康子悅，沈 蒙，葛云飛，王 娟，全志剛，肖金玲，王維浩,2，曹龍奎,2,*

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學食品學院，黑龍江 大慶 163319；2.國家雜糧工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶 163319）

小米（Setaria italicaBeauv.），原名粟，在世界谷物產(chǎn)量中排名第6，我國黃河中上游為主要栽培區(qū)[1]?！侗静菥V目》中記載，小米“治反胃熱痢，煮粥食，益丹田，補虛損，開腸胃”。中醫(yī)亦講小米“和胃溫中”，認為小米粥具有清熱解渴、健胃除濕、補虛損和健胃消食等功效。

多酚類化合物具有抗氧化、抗腫瘤、延緩衰老、預防或減少疾病的發(fā)生等作用，是世界上最廣泛的膳食補充劑之一。多酚類化合物是小米中最主要的功能性成分之一，同樣具有上述功能特性[2-3]。小米中含有游離和共軛形式的酚酸，包括羥基苯甲酸和羥基肉桂酸的衍生物；還含有黃酮類化合物，包括黃酮、黃烷酮、異黃酮等。此外，部分小米中還含有少量的單寧類物質(zhì)[4-5]。小米粥作為家庭常吃的一種粥品，具有開腸胃、反胃熱痢、健胃消食等養(yǎng)胃功能。而多酚類化合物作為一種功能因子存在于小米粥中，不僅具有抗氧化、抗腫瘤等作用，還具有修復胃黏膜損傷、提高胃腸動力和預防胃腸道疾病等功能，因此酚類化合物可能是小米粥養(yǎng)胃的功能因子之一。

現(xiàn)階段，對于小米和小米粥中酚類化合物的研究停留在提取工藝、抗氧化能力測定及加工對總多酚或幾種酚類物質(zhì)的影響階段。魏春紅等[6]采用酶法輔助提取小米多酚，結(jié)果表明液料比14∶1 （mL/g）、雙酶添加量0.9%、酶解時間2 h、酶解溫度40 ℃為最佳提取工藝。延莎等[7]測定不同米色的小米多酚類化合物的抗氧化能力，結(jié)果表明晉谷21抗氧化能力最強。張玲艷等[8]探究蒸煮對小米多酚及抗氧化活性的影響，結(jié)果表明煮小米中總多酚的保留率較高。Geetha等[9]采用酶法-超聲法協(xié)同萃取小米糠中多酚類化合物，該方法的提取率是常規(guī)法的2 倍，且抗氧化能力也隨之提高。Hithamani等[10]提取的小米多酚總量為10.2 mg/g，發(fā)芽或壓力蒸煮后多酚含量下降了50%，而開鍋蒸煮后其多酚含量僅下降12%～19%。Taylor等[11]分析了脫皮、蒸煮、發(fā)芽后小米中多酚類化合物的變化，結(jié)果表明食品加工會降低多酚類化合物的含量。其中熱處理影響復雜，可能是在此過程中發(fā)生結(jié)合酚的釋放和多酚的解聚。

目前，小米經(jīng)過煮制后酚類化合物含量和抗氧化能力變化的趨勢鮮見報道，在此過程中，保持高含量或在體內(nèi)具有重要作用的多酚類化合物種類也鮮見報道。本實驗采用定性準確、靈敏度高、重復性好的植物廣泛靶向代謝組學技術(shù)探究小米粥中酚類化合物的組成，并分析差異組分，以期為人們提供簡便且更為合理的小米粥煮制方式，更為進一步探究小米粥中酚類化合物對胃的保護機制提供理論依據(jù)，同時也為開發(fā)功能性食品提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小米（品種為東方亮，產(chǎn)地為山西省，粒徑均勻，顏色金黃，有光澤，無霉爛碎米） 市售；石油醚、丙酮、乙酸乙酯（均為分析純） 天津市大茂化學試劑廠；沒食子酸（標準品）、無水碳酸鈉、Folin-Ciocalteu上海市麥克林生化科技有限公司；總抗氧化試劑盒 南京建成生物工程研究所；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 梯希愛（上海）化學工業(yè)發(fā)展有限公司；甲醇、乙腈 美國Honeywell公司；甲酸 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MJ-10A高速萬能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；Specord 210 plu紫外-可見分光光度計 德國耶拿儀器有限公司；DGG-9070A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海森信試驗儀器有限公司；AR2140電子天平、DSC1型差示掃描量熱儀 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；TD5A-WS臺式離心機 湖南湘儀試驗室儀器開發(fā)有限公司；1290超高效液相色譜儀、6490 Series三重四極桿質(zhì)譜儀 安捷倫科技有限公司；Triple TOF 6600高分辨質(zhì)譜儀 美國AB SCIEX公司；ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（2.1 mmh 100 mm，18 μm） 沃特世科技（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 小米粥最佳煮制工藝優(yōu)化

1.3.1.1 單因素試驗

以小米粥多酚含量為評價指標進行3因素4水平的單因素試驗，料液比1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g/mL），煮制時間15、18、21、24 min，煮制功率500、700、900、1 100 W，以此優(yōu)化小米粥煮制工藝。在選擇不同因素時，其他固定條件分別為料液比1∶20（g/mL）、煮制時間15 min、煮制功率500 W。

1.3.1.2 正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，設(shè)計3因素4水平正交試驗，確定小米粥最佳煮制工藝參數(shù)，因素與水平設(shè)計見表1。

表1 小米粥煮制工藝正交試驗因素與水平Table 1 Code and level of independent variables used for orthogonal array design

1.3.1.3 小米粥淀粉糊化度的測定

取1 粒煮后的小米粥，平鋪于坩堝底部，擦拭坩堝邊緣。蓋上坩堝蓋密封，并采用壓樣器對坩堝進行壓制，保證坩堝不偏且密封良好。于4 ℃冰箱中靜置12 h后放入差示掃描量熱儀中。取5 mg生小米粉（60 目）加入7 μL去離子水，平鋪于坩堝底部，其余操作同上。差示掃描量熱儀測定參數(shù)：氮氣流量為150 mL/min；壓力為0.1 MPa；升溫速率為5 ℃/min；從20 ℃升溫至100 ℃，利用電腦程序記錄差示掃描量熱曲線，并進行對比分析[12]。

1.3.1.4 小米粥品質(zhì)的感官評定

取一定質(zhì)量的小米粥成品，由10 名專業(yè)人員組成評定小組，分別從小米粥的香味、口感、色澤、籽粒體態(tài)、米湯組織形態(tài)5 個方面進行感官評價，10 名評定人員評定結(jié)果的平均值為最終評定結(jié)果，評分標準如表2所示[13]。

表2 小米粥感官評定標準Table 2 Criteria for sensory evaluation of millet porridge

1.3.2 小米粥總多酚的提取

小米粥冷凍干燥后使用粉碎機粉碎后過60 目篩。稱取2 g原料加入25 mL 70%乙醇溶液超聲提取25 min后，4 000 r/min離心10 min。提取2 次后合并上清液，用于測定總多酚含量。

1.3.3 小米和小米粥游離酚的提取

采用Anoma[14]和Irakli[15]等的方法稍作修改。小米粥冷凍干燥后使用萬能粉碎機粉碎。稱取2 g原料加入25 mL 70%丙酮溶液，超聲提取25 min后4 000 r/min離心10 min。提取2 次后合并上清液，冷藏備用。殘渣用于結(jié)合酚的提取。生小米采用同樣的方法提取游離酚作為對照實驗。

1.3.4 生小米和小米粥結(jié)合酚的提取

采用Anoma[14]和Irakli[15]等的方法稍作修改。向上述風干的樣品中加入20 mL 4 mol/L NaOH溶液，避光水解4 h后用濃鹽酸將pH值調(diào)節(jié)至2.0。4 000 r/min離心10 min。加入25 mL正己烷去酯2 次后加入25 mL乙酸乙酯充分混合，提取2 次后合并上層提取液，冷藏備用。小米采用同樣的方法提取結(jié)合酚作為對照實驗。

1.3.5 酚類化合物含量的測定

1.3.5.1 標準曲線的制作

采用Folin-Ciocalteu法[16]。稱取10 mg沒食子酸標準品，蒸餾水定容至100 mL，配成0.1 mg/mL沒食子酸標準溶液。吸取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL沒食子酸標準溶液，加入1 mL Folin-Ciocalteu試劑，混勻后避光靜置2 min。加入2 mL 12% Na2CO3溶液，定容至100 mL。避光靜置2 h后于波長760 nm處測定吸光度，做3 組平行。以沒食子酸含量為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.5.2 樣品酚類化合物測定

1 mL提取液置于100 mL容量瓶中，加入1 mL Folin-Ciocalteu試劑，搖勻后避光靜置2 min。加入2 mL 12%的Na2CO3溶液，蒸餾水定容至刻度。避光靜置2 h后，于波長760 nm處測定吸光度，做3 組平行。利用標準曲線計算質(zhì)量濃度（μg/mL，以沒食子酸計），含量按照式（1）計算[17]：

式中：M為多酚含量/（mg/g）；C為沒食子酸質(zhì)量濃度/（μg/mL）；V為提取液體積/mL；N為稀釋濃度；m為樣品質(zhì)量/g。

1.3.6 小米粥中游離酚和結(jié)合酚抗氧化能力檢測

1.3.6.1 總抗氧化能力檢測

采用總抗氧化能力試劑盒測定。按照說明書進行實驗，重復3 次。于波長520 nm處測定OD值，總抗氧化能力按式（2）計算[17-18]：

式中：T為總抗氧化能力/（U/mL）；OD測量為樣品管中待測樣品光密度；OD對照為對照管中待測樣品光密度；V反為反應(yīng)液總體積/mL；V取為樣品取樣量/mL；A為樣品測試前稀釋倍數(shù)。

1.3.6.2 DPPH自由基清除能力檢測

準確稱取DPPH標準品10 mg，無水乙醇定容至250 mL。樣品管中加入3 mL提取液和3 mL DPPH標準溶液；本底管中加入3 mL提取液、3 mL DPPH標準溶液和3 mL無水乙醇；空白管中加入3 mL DPPH標準溶液和3 mL無水乙醇，做3 組平行。靜置70 min后于510 nm波長處測量吸光度，清除率按式（3）計算[17-18]：

式中：S為DPPH自由基清除率/%；Ai為樣品吸光度；Aj為本底吸光度；A0為空白吸光度。

1.3.7 小米粥中游離酚和結(jié)合酚組分的鑒定

吸取6 mL提取液，氮氣吹干后加入300 μL甲醇溶劑復溶。將混合樣品（QC）和樣品（生小米游離酚、小米粥游離酚、生小米結(jié)合酚、小米粥結(jié)合酚）置于4 ℃、13 000 r/min離心15 min。取上清液于進樣瓶中。通過超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進行檢測分析[19-21]。

儀器分析條件：Agilent液相色譜自動進樣器。色譜柱：HSS T3色譜柱（2.1 mmh 100 mm，1.8 μm）。色譜條件：流動相A為0.1%甲酸、流動相B為100%乙腈；梯度洗脫條件：0 m i n，9 8% A、2% B；0～10 min，98%～40% A、2%～60% B；10～12 min，40%～2% A、60%～98% B；12～13 min，2% A、98% B；13～13.1 min，2%～98% A、98%～2% B；13.1～15 min，98% A、2% B。流速400 μL/min，柱溫25 ℃，進樣量2 μL。質(zhì)譜條件：進樣口溫度650 ℃；離子源溫度650 ℃；檢測范圍m/z5～1 250。

1.4 數(shù)據(jù)分析

煮制工藝、酚類化合物含量及抗氧化水平測定使用Excel 2010進行分析，每組數(shù)據(jù)進行3 個平行實驗，取其平均值并計算相對標準偏差，用SPSS軟件進行方差分析；利用MAPS軟件進行數(shù)據(jù)分析，并對數(shù)據(jù)進行總峰面積歸一化處理；使用MEV4.9.0軟件繪制差異組分層次聚類分析熱力圖；使用R語言進行KEGG Passway富集分析并繪制代謝差異圖；使用SIMCA軟件進行主成分分析（principal component analysis，PCA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 小米粥煮制工藝的優(yōu)化

2.1.1 酚類化合物含量標準曲線

標準曲線回歸方程為y＝0.081 3x+0.005 8，R2＝0.998 4，具有較好的線性關(guān)系。

2.1.2 煮制時間對小米粥總多酚含量影響

如圖1所示，與生小米對比，隨著煮制時間的延長，小米粥總多酚含量逐漸下降，且呈顯著性差異。小米粥各因素間也存在差異性，其中煮制15 min和煮制24 min呈現(xiàn)高度顯著差異。當煮制時間為15 min時小米粥總多酚的含量最高。這是由于多酚類化合物是一種熱不穩(wěn)定性的物質(zhì)，隨著加熱時間的延長，多酚被氧化破壞或降解，導致其含量下降。這與Aguilera等[22]研究結(jié)果相符。

圖1 煮制時間對小米粥總多酚含量的影響Fig.1 Effect of cooking time on total phenolic content of millet porridge

2.1.3 煮制功率對小米粥總多酚含量影響

圖2 煮制功率對小米粥總多酚含量的影響Fig.2 Effect of cooking power on total phenolic content of millet porridge

如圖2所示，與生小米相比，隨著煮制功率的增加，小米粥總多酚的含量逐漸下降，且呈顯著差異。當功率為500 W時小米粥總多酚的含量最高。其中，煮制功率500 W和1 100 W之間呈高度顯著差異。這是由于總多酚類化合物熱穩(wěn)定差，隨著功率的增加，溫度也逐漸升高，導致總多酚含量下降。這與Gujral等[23]的研究結(jié)果相似。

2.1.4 料液比對小米粥總多酚含量影響

圖3 料液比對小米粥總多酚含量的影響Fig.3 Effect of solid-to-liquid ratio on total phenolic content in millet porridge

由圖3所示，與生小米相比，隨著液體用量的增加，小米粥多酚的含量呈先上升后下降的趨勢。當料液比為1∶25時小米粥總多酚的含量最高。可能是由于料液比為1∶25時小米保持良好的含水量，提高了總多酚的提取率。

2.1.5 煮制工藝優(yōu)化正交試驗

表3 煮制工藝正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Orthogonal array design in terms of coded data with response

表4 傳統(tǒng)煮制萃取方差分析Table 4 Analysis of variance for the effect of cooking parameters on total phenolic content in millet porridge

根據(jù)R大小，判斷因素的主次順序為A＜B＜C。由表3可知，最優(yōu)結(jié)果為A1B2C2，即時間15 min、料液比1∶25（g/mL）、功率700 W。由表4可知，B、C對小米粥總多酚含量影響顯著（P＜0.05）。將最優(yōu)組合進行驗證，測得小米粥總多酚含量平均值為1.25 mg/g，與單因素試驗相比其損失率降低了25%。

2.1.6 小米粥淀粉糊化度的測定結(jié)果

如圖4所示，試驗1號的煮制時間最短、煮制功率最低，若在此參數(shù)下小米粥中淀粉完全糊化，則可斷定在其他參數(shù)下煮制的小米粥也完全熟制。淀粉糊化過程代表了淀粉分子從有序到無序狀態(tài)的轉(zhuǎn)變，同時也伴隨著能量的變化，因此采用差示掃描量熱儀對淀粉的糊化特性及糊化程度進行測定。當小米粥中淀粉完全糊化時，在熱分析過程中應(yīng)沒有吸收峰，呈一條平坦的直線[13]。由圖4可知，生小米出現(xiàn)了明顯的吸熱峰，表明其中含有大量的淀粉晶體，并未完全糊化。圖中試驗1號小米粥曲線沒有出現(xiàn)吸收峰，表明小米粥已完全熟制。

圖4 生小米及小米粥的差示掃描量熱曲線Fig.4 DSC curves of raw millet and millet porridge

2.1.7 小米粥品質(zhì)的感官評定

根據(jù)表2制訂的感官評定標準，對表3中16 個試驗組進行感官評價，評價結(jié)果如表5所示。

表5 小米粥感官評定Table 5 Results of sensory evaluation of millet porridge

由表5可知，試驗15組感官評定的結(jié)果最佳，其次為試驗2組和試驗11組。感官評定的結(jié)果表明，當水用量過高時，小米粥的香味呈下降趨勢；當煮制功率過高時，其口感呈下降趨勢；從表5可得出，烹飪小米粥時，煮制功率不易過大，同時煮制時間可以略微延長，也就是常說的“小火慢熬”，在此條件下，小米粥的風味物質(zhì)不僅可以較好的溶出，且米粒的口感軟硬適中。結(jié)合表3中總多酚含量，選取試驗2組為最佳煮制工藝，也將采用試驗2組的煮制工藝參數(shù)進行后續(xù)實驗。

2.2 小米粥游離酚和結(jié)合酚的測定結(jié)果

圖5 小米粥游離酚和結(jié)合酚含量Fig.5 Free and bound phenolic contents of millet porridge

由圖5可知，小米粥中游離酚損失率較高，差異顯著，結(jié)合酚含量變化不顯著。小米粥中游離酚和結(jié)合酚含量分別減少了53%和10%，這是由于游離酚不與大分子物質(zhì)結(jié)合，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，而結(jié)合酚通過碳碳雙鍵、酯鍵或與細胞壁中木聚糖側(cè)鏈上一些糖殘基、結(jié)構(gòu)蛋白、纖維素和果膠等大分子結(jié)合，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易被破壞，所以游離酚損失率高于結(jié)合酚，這與Chandrasekara等[24]的研究結(jié)果一致。食物中的結(jié)合酚在胃和小腸進行消化，再由結(jié)腸中微生物菌群發(fā)酵后釋放，所以結(jié)合酚在體內(nèi)發(fā)揮著重要的作用[25]。小米粥中結(jié)合酚含量下降不顯著，說明小米經(jīng)過煮制后結(jié)合酚在體內(nèi)仍起到不可或缺的作用。

2.3 小米粥中游離酚和結(jié)合酚抗氧化能力

由表6所示，小米粥游離酚和結(jié)合酚DPPH自由基清除率分別為75.41%和56.54%，總抗氧化能力分別為14.72 U/mL和9.58 U/mL。與生小米游離酚相比，小米粥游離酚DPPH自由基清除率下降了2.2%，總抗氧化能力下降了1.91 U/mL。與生小米結(jié)合酚相比，小米粥結(jié)合酚DPPH自由基清除率下降了9.69%，總抗氧化能力下降了3.06 U/mL。Devi等[5]報道表明，小米DPPH自由基清除率大約為70%，與本實驗得到的結(jié)果吻合。本實驗使用的東方亮小米其結(jié)合酚的抗氧化能力低于游離酚的抗氧化能力。Kumari等[26]的研究表明，不同品種的小米，其游離酚和結(jié)合酚的抗氧化能力存在差異，例如：印度finger小米結(jié)合酚的抗氧化能力低于游離酚。Devi等[5]報道同樣證明結(jié)合酚的抗氧化能力低于游離酚，與本實驗的結(jié)果相同。小米粥中游離酚抗氧化能力變化不顯著的原因可能是熱處理引發(fā)的美拉德反應(yīng)會導致新的物質(zhì)形成，具有還原性和釋放結(jié)合酚的能力，這也是小米粥結(jié)合酚抗氧化能力下降的原因。程安瑋等[27]研究了豇豆、紅小豆、綠豆和蠶豆4 種豆類中酚類化合物的抗氧化能力，小米和小米粥中多酚類化合物的抗氧化能力均高于這4 種豆類。盡管煮制后小米粥中多酚類化合物含量下降，但其抗氧化能力仍維持較高的水平，說明多酚類化合物在體內(nèi)發(fā)揮著不可或缺的作用。

表6 小米粥中游離酚和結(jié)合酚抗氧化能力Table 6 Free and bound phenolic contents and antioxidant capacities in millet porridge

2.4 PCA結(jié)果

圖6 生小米與小米粥PCA得分散點圖Fig.6 PCA score scatter plot of raw millet and millet porridge

由圖6可知，QC樣本重合度較高，說明實驗方法穩(wěn)定性強、數(shù)據(jù)質(zhì)量高。置信區(qū)間的右上角為小米多酚樣本，左下角為小米粥多酚樣本，說明小米經(jīng)過煮制后樣本之間存在顯著差異。

2.5 小米粥中游離酚和結(jié)合酚組分鑒定

本實驗定性出37 種多酚類化合物，包含24 種黃酮類化合物，其中7 種為異黃酮類化合物以及3 種為2-芳基苯并呋喃類黃酮類化合物；13 種酚酸類化合物，其中4 種為肉桂酸及其衍生物，具體信息見表7，這與Shahidi等[4]測定小米中酚類化合物的組成結(jié)果相似，但本實驗更系統(tǒng)地定性出生小米及小米粥的組成成分。鼠曲草黃素、表兒茶素、光甘草素、peonidin 3-O-glucoside、金圣草黃素、芥子醇、香草酸、咖啡酸、丁香酸、間香豆酸、3,4,5-trimeth-oxycinnamic acid、芥子酸、大豆苷元、黃豆黃素、金雀異黃素、異黃樟素、胡椒醛、delphinidin-3-rutinoside和錦葵色素苷的含量均呈顯著性差異。

續(xù)表7

表兒茶素、香蘭素、綠原酸、香草酸、芥子酸和芥子醇等酚類化合物相對含量較高，這與Hithamani等[28]的研究結(jié)果吻合。表兒茶素、綠原酸、芥子酸和香草酸為小米中主要的游離酚；而咖啡酸、間香豆酸為小米中主要的結(jié)合酚，Shahidi等[4]的研究得到同樣的結(jié)果。香葉木苷、表兒茶素、川陳皮素等游離酚相對含量呈下降趨勢[29]，其原因可能是在煮制過程中部分游離酚被氧化，其次熱處理后酚類物質(zhì)因降解等原因可能會進入胚乳，與蛋白質(zhì)等大分子形成復合物，從而使游離酚含量下降。有研究表明[30]，表兒茶素可修復由幽門螺旋桿菌誘導的胃黏膜損傷。綠原酸、麥黃酮、間香豆酸等游離酚的相對含量呈上升趨勢[31-32]。其原因可能是熱處理破壞了結(jié)合酚的結(jié)構(gòu)，促使結(jié)合酚轉(zhuǎn)變成游離酚，提高了游離酚的含量，研究表明[33]，綠原酸可以阻鎘，阻止胃腸病變，從而保護腸道。葒草素、蘆丁、香蘭素等結(jié)合酚含量下降，出現(xiàn)這種趨勢的原因可能是由于熱處理破壞了包裹結(jié)合酚的酯鍵、碳碳雙鍵等化學結(jié)構(gòu)，或促使細胞壁組成中部分果膠或蛋白被溶解，從而釋放食物基質(zhì)中結(jié)合酚并促使其溶出，導致結(jié)合酚含量減少。研究表明[34]，蘆丁對胃和十二指腸潰瘍的小鼠具有細胞保護和胃保護作用，蘆丁還對乙醇相關(guān)的胃黏膜潰瘍的修復起到重要作用。表兒茶素、芥子醇、咖啡酸、丁香酸、大豆苷元等結(jié)合酚的相對含量呈上升趨勢，表明適當熱處理會產(chǎn)生美拉德反應(yīng)，可能會生成新的物質(zhì)；其次，適當?shù)臒崽幚泶偈菇Y(jié)合酚的半溶出，提高提取效率[35]?？Х人釋ξ改c炎病毒具有抑制作用，許多益胃、養(yǎng)胃的膠囊或沖劑中均含有咖啡酸。異黃樟素、金圣草黃素、大豆苷元、錦葵色素苷、香蘭素、咖啡酸、香草酸等酚類化合物中游離酚和結(jié)合酚均呈上升趨勢，其原因可能是煮制后部分可溶性結(jié)合酚游離出來，且適當?shù)闹笾坪徒菘梢蕴岣叨喾拥奶崛⌒?，致使其含量增加。川陳皮素、licoagrodin、環(huán)桑皮黃素等酚類化合物差異不顯著，表明其熱穩(wěn)定性強于其他酚類化合物，其原因可能是此類化合物中含有苯環(huán)以及碳碳雙鍵等穩(wěn)定的化學結(jié)構(gòu)。其次，苯酚上的羥基與多糖上的氧原子間會形成氫鍵，這種相互作用可以形成葡聚糖凝膠，提高多酚類化合物的穩(wěn)定性。綜上所述，煮制后部分多酚類化合物的含量呈現(xiàn)出顯著差異，并且許多酚類化合物都具有養(yǎng)胃的功效。

圖7 生小米與小米粥差異組分層次聚類分析熱力圖Fig.7 Hierarchical clustering analysis heat map of differential phenolic components between raw millet and millet porridge

圖7為生小米與小米粥差異組分層次聚類分析熱力圖。將差異組分的相對含量進行聚類，高低表達交互在一起，紅色為高表達組分，綠色為低表達組分。表兒茶素、間香豆酸、辛弗林、咖啡酸、丁香酸等酚類化合物為高表達；yuccaol C、芹菜苷、芒柄花素和(-)-glycinol等為低表達；根據(jù)顏色變化差異得出綠原酸、紫菀苷、丁香酸、芥子酸、香木葉苷、蘆丁、peonidin 3-O-glucoside、大豆苷元、黃豆黃素、金雀異黃素和鼠曲草黃素等物質(zhì)存在極顯著差異；香蘭素、表兒茶素、香草酸、咖啡酸、間香豆酸等差異顯著，這與表5結(jié)果相似。通過顏色深淺差異可知，游離酚變化差異大于結(jié)合酚，這表明小米經(jīng)過煮制后游離酚含量變化顯著，與圖5結(jié)果相似。其中變化最顯著的游離酚為蘆丁、香木葉苷、peonidin 3-O-glucoside、鼠曲草黃素和錦葵色等。

圖8 小米粥差異組分代謝通路影響因子圖Fig.8 Rich factors of metabolic pathways of differential phenolic components between raw millet and millet porridge

由圖5及表7可以得出，煮制后小米籽粒中部分酚類化合物含量呈下降趨勢。有研究表明[36]，小米貯藏過程中若存在溫度過高的現(xiàn)象，其籽粒中多酚類化合物的含量會相應(yīng)減少。酚類化合物性質(zhì)不是很穩(wěn)定，當環(huán)境溫度升高時，酚類化合物極易分解，所以本實驗針對小米在生熟2 種狀態(tài)下的差異組分進行KEGG富集分析，分析高溫環(huán)境對小米中酚類化合物代謝通路的影響，以便為小米貯藏環(huán)境的選擇提供參考。代謝通路富集分析結(jié)果以氣泡圖的形式展現(xiàn)，見圖8。圖中每個氣泡代表一條代謝通路，共有10 個氣泡，即在KEGG中查詢到了10 個代謝通路，既有合成途徑也有降解途徑，分別為苯丙素的生物合成、異黃酮生物合成、苯丙烷類生物合成、氨基苯甲酸鹽降解、次生代謝物的生物合成、黃酮和黃酮醇的生物合成、類黃酮生物合成、芳香化合物的降解、不同環(huán)境中的微生物代謝途徑及新陳代謝途徑。氣泡所在橫坐標和氣泡大小表示該通路在拓撲分析中的影響因子大小，縱坐標和氣泡顏色表示富集分析的P值（取負常用對數(shù)，即-lgP），顏色越深P值越小，富集程度越顯著。其中苯丙素的生物合成途徑、異黃酮生物合成途徑、苯丙烷類生物合成途徑氣泡顏色較深，說明這些代謝途徑受溫度變化影響較大。

表8 差異組分參與的代謝途徑Table 8 Metabolic pathways in which differential phenolic components are involved

由表8可知，涉及到這10 條代謝通路的差異組分有表兒茶素（C09727）、芥子醇（C02325）、咖啡酸（C01481）、大豆苷元（C10208）、金雀異黃素（C06563）、芥子酸（C00482）、香草酸（C06672）和金圣草黃素（C04293）。本實驗通過KEGG富集差異組分得到的10 條代謝通路，其中部分代謝通路與高溫環(huán)境下酚類化合物含量下降有關(guān)。因此在小米未經(jīng)過加工處理前，使其保持良好的環(huán)境溫度（尤其是夏季），以延緩酚類物質(zhì)的代謝，盡可能將酚類化合物的含量維持在最高水平，同時保持功能因子的保健功效。

3 結(jié) 論

本實驗通過單因素試驗和正交試驗得到小米粥最優(yōu)煮制參數(shù)為煮制時間15 min、煮制功率700 W、料液比1∶25（g/mL）。煮制后小米粥游離酚DPPH自由基清除率下降了2.2%，總抗氧化能力下降了1.91 U/mL；小米粥結(jié)合酚DPPH自由基清除率下降了9.69%，總抗氧化能力下降了3.06 U/mL。通過Folin-Ciocalteu法測定游離酚和結(jié)合酚含量，結(jié)果表明游離酚比結(jié)合酚對煮制更加敏感，說明結(jié)合酚在體內(nèi)可能起到更為關(guān)鍵的作用。通過植物廣泛靶向代謝組學方法，定性分析出37 種多酚類化合物，其中鼠曲草黃素、表兒茶素、光甘草素、金圣草黃素等19 種酚類化合物均呈顯著性差異。通過KEGG富集分析得到了10 個代謝通路。在定性檢測出的37 種物質(zhì)中，表兒茶素、蘆丁、香蘭素、咖啡酸、大豆苷元等研究較為廣泛，但辛弗林、間香豆酸、環(huán)桑皮黃素、刺芒柄花素、鼠曲草黃素、葒草素等物質(zhì)鮮有研究，甚至鮮少有人深入了解其結(jié)構(gòu)及功能特性。但是，多酚類化合物作為小米粥中重要的保護腸胃功能因子，其研究價值不應(yīng)被忽略。后續(xù)研究可對多酚類化合物進行分離純化，對每一種多酚類化合物進行體內(nèi)和體外功能特性的研究，例如：細胞抗氧化活性、修復被損傷的胃上皮細胞及動物實驗等。從酚類化合物的角度闡明小米粥保護腸胃功能機制，篩選出高效、無毒害作用的功能因子，為功能性食品的開發(fā)提供理論依據(jù)。