白文明，邢冉冉，陳麗萍，彭 濤，雷紅濤，陳 穎,*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學食品學院，廣東 廣州 510642；2.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100176；3.中華人民共和國昆明海關檢驗檢疫技術中心，云南 昆明 650051）

鵝膏菌屬（Amanita）屬于真菌界（Fungi）、擔子菌亞門（Basidiomycotina）、層菌綱（Hymenomycetes）、傘菌目（Agaricales）、鵝膏菌科（Amanitace），是大型真菌中分布較廣的大屬。全世界報道且被驗證的鵝膏菌有近500 種，我國報道的有130多種（亞種、變種及變型）[1]。在這些鵝膏菌中，既有可食用的鵝膏菌，如橙蓋鵝膏菌（Amanita caesarea）、卵蓋鵝膏菌（A.ovoidea）、紅黃鵝膏菌（A.hemibapha）等[2-3]，也有含毒的鵝膏菌，如錐鱗白鵝膏菌（A.virgineoides）、小毒繩鵝膏菌（A.melleiceps）、鱗柄白鵝膏菌（A.virosa）[4-7]。據(jù)不完全統(tǒng)計，我國2019年共發(fā)生了53 起蘑菇中毒事件，其中52.8%的病例是由于食用鵝膏菌屬引起的，如致命鵝膏菌（A.exitialis）、灰花紋鵝膏菌（A.fuliginea）、裂皮鵝膏菌（A.rimosa）等。鵝膏菌屬物種主要分布在樹林邊緣地方，在我國主要分布于亞熱帶地區(qū)，如廣州、湖南、云南、山東等地；少數(shù)分布于我國溫帶或熱帶地區(qū)，如海南的灰蓋粉褶鵝膏（A.griseorosea）、假褐云斑鵝膏菌（A.pseudoporphyria）等。

傳統(tǒng)的真菌鑒定及分類主要是形態(tài)學鑒定，依據(jù)子實體菌蓋、菌柄、菌托等不同形態(tài)特征以及孢子類型進行宏觀的分析和評價[8]。該方法簡單直觀，但因真菌物種形態(tài)特征的有限性，以及形態(tài)滯后等特點，僅靠有限的特征很難得出真菌系統(tǒng)的親緣以及物種特征，因此該方法存在一定局限性和主觀性。隨著蘑菇中各種毒素的發(fā)現(xiàn)，通過檢測毒素鑒別蘑菇類型的方法也隨之發(fā)展起來，如從最開始的汁液顯色法[9]、層析法到更加精確的液相色譜二極管陣列檢測[10]、電感耦合等離子體質譜[11]、液相色譜-質譜[12-13]等方法。這些檢測技術在毒素分子檢測方面靈敏度高、可靠性好，且能檢測尿液和血漿中的肽類毒素[14]，但此類方法前處理時間和成本較高，且毒素提取過程中易混入樣品中的磷脂類物質，造成設備離子源的污染，同時產(chǎn)生一定的基質干擾，影響結果的準確性[15-16]。隨著分子生物學技術的飛速發(fā)展，DNA分子標記技術在真菌分類學和系統(tǒng)進化研究[17]已逐漸成熟，如簡單重復序列[18-19]、限制性片段長度多態(tài)性[20]等。特別是近年發(fā)展起來的DNA條形碼技術，現(xiàn)已經(jīng)成為分子鑒別以及分子分類學的核心方法，在真?zhèn)舞b定物種鑒別等方面發(fā)揮著重要作用，廣泛應用于動植物、微生物的物種鑒定[21]。

理想的DNA條形碼區(qū)域應該易于擴增，變異程度足以區(qū)分物種[22-23]。近年來，已有利用核糖體DNA上的內(nèi)轉錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）、核糖體大亞基（large subunit ribosomal，LSU）、RNA聚合酶II的第2大亞基（the second largest subunit of RNA polymerase II，RPB2）、β-微管蛋白（β-tubulin）等對大型真菌成功進行種類鑒定及分子系統(tǒng)發(fā)育分析的研究報道[24-29]。對于鵝膏菌屬，也有基于ITS、LSU、β-tubulin、RPB2等基因序列對致死鵝膏菌、灰花紋鵝膏菌、淡紅鵝膏菌等進行分子鑒定的報道[5,30-33]。

本研究基于ITS、LSU、RPB2、β-tubulin4 條基因對27 種有毒鵝膏菌進行序列測定及分析，評價不同DNA條形碼候選序列對有毒鵝膏菌的鑒別能力，旨在為有毒蘑菇分類鑒別、親緣關系分析提供一定的理論基礎，為有毒蘑菇誘發(fā)的食源性中毒風險預警和準確鑒定提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究使用的27 種鵝膏菌屬共38 個蘑菇樣本，見表1。其中假淡紅鵝膏菌由中國疾病預防控制中心趙云峰老師提供，其余鵝膏菌樣品由湖南師范大學陳作紅教授提供并進行形態(tài)學鑒定，所有鵝膏菌均為子實體。

DNAsecure Plant Kit DNA新型植物試劑盒 天根生化科技有限公司；ExoSAP-ITTM聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)物快速回收試劑盒、BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit、BigDye XTerminator Purification Kit、Cathode Buffer Container (CBC) 3500 Series、Anode Buffer Container(ABC) 3500 Series和POP-7? Polymer for 3500/3500xL Genetic Analyzers 北京奧今東方科技有限公司；PCR擴增引物均由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

表1 鵝膏菌屬樣品信息Table 1 Information about the collected Amanita samples

續(xù)表1

1.2 儀器與設備

BT323S電子天平 賽多利斯科學儀器有限公司；Sorvall? ST8臺式離心機、Nanodrop超微量分光光度計美國Thermo Fisher Scientific公司；VORTEX-GENIE2渦旋振蕩器 美國Scientific Industries公司；電泳儀、Versa Doc凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司；Qubit?3.0核酸熒光蛋白定量儀 美國Invitrogen公司；PCR儀、ABI3500測序儀 美國Applied Biosystems公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取與PCR擴增

鵝膏菌DNA提取方法按照DNAsecure Plant Kit DNA新型植物試劑盒（天根）操作說明進行，提取的DNA樣品保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

選用ITS、LSU、RPB2、β-tubulin4 個DNA片段，分別用通用引物（ITS4/ITS5[34]、LSU-LROR/LSU-LR5[35]、bRPB2-6F/bRPB2-7-1R[36-37]和β-tubulinF/R[38]）對鵝膏菌樣品進行擴增，引物序列信息及擴增程序見表2。

表2 擴增基因片段引物信息及擴增程序Table 2 Sequences of primers and PCR amplification procedures used in this study

ITS反應體系：2hTaqPCR Master Mix 12.5 μL，10 μmol/L上下引物各0.3 μL，10 ng/μL DNA模板3 μL，加無菌去離子水至25 μL。LSU反應體系：2hTaqPCR MasterMix 12.5 μL，10 μmol/L上下引物各0.2 μL，10 ng/μL DNA模板3 μL，加無菌去離子水至25 μL。RPB2反應體系：5 U/μLTaq酶0.2 μL，dNTP 1.5 μL，10h PCR buffer 2.5 μL，10 μmol/L上下引物各0.25 μL，10 ng/μL DNA模板2 μL，加無菌去離子水至25 μL。β-tubulin反應體系：5 U/μLTaq酶0.2 μL，dNTP 1.5 μL，10h PCR buffer 2.5 μL，10 μmol/L上下引物各0.3 μL，10 ng/μL DNA模板4 μL，加無菌去離子水至25 μL。用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物后，將條帶單一且明亮的PCR產(chǎn)物進行純化回收，進行下一步Sanger測序。

1.3.2 測序

將純化后的PCR產(chǎn)物進行雙向測序，測序反應體系總體積10 μL，包含：PCR純化產(chǎn)物1 μL，5h Sequencing buffer 1 μL，BigDye Terminator 0.8 μL，引物1.6 μL（1 μmol/L），無菌去離子水5.6 μL。PCR擴增程序：96 ℃預變性2 min；96 ℃變性20 s，55 ℃退火10 s，60 ℃延伸4 min，25 個循環(huán)，4 ℃保存。采用BigDye XTerminator Purification Kit對產(chǎn)物進行純化后，吸取上清液于96 孔測序板中，于ABI 3500基因分析儀進行測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

對雙向測序所得樣品結果用DNASTAR軟件中的SeqMan程序進行校對拼接，去除低質量區(qū)的序列。將拼接后的序列提交NCBI的GenBank數(shù)據(jù)（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov）進行序列比對鑒別物種來源。利用MEGA6.0軟件對各基因序列進行多序列比對分析，并基于Kimura-2-Parameter（K2P）雙模型[39]和鄰位連接（Neighbor-Joining，NJ）法[40]計算遺傳距離，構建系統(tǒng)發(fā)育樹，采用Bootstrap檢驗法進行可信度測驗，自展系數(shù)為1 000。

2 結果與分析

2.1 DNA提取與PCR擴增

分別提取38 個鵝膏菌屬樣品的基因組DNA，用Nanodrop超微量分光光度計測定濃度及純度，各樣品DNA質量濃度在40～584.8 ng/μL之間，表明DNA濃度較高，A260nm/A280nm在1.60～2.06，表明DNA純度較好，符合后續(xù)實驗要求。利用通用引物對ITS、LSU、RPB2、β-tubulin4 條序列進行PCR擴增，電泳結果如圖1所示。引物ITS4/ITS5、LSU-LROR/LR5、RPB2-6F/7-1R、β-tubulin-F/R擴增成功率分別為89.47%（34/38）、89.47%（34/38）、84.21%（32/38）、97.37%（37/38），表明引物β-tubulin-F/R的通用性較引物ITS4/ITS5、LSU-LROR/LR5、RPB2-6F/7-1R更好。A.sculpta、A.fritillaria未能擴增出RPB2目的條帶，A.javanica未能擴增出RPB2、β-tubulin目的條帶，A.sphaerobulbosa、A.manginiana、A.gymnopus未能擴增出ITS、LSU、RPB2目的條帶，但能擴增出長度約為425 bp的β-tubulin目的條帶，其原因是由于實驗樣品存放時間太長，DNA被降解成短片段，因而擴增片段大于600 bp的長片段ITS、LSU、RPB2等基因難以成功擴增出相應片段[41]。因此結合引物ITS4/ITS5與β-tubulin-F/R則可將本研究中所有鵝膏菌物種擴增出來。

圖1 鵝膏菌樣品4 條基因序列的PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electropherograms of PCR-amplified products of Amanita samples using four barcodes

2.2 PCR產(chǎn)物測序與序列比對分析

將純化后的PCR產(chǎn)物用ABI3500基因分析儀進行雙向測序，對符合標準的測序序列進行拼接和校對。共獲得ITS序列34 條，LSU序列34 條，RPB2序列32 條，β-tubulin序列37 條，測序成功率均為100%，不同候選序列在序列長度上存在明顯差異，由高至低依次為LSU、RPB2、ITS、β-tubulin。將拼接后的序列提交NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov）進行序列比對鑒別物種來源。如表3所示，33 種鵝膏菌的LSU、RPB2、ITS、β-tubulin基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中的參考序列相似度在99%及以上，與形態(tài)學鑒定結果一致；5 種鵝膏菌比對結果與形態(tài)學鑒定結果不一致，其中，形態(tài)學鑒定結果為A.caojizong的CAIQ12004和CAIQ12006樣品，其序列比對鑒定結果分別為A.pseudoprinceps、A.yuaniana；編號為CAIQ12018的樣品，形態(tài)學鑒定為Amanitasp.，而序列比對鑒定為A.minutisquama；編號為CAIQ12008和CAIQ12037的樣品，其擴增片段序列與A.rimosa和A.aspericeps的同源性分別為100%和99%，與形態(tài)學鑒定的A.oberwinklerana、A.sinensis不一致。整體而言，4 條DNA條形碼的鑒別能力從高至低分別為β-tubulin、ITS、LSU、RPB2，且4 條基因序列在比對結果上具有很好的一致性，表明所得到的序列準確度較高。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹構建

K-2-P參數(shù)模型是生命條形碼聯(lián)盟（Consortium for the Barcode of Life，CBOL）推薦用于計算遺傳距離的模型[42]。在本研究中，采用K-2-P參數(shù)模型計算了所用鵝膏菌的種內(nèi)和種間遺傳距離（表4）。數(shù)據(jù)顯示，ITS、RPB2、β-tubulin基因序列的種間最小遺傳距離均遠大于種內(nèi)最大遺傳距離，存在明顯的條碼間隔，不存在種內(nèi)和種間的交叉重疊，這一結果表明ITS、RPB2、β-tubulin片段適合作為DNA條形碼。其中，ITS、β-tubulin表現(xiàn)出最高的種間序列差異，可作為優(yōu)選條形碼。LSU序列的種間最小遺傳為0.03，種內(nèi)最大遺傳距離為0.034，種間平均遺傳距離是種內(nèi)平均遺傳距離的244 倍，但在0.030～0.034區(qū)間存在種內(nèi)和種間遺傳距離的交叉重疊，這會造成部分物種的鑒定錯誤，表明此基因序列在一定程度上能夠鑒定物種，不適合作為本研究中用于鑒定鵝膏菌屬的DNA條形碼。

將ITS、LSU、RPB2、β-tubulin擴增基因序列進行比對對齊，通過建立NJ樹以評價候選DNA條形碼對鵝膏菌屬物種的鑒別效率。NJ樹結果顯示（圖2），基于鵝膏菌ITS、LSU、RPB2、β-tubulin序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹均可分為兩大支。ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹中A.caojizong、A.subglobosa、A.javanica、A.fritillaria、A.subpallidorosea、A.rimosa聚為一支，其余16 種鵝膏菌聚為一支；LSU序列系統(tǒng)發(fā)育樹的兩大支分別為A.caojizong、A.subpallidorosea、A.javanica、A.subglobosa、A.melleiceps、A.flavipes聚為一支，其余16 種鵝膏菌聚為一支；RPB2序列系統(tǒng)發(fā)育樹的一支為A.caojizong、A.subglobosa、A.subpallidorosea、A.vaginata、A.flavipes、A.rufoferruginea，其余15 種鵝膏菌聚為一支。β-tubulin序列系統(tǒng)發(fā)育樹中A.pallidorosea、A.pseudogemmata、A.rufoferruginea、A.gymnopus、A.caojizong、A.minutisquama聚為一支，其余22 種鵝膏菌聚為一支。在NJ樹中，如果絕大多數(shù)物種都能聚集成單系，且具有較高的節(jié)點支持率，則表明所選擇的DNA條形碼在上述物種鑒定的適用性和可行性較高。

表3 DNA條形碼擴增序列比對結果Table 3 Alignment results of DNA barcode amplified sequences

當DNA條形碼基因區(qū)域遺傳變異較少，進化速率較慢時，則易出現(xiàn)不同物種的序列形成內(nèi)聚性聚類的現(xiàn)象[43]。LSU作為28S rDNA基因上保守區(qū)和可變區(qū)中片段較長的基因，其遺傳變異較少，在LSU序列構建的NJ樹中，A.caojizong、A.javanica聚為一支，表明上述鵝膏菌親緣關系較近；在RPB2序列構建的NJ樹中，A.rufoferruginea、A.subglobosa、A.flavipes聚為一支，分析原因可能是由于RBP2序列單拷貝和進化速率慢，較其他基因相對保守[44-45]，當物種親緣關系較近時，RBP2基因具有相似性。這也表明了所選擇的DNA條形碼能夠在一定程度上鑒別遺傳變異較小的物種。

表4 4 種候選序列信息比較Table 4 Comparison of four candidate sequences

通過序列比對分析與系統(tǒng)發(fā)育分析結果顯示，出現(xiàn)有毒鵝膏菌與無毒鵝膏菌鑒別錯誤的現(xiàn)象。編號為CAIQ12004、CAIQ006的無毒A.caojizong鑒定為有毒的A.pseudoprinceps以及無毒的A.yuaniana，以ITS、LSU、RPB2、β-tubulin四種序列分析，三者遺傳距離分別為0.502～1.567、0.212～1.019、0.287～1.412、0.326～0.923，其遺傳距離較小，親緣相對較近，且在形態(tài)學上A.caojizong與A.pseudoprinceps、A.yuaniana極為相似，菌蓋幼時半球形，后近平展，褐灰色，中部色深、光滑，這也解釋了形態(tài)學鑒定會出現(xiàn)誤判的原因。編號為CAIQ12037的A.sinensis為無毒鵝膏菌，而鑒定為有毒的A.aspericeps，以ITS、LSU、RPB2、β-tubulin四種序列分析，兩者遺傳距離分別為1.279、1.084、1.160、0.914，親緣關系較近。A.sinensis與A.aspericeps在形態(tài)上相似度也較高，其子實體邊緣有棱紋，灰白色至淺灰色，中部深灰色，表面有泥灰疣狀至顆粒狀菌幕殘余。

另外，編號CAIQ12004的樣品與A.pseudoprinceps聚為一支，且與編號為CAIQ12005的A.caojizong分為兩支，結合序列比對結果表明該樣品不是A.caojizong，而是A.pseudoprinceps，A.pseudoprinceps與A.c a o j i z o n g外觀極其相似，常被認為是同物種，從系統(tǒng)發(fā)育樹上則可證明A.pseudoprinceps與A.caojizong是2 個不同的物種，而非同一物種不同名稱；同理，編號為CAIQ006、CAIQ12008、CAIQ12018和CAIQ12037的物種名稱應分別為A.yuaniana、A.rimosa、A.minutisquama、A.aspericeps。形態(tài)學物種鑒定的參考庫需要大量的標本，包括菌蓋、菌柄、菌托以及孢子，許多形態(tài)特征在不同的發(fā)育階段也會發(fā)生一定的變化，因此，偶爾錯誤識別是不可避免的，這也反映了DNA條形碼可以檢測到形態(tài)學錯誤識別的情況，可以為大型真菌的物種鑒定提供更多證據(jù)。

圖2 基于ITS、LSU、RPB2序列構建的鵝膏菌物種NJ系統(tǒng)發(fā)育樹*Fig.2 Neighbor-joining phylogenetic tree of Amanita species based on the sequences of ITS, LSU, RPB2 and β-tubulin

3 結 論

本研究從NCBI序列比對、種內(nèi)種間變異、系統(tǒng)發(fā)育樹3 個方面分析不同DNA條形碼對于27 種有毒鵝膏菌屬物種的鑒別能力。結果表明，4 條DNA條形碼序列的擴增成功率從高至低分別為β-tubulin＞ITS＞LSU＞RPB2，β-tubulin、ITS、RPB2三個片段不存在種間和種內(nèi)遺傳距離的交叉重疊，物種分辨率較高，滿足DNA條形碼的基本要求。鑒于β-tubulin、ITS兩個基因結合可鑒別本研究中所有鵝膏菌，因此推薦將兩者聯(lián)合使用用于鵝膏菌屬的物種鑒別，為有毒蘑菇誘發(fā)的食源性中毒風險進行預警。β-tubulin序列長度在367 bp左右，序列長度較短，適合對深加工的蘑菇制品以及誤食毒蘑菇后的嘔吐物進行分析。在現(xiàn)實有毒蘑菇中毒事件中很難采集到完整的蘑菇樣品，需要從煮熟的殘留蘑菇或者是從患者胃抽取物中獲得樣本用于鑒定，因此，β-tubulin在蘑菇中毒事件中的原因排查環(huán)節(jié)具有較大的優(yōu)勢，可作為鵝膏菌屬中毒事件中物種鑒定的優(yōu)選條形碼。