放入實時熒光定量PCR儀中，反應條件：95 ℃預變性10 min； 95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，循環(huán)40次；72 ℃再延伸8 min。熔解曲線反應條件：95 ℃ 1 min； 58 ℃ 30 s；95 ℃ 30 s。基因相對表達量計算公式：相對含量=2-[ΔΔCt]， ΔΔCt=處理組ΔCT (目的基因-β-actin)- 對照組ΔCT (目的基因-β-actin)。

1.9 數(shù)據分析

試驗結果用“Mean±SEM”表示，應用統(tǒng)計軟件SPSS 20.0進行多重比較檢驗。其中, PCNA免疫組化結果用Image J軟件分析，熒光定量PCR檢測結果應用Mx 3000P (Stratagene, USA) 分析，試驗結果均采用origin 6繪圖軟件制圖。*表示P<0.05，**表示P<0.01。

2 結 果

2.1 仔豬糞便評分

各組仔豬的糞便評分如表3所示。在0 d，健康仔豬的糞便評分和濕熱泄瀉仔豬的糞便評分存在顯著差異(P<0.05), 濕熱泄瀉的仔豬發(fā)生了嚴重的腹瀉。服用加味葛根芩連湯3 d 后，相比于DHD組，JGQLD組仔豬的糞便評分顯著下降(P<0.05)，且存在劑量依賴性，表明加味葛根芩連湯初步緩解了濕熱泄瀉仔豬的腹瀉。服用加味葛根芩連湯5 d后，濕熱泄瀉仔豬的糞便評分均恢復正常，未發(fā)生腹瀉。

表3 仔豬的糞便評分Table 3 The fecal score of piglets

2.2 仔豬小腸和結腸的形態(tài)結構觀察

正常情況下，仔豬小腸和結腸絨毛結構完整，排列有序(圖1 A1～D1)。濕熱泄瀉仔豬的十二指腸結構受到嚴重破壞，腸腔內分泌大量液體，絨毛排列紊亂，絨毛中下部發(fā)生斷裂現(xiàn)象，嵴斷裂，黏膜固有層受到嚴重損傷，血管擴張并出現(xiàn)炎性細胞聚集(圖1 A2)?？漳c結構受到嚴重破壞，絨毛和隱窩斷裂與嵴分離脫落至腸腔(圖1 B2)?；啬c結構受到損傷，絨毛上皮發(fā)生脫落現(xiàn)象(圖1 C2)。結腸上皮有脫落現(xiàn)象，固有層下有出血(圖1 D2)。加味葛根芩連湯中劑量組內，仔豬十二指腸結構趨于正常，絨毛分布較為整齊，有大量的絨毛包裹成團脫落至腸腔，脫落的絨毛團中有炎性細胞聚集(圖1 A3)?？漳c和回腸結構完整，黏膜固有層下發(fā)生輕微出血(圖1 B3和C3)。結腸結構較完整(圖1 D3)。

1代表分泌的黏液; 2代表損傷的絨毛上皮; 3代表脫落的絨毛團; 4代表出血; 5代表炎性細胞聚集1 represents secreted mucus; 2 represents damaged villus; 3 represents shedding villus; 4 represents bleeding; 5 represents gathered inflammatory cells圖1 仔豬小腸和結腸形態(tài)結果變化 (H.E.染色)Fig.1 The morphology section of small intestine and colon in piglets (H.E. staining)

2.3 十二指腸PCNA表達量變化

如圖2所示，棕黃色所示為增殖性細胞核抗原(PCNA)免疫反應陽性產物。免疫組織化學染色結果顯示，正常情況下，PCNA在仔豬十二指腸的絨毛和隱窩處呈均一散落分布(圖2A和D)；相比于對照組，濕熱泄瀉組仔豬十二指腸絨毛中PCNA表達量極顯著降低(P<0.01)，腸腺隱窩PCNA表達量顯著升高(P<0.05)(圖2B和E，圖3)；相比于濕熱泄瀉組，加味葛根芩連湯中劑量組仔豬十二指腸絨毛PCNA表達量極顯著升高(P<0.01)，腸腺隱窩PCNA表達量顯著降低(P<0.05)(圖2C和F，圖3)。

A、B和C為低倍鏡下觀察結果，D、E和F為高倍鏡下觀察結果A, B and C (Low magnification), D, E and F (High magnification)圖2 仔豬十二指腸PCNA表達變化Fig.2 Changes of PCNA expression in the duodenum of piglets

A.十二指腸絨毛中PCNA染色的百分比； B.十二指腸隱窩中PCNA染色的百分比A. The percentage of PCNA-stained cells in the villus of duodenum; B. The percentage of PCNA-stained cells in the crypt of duodenum圖3 仔豬十二指腸的絨毛和隱窩PCNA表達量變化Fig.3 Changes of PCNA expression in the villus and crypt of duodenum in piglets

2.4 空腸炎性因子mRNA表達量變化

由圖4可知，相比于對照組，濕熱泄瀉組仔豬空腸TLR4 mRNA表達量顯著升高至1.83倍(P<0.05)，TNF-αmRNA表達量極顯著升高至4.32倍(P<0.01)，IL-1β mRNA表達量極顯著升高至6.88倍(P<0.01)，IL-6 mRNA表達量顯著升高至5.25倍(P<0.05)，表明濕熱泄瀉仔豬空腸激活了TLR4介導的腸道炎癥反應。相比于濕熱泄瀉組，加味葛根芩連湯中劑量組仔豬TLR4 mRNA表達量顯著降低至0.54倍(P<0.05)，TNF-αmRNA 表達量極顯著降低至0.23倍(P<0.01)，IL-1β mRNA表達量極顯著降低至0.18倍(P<0.01)，IL-6 mRNA表達量顯著降低至0.29倍(P<0.05)，表明加味葛根芩連湯阻斷了濕熱泄瀉仔豬空腸TLR4介導的腸道炎癥反應。

圖4 仔豬空腸 TLR4、TNF-α、IL-1β and IL-6 mRNA表達量變化Fig.4 The mRNA expression of TLR4, TNF-α, IL-1β and IL-6 in the jejunum of piglets

3 討 論

葛根芩連湯可解除表證，清解里熱，適用于濕熱泄瀉證。此方的君藥葛根解表清熱，升清止瀉，臣藥黃芩、黃連清熱燥濕，金銀花助其清熱，佐藥白術、茯苓增強利濕，炙甘草調和諸藥。各組仔豬的糞便指數(shù)顯示，加味葛根芩連湯顯著改善了仔豬的濕熱泄瀉。葛根芩連湯中，葛根和黃芩都具有抗炎、抗氧化的作用[16], 葛根與黃芩配伍能增加黃芩的藥效[12]；黃連是降低小鼠腹瀉指數(shù)的主要作用藥物，炙甘草與黃連配伍是降低小腸推進率的兩個主要作用藥物，且炙甘草與黃連配伍能增強黃連的藥效[17]。葛根芩連湯可通過多種方式治療泄瀉，如它可通過調節(jié)腸道微生物及其代謝產物短鏈脂肪酸的方式治療仔豬泄瀉[13]，它能在小鼠的潰瘍性結腸炎模型中降低腸道的炎癥反應和氧化應激[14]。此外，相比于正常的大鼠，濕熱病邪還促進大鼠的腸道對葛根芩連湯的吸收[18]。

本試驗中，濕熱泄瀉致使仔豬的十二指腸、空腸、回腸和結腸組織結構受到損傷，特別是十二指腸和空腸；濕熱泄瀉仔豬的十二指腸還分泌了大量黏液，結腸絨毛上皮有出血現(xiàn)象。小腸黏膜的所有上皮細胞來源于隱窩干細胞，隱窩干細胞的發(fā)生、分化、增殖、分布等過程，直接影響腸黏膜的完整性和功能特異性。PCNA是一種在增殖細胞內合成或表達的核內多肽，是DNA 合成必不可少的因子，PCNA陽性表達的強弱直接反映了細胞增殖活動的高低[19]，它在斷奶仔豬的損傷小腸表達顯著增加[20]。本研究中，對照組仔豬十二指腸的PCNA 主要在隱窩中上部的分裂區(qū)表達(圖2A和D)；濕熱病邪誘導的仔豬腸道黏膜損傷后，十二指腸腸腺隱窩處PCNA表達量顯著升高(圖2B和E，圖3B)，所以十二指腸隱窩PCNA的高表達是由濕熱病邪誘導的腸道損傷引起的。

相比于濕熱泄瀉組，加味葛根芩連湯組的十二指腸、空腸、回腸和結腸的組織結構得到顯著改善，表明加味葛根芩連湯阻斷了濕邪、熱邪對腸道的損傷，從而維持腸道結構的完整性。前期研究中，我們發(fā)現(xiàn),葛根的主要活性成分葛根素，黃芩中的黃芩苷，以及黃連中的鹽酸小檗堿預處理豬腸道上皮細胞后可顯著改善上皮細胞的微觀結構[21]，所以，此方中的葛根、黃芩和黃連都起到了維持腸道結構完整性的作用。PCNA可通過參與小腸細胞增殖過程，誘導小腸黏膜上皮細胞由絨毛底部隱窩處開始不斷地分裂增殖，并逐漸向絨毛上方遷移分化成熟[22]。相比于濕熱泄瀉組，加味葛根芩連湯組十二指腸絨毛中的PCNA表達量顯著升高(圖3A)，腸腔中還有不斷脫落的絨毛上皮細胞，這表明，濕熱泄瀉仔豬服用加味葛根芩連湯后，隱窩干細胞不斷向上方遷移分化為成熟的黏膜上皮細胞，并促進了受損的絨毛上皮細胞的脫落。以上表明，加味葛根芩連湯可以通過促進隱窩干細胞的增殖和分化為成熟的腸道上皮細胞以維持腸道結構的完整性。黃芩可對腸炎模型小鼠受損的空腸發(fā)揮修復作用[23]，且黃芩苷對豬的腸道上皮細胞具有增殖活性[21]，所以，加味葛根芩連湯中的黃芩可能是促進腸道損傷修復的關鍵藥物。葛根芩連湯還可通過促進腸道緊密連接蛋白的表達緩解泄瀉仔豬的腸道損傷[13]，這可能是加味葛根芩連湯緩解濕熱泄瀉的潛在作用途徑。

腸道上皮表面的Toll樣受體激活后會促進黏膜免疫系統(tǒng)分泌促炎因子、趨化因子和抗微生物小肽等，激活細胞的先天性和獲得性免疫反應，而腫瘤壞死因子-α (TNF-α)，白介素1β (IL-1β)和白介素6 (IL-6)是炎癥反應發(fā)生后的促炎因子[24]。促炎因子是調節(jié)腸道上皮滲透性的重要因素，可控制腸道上皮緊密連接蛋白的組成和結構[25-26]，如TNF-α可以損害上皮細胞中緊密連接蛋白的功能，IL-1β可以抑制緊密連接蛋白的表達[26]。在本試驗中，相比于對照組，濕熱泄瀉組仔豬空腸的TLR4、TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA顯著升高，表明濕熱泄瀉激活了仔豬空腸中TLR4介導的炎癥反應。相比于濕熱泄瀉組，加味葛根芩連湯中劑量組內仔豬空腸的TLR4、TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA顯著降低。在小鼠潰瘍性結腸炎模型也發(fā)現(xiàn)，葛根芩連湯抑制了TLR4信號通路，發(fā)揮抗炎作用[14]。仔豬空腸炎性因子在mRMA水平表達量下降，表明加味葛根芩連湯了降低濕熱泄瀉仔豬的空腸的炎癥反應，進而維持了腸道上皮結構的完整性。

4 結 論

本研究結果表明，加味葛根芩連湯可通過促進隱窩干細胞的增殖和降低炎癥反應修復濕熱泄瀉仔豬腸道損傷。