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        亞?;撬釋δ厦腊讓ξr多酚氧化酶活性及酶構象的影響

        2021-03-01 01:43:36周雅琪黃佳茵陳美玉葛雨珺胡亞芹
        食品科學 2021年4期
        關鍵詞:白對蝦水性波長

        周雅琪,黃佳茵,陳美玉,葛雨珺,李 苑,胡亞芹,*

        (1.浙江大學生物系統(tǒng)工程與食品科學學院,馥莉食品研究院,智能食品加工技術與裝備國家(地方)聯(lián)合實驗室,農業(yè)農村部農產品產后處理重點實驗室,農業(yè)農村部農產品營養(yǎng)功能評價實驗室,浙江省農產品加工技術研究重點實驗室,浙江 杭州 310058;2.浙江大學寧波研究院,浙江 杭州 315100)

        南美白對蝦(Penaeus vannamei)是占全球水產養(yǎng)殖蝦產量80%的重要商品蝦[1],黑變會嚴重影響其感官品質和貨架期。蝦體內酶促褐變的關鍵酶多酚氧化酶(polyphenoloxidase,PPO)會催化無色酚形成有色醌,再通過非酶促褐變形成不溶性黑色素[2]。傳統(tǒng)抑制對蝦黑變的方法主要是采用低溫和化學保鮮劑,最常用的化學保鮮劑就是亞硫酸鹽。亞硫酸鹽是無機鹽,易分解產生二氧化硫殘留在食品中,容易導致食用者發(fā)生過敏以及哮喘反應,在美國和歐盟國家已被禁止使用[3]。因此,研究亞硫酸鹽替代品,尋求天然、安全、高效的防對蝦黑變抑制劑對于保障食品安全、提高對蝦的商業(yè)效益具有重要意義。目前一些化學和天然的食品保鮮劑已經被研究作為對蝦的抗黑變劑,化學合成的如4-己基間苯二酚、阿魏酸、固載二氧化氯,以及石榴提取物、腰果提取物、葡萄籽提取物等天然獲得的物質,均可通過抑制PPO活性減緩對蝦的黑變[4]。

        由于酶的功能與其結構密切相關,因此近年來除研究黑變抑制劑對酶活性的抑制作用,其對酶蛋白高級結構的影響也被深入探究。如Xiong Shangling等[5]通過抑制動力學與分子動力學研究了鄰苯三酚對酪氨酸酶活性和結構的抑制作用,Zhou Lei等[6]研究了超聲波與蘋果酸的協(xié)同作用對蘑菇PPO活性和構象的影響,Hridya等[7]研究了花青素3-槐糖苷對PPO的抑制機理及其對蘋果酶促褐變的影響,劉琦琦[8]研究了香豆素類物質對PPO的抑制機理及酶構象的影響,這些研究都有助于在分子水平上進一步研究PPO,從而為有效抑制酶活提供思路。

        亞牛磺酸(hypotaurine,HTU)作為一種生物保鮮劑而受到關注。它是生物體內廣泛存在的一種天然產物,可以從貽貝、牡蠣、文蛤、章魚、魷魚等海洋生物中提取獲得,也是人體內半胱氨酸代謝為牛磺酸的中間體。Schulbach等[9]通過對藍貽貝中發(fā)現(xiàn)的酶促褐變的抑制劑進行液相色譜和質譜鑒定,率先發(fā)現(xiàn)了HTU的抗黑變效果。Zhang Ying等[10]研究了HTU對桃保鮮效果的影響,發(fā)現(xiàn)HTU可以延緩貯藏期間桃果實的成熟。由于HTU具有PPO的抑制活性,目前在果蔬防黑保鮮領域中已經被使用,如HTU能明顯抑制桃[11]、山藥[12]等的褐變,顯示出了良好的護色保鮮效果。HTU在水產品中廣泛存在,且其在人體內終產物為?;撬?,具有方便獲得和無毒無害的優(yōu)點,之前研究也表明其對果蔬的抗酶促褐變具有很好的效果,但在水產領域特別是對南美白對蝦PPO活性的抑制及酶結構的影響鮮見報道,對其抗黑變效果和機制也尚不明確。本研究旨在對南美白對蝦PPO進行分離純化,研究HTU對其活性和結構的影響,為從分子水平上進一步研究南美白對蝦PPO抑制劑的安全高效使用提供參考依據(jù),同時也為將HTU應用于南美白對蝦的保鮮提供理論支撐。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        新鮮的南美白對蝦購于浙江杭州駱家莊農貿市場,其養(yǎng)殖產地為浙江舟山,挑選無病害,有活力質量大小為(12f 1)g左右的對蝦,經保氧運回實驗室并在冰中猝死后放于-80 ℃冰箱備用;HTU 美國Sigma公司。

        十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)變性丙烯酰胺凝膠快速制備試劑盒、5×蛋白質加樣緩沖液、Real Band蛋白預染Marker、高靈敏快速考馬斯亮藍染色試劑盒、8-苯胺-1-萘磺酸(8-(phenylamino)naphthalene-1-sulfonic acid,ANS) 生工生物工程(上海)股份有限公司;左旋多巴(levodopa,L-DOPA)、SDS、十二烷基聚乙二醇醚(Brij35)、甘氨酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等均為分析純。

        1.2 儀器與設備

        UV-2550紫外分光光度計 日本島津公司;EPS300電泳儀 上海天能科技有限公司;J-1500型高性能圓二色光譜儀 佰泰科技有限公司;Cary Eclipse熒光分光光度計 賽默飛世爾科技有限公司;TGL20M型低溫冷凍離心機 湖南凱達科學儀器有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 PPO的粗提取和活性測定

        根據(jù)Simpson等[13]的方法,并略作修改。采用Lowry等[14]的方法測定粗酶的蛋白濃度。

        1.3.2 HTU對PPO處理前后最大吸收波長的測定

        在離心管中加入0.4 mL的粗酶液,1.0 mL濃度為15 mmol/L的L-DOPA以及1.6 mL 0.05 mol/L pH 6.5的磷酸鹽緩沖液。37 ℃水浴反應3 min,用紫外分光光度計在300~700 nm波長范圍內每隔2 min進行掃描直至10 min,確定產物的最大吸收波長。再按上述方法,測定經質量濃度分別為1、5、10、15、20 g/L的HTU溶液處理后酶液的波長,檢測其產物吸收峰。

        1.3.3 HTU對PPO活性抑制率的測定

        將100 μL不同質量濃度的HTU溶液與100 μL PPO粗提取物混合,在室溫下反應30 min。將400 μL 0.05 mol/L pH 6.0的磷酸鹽緩沖液、100 μL去離子水以及600 μL 15 mmol/LL-DOPA的溶液加入引發(fā)反應,在37 ℃反應3 min后通過紫外分光光度計記錄475 nm波長處的吸光度的變化。酶活性定義:每毫升酶液每分鐘在475 nm波長下吸光度增加0.001為1 U。通過從反應混合物中分別排除底物和酶制備酶和底物空白,并使用去離子水代替。用去離子水代替HTU作為對照,以相同的方式進行。PPO抑制活性用抑制率表示,計算公式如下:

        式中:A為對照的PPO活性;B為加入HTU后的PPO活性。

        1.3.4 HTU對PPO的抑制機理

        配制不同質量濃度的HTU溶液,在0.05 mol/L pH 6.5的磷酸鹽緩沖液中固定加入0.1 mL HTU,再加入不同量的酶液,混合30 min后,加入1.0 mL 15 mmol/LL-DOPA,每隔30 s記錄一次475 nm波長處吸光度,共測定5 min,計算酶促反應速率代表酶活性。以HTU作用后的酶活性對酶濃度作圖,測定不同HTU質量濃度下,酶濃度增加時酶促反應速率的變化。

        1.3.5 HTU對PPO的抑制類型與抑制常數(shù)的測定

        配制不同質量濃度的HTU溶液,在離心管中加入1.6 mL 0.05 mol/L pH 6.5的磷酸鹽緩沖液與0.3 mL酶液,以及0.1 mL不同質量濃度的HTU,混合30 min后加入1.0 mL不同濃度(2、4、6、8、10 mmol/L)的L-DOPA,計算酶促反應速率。通過以L-DOPA濃度的倒數(shù)為橫軸,酶促反應速率的倒數(shù)為縱軸,進行Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖,判斷HTU的抑制類型。

        1.3.6 SDS-PAGE測定

        按照Laemmli[15]方法對南美白對蝦中PPO粗提物進行SDS-PAGE測定。將提取物與不同質量濃度的HTU溶液反應30 min后,與5×蛋白質加樣緩沖液以1∶1的體積比混合。制備6%分離膠和5%濃縮膠,樣品和Marker的加樣量分別為20 μL和5 μL。采用恒壓電源先80 V跑0.5 h,再120 V進行約1.5 h。電泳結束后,將凝膠浸泡在考馬斯亮藍R-250中染色,用25%甲醇和10%乙酸溶液進行脫色。選擇Real Band蛋白Marker估計蛋白的表觀分子質量。

        1.3.7 圓二色譜的測定

        參考Yi Jianyong等[16]的方法并作修改,取200 μL PPO樣品及與不同質量濃度的HTU溶液反應后的PPO置于樣品池后立即掃描,掃描波長為280~190 nm,掃描速度為50 nm/min,帶寬1 nm,在室溫下重復掃描3 次,取平均值。圓二色譜數(shù)據(jù)用平均橢圓率表示,單位為(mdegg cm2)/dmol。PPO質量濃度為0.2 mg/mL,采用Dichroweb網(wǎng)站的SELCON 3算法計算PPO二級結構的含量。

        1.3.8 表面疏水性的測定

        參考Kobayashi等[17]方法并略作修改,取不同質量濃度HTU溶液處理過的PPO樣品4 mL,加入8 mmol/L的ANS溶液20 μL,置于4 ℃黑暗處15 min。在激發(fā)波長374 nm、發(fā)射波長范圍420~600 nm、縫寬5 nm處測定熒光強度。以熒光強度和蛋白濃度作圖,曲線的初始斜率表示為表面疏水性指數(shù)。

        1.3.9 熒光光度的測定

        將不同質量濃度HTU溶液處理過的PPO樣品放入熒光比色皿中,樣品的蛋白質質量濃度為0.3 mg/mL,儀器激發(fā)波長為280 nm,掃描范圍為300~400 nm,激發(fā)和發(fā)射縫均為5 nm,掃描速率為1 200 nm/min。

        1.4 統(tǒng)計分析

        實驗均進行3 次平行后取平均值,并計算標準偏差。對于所有參數(shù),通過方差分析(ANOVA)確定差異顯著性,P<0.05,差異顯著。使用Duncan的多范圍測試測定平均值的差異。數(shù)據(jù)之間的相關性由Pearson相關系數(shù)進行判斷。該分析由SPSS 21版軟件執(zhí)行。

        2 結果與分析

        2.1 南美白對蝦PPO的純化結果

        通過對南美白對蝦的頭胸部進行研磨、均質、離心、鹽析和透析得到對蝦PPO粗酶液。王凌燕[18]研究了不同飽和度的鹽析方法下PPO的純化結果,發(fā)現(xiàn)用40%~75%飽和度的(NH4)2SO4進行蛋白鹽析沉淀是較好的PPO提純方法,因此本實驗采用40%的(NH4)2SO4進行純化,通過對粗酶液進行酶活性和蛋白濃度測定,得到酶活性為182.25 U/mL、蛋白質量濃度為5.306 mg/mL、比活力為34.45 U/mg的PPO粗酶液用于后續(xù)酶活性實驗的測定。其中磷酸鹽提取液中含有的Brij-35是一種可以提取膜蛋白的非離子表面活性劑,PPO作為一種含銅離子的膜蛋白酶,使用Brij-35可以提高得率[19]。

        2.2 HTU對PPO活性抑制作用分析

        圖1 HTU對PPO的抑制動力學分析Fig.1 Kinetics of inhibition of PPO by HTU

        通過紫外分光光度計研究HTU對PPO活性的影響,圖1A是未加抑制劑時,不同時間下PPO與酶底物L-DOPA反應的紫外光譜圖,由于PPO會催化L-DOPA形成多巴醌,進而聚合形成黑色物質,所以醌類物質在可見光區(qū)有一定的吸收,可以發(fā)現(xiàn)在495 nm波長處形成了一個特征峰,因此推測這可能是酶促反應過程中形成的醌類物質,且反應時間越長,形成的醌類物質越多。圖1B、C分別是加入了HTU抑制劑后的光譜圖和光度圖,隨著抑制劑的加入,延緩了495 nm波長處特征峰的上升,且質量濃度越大上升的越慢。圖1D是HTU對PPO的活性抑制率,隨著HTU質量濃度的增加,PPO活性的抑制率在前期呈現(xiàn)較慢的上升趨勢,當質量濃度在10~20 g/L時上升較快,其抑制率最高達到79.38%,其最大半數(shù)抑制濃度(half-maximal inhibitory concentration,IC50)值為16.09 g/L。

        綜上所述,HTU可以抑制PPO活性,且質量濃度越高其抑制能力越強,推測其原因一可能是HTU與醌類物質反應形成了硫-醌復合物,阻礙了酶促反應的進行,另一種推測是HTU作為一種強還原劑,將形成的醌類物質還原成酚,研究同時表明硫原子在抑制PPO活性中起到了極其重要的作用[20]。因此HTU對PPO活性的抑制能力很可能是減緩冷藏期間南美白對蝦中由PPO引起黑變現(xiàn)象的主要原因。

        2.3 HTU對PPO的抑制作用

        圖2 在不同質量濃度HTU下PPO活性和酶量的關系Fig.2 Relationship between PPO activity and its concentration in the presence of different concentrations of HTU

        如圖2所示,HTU質量濃度越大,直線的斜率越小,表明其酶促反應速率下降,且每條直線都穿過原點,推測HTU可能并未與PPO形成共價鍵,而是存在非共價的分子間相互作用。HTU與PPO的可逆結合抑制了其活性,酶量沒有減少,但酶活性下降。該結果表明HTU可能是PPO的可逆抑制劑,且此現(xiàn)象與用芹菜素[21]、槲皮素[22]對酪氨酸酶的抑制趨勢一致。

        用Lineweaver-Burk圖確定HTU對PPO活性的抑制類型,如圖3所示,觀察到垂直軸截距(1/Vmax)和水平軸截距(-1/Km)的變化,5 條直線相交于Y軸上的一點,計算最大反應速率(Vmax)和米氏常數(shù)(Km),可以發(fā)現(xiàn)Vmax不變(2 mmol/(Lg min)),Km隨著HTU質量濃度的增大而增大,因此推測HTU是一種競爭性抑制劑。HTU對酶活性的影響可能是通過與酶進行結合,而不與酶-底物的絡合物結合,根據(jù)HTU質量濃度與米氏方程斜率的二次作圖,可得到HTU對PPO的抑制常數(shù)KI為0.445 mmol/L。研究表明曲酸、肉桂酸、含羞草素等都是PPO的競爭性抑制劑,可以和底物競爭酶的結合位點,阻止底物和酶的結合,從而抑制酶促反應的進行,若是增加底物的濃度,則可以增大與酶活性位點結合的概率,從而緩解抑制劑對酶的抑制作用[23]。

        圖3 HTU對PPO抑制作用的Lineweaver-Burk曲線(A)和米氏常數(shù)(B)Fig.3 Lineweaver-Burk curve (A) and inhibition constant (B) of HTU against PPO

        2.4 SDS-PAGE分析

        圖4 SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis

        如圖4所示,通過對凝膠進行考馬斯亮藍染色,發(fā)現(xiàn)在凝膠上出現(xiàn)了PPO的單一蛋白條帶,通過遷移率對比,其分子質量約為200 kDa,和Manheem等[24]測定的表觀分子質量一致。據(jù)報道來自不同蝦的PPO具有不同的異構體,分子質量也會有所不同,例如深水粉紅蝦的PPO分子質量為500 kDa和200 kDa,而白蝦的分子質量為20 kDa和25 kDa[25]。圖中經過不同質量濃度HTU處理后PPO的條帶數(shù)目與位置并未發(fā)生明顯變化,推測HTU可能不是通過破壞PPO蛋白分子質量和電泳特性而影響酶活力,該結果與4-羥基香豆素處理PPO時的電泳結果一致[8]。

        2.5 圓二色譜結果分析

        表1 不同質量濃度HTU處理后對PPO二級結構比例的影響Table 1 Influence of different concentrations of HTU on secondary structure contents of PPO

        酶結構的輕微變化都可能導致其功能和性質發(fā)生改變,本實驗采用圓二色譜檢測蛋白質二級結構的變化。如表1所示,利用Dichroweb網(wǎng)站計算了樣品中各結構比例,PPO的二級結構主要由25.41%的α-螺旋和41.92%的無規(guī)卷曲組成。隨著HTU質量濃度的增大,PPO的α-螺旋和β-折疊比例出現(xiàn)下降,而β-轉角與無規(guī)卷曲的比例上升。有研究表明α-螺旋是通過肽鏈的羰基氧和氨基氫之間的分子內氫鍵維持蛋白結構的穩(wěn)定[26],而α-螺旋比例的下降說明其結構發(fā)生了變化。推測可能是HTU的加入,誘導了PPO蛋白的展開,使得α-螺旋的氫鍵遭到破壞,并促使α-螺旋和β-折疊向β-轉角和無規(guī)卷曲進行轉變,導致疏水基團的暴露,使得酶的催化活性降低,且HTU的質量濃度越高,蛋白的結構破壞的越明顯。Anantharaman等[27]研究了類胡蘿卜素對酪氨酸酶構象的影響,也發(fā)現(xiàn)酶的α-螺旋比例降低導致疏水性增強引起酶活性變化。呂艷芳等[28]在研究曲酸對南美白對蝦PPO構象的影響的實驗中也得到了相似的結論。因此推測HTU的加入,可能導致PPO的二級結構發(fā)生了改變,從而引起了酶活性的降低。

        2.6 表面疏水性分析

        蛋白質的表面疏水性是表征蛋白構象變化的重要指標,它能夠反映蛋白質表面疏水性氨基酸殘基的分布情況,而PPO作為一種酶蛋白,其表面疏水性的變化可能會引起蛋白結構的變化,進而導致酶活性發(fā)生改變。如圖5所示,相比對照組的PPO,添加HTU能夠顯著增加PPO的表面疏水性(P<0.05)。隨著HTU質量濃度的增大,蛋白的表面疏水性在前期呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢,當HTU質量濃度為15 g/L時,其上升程度有所減緩。天然酶蛋白的疏水性殘基一般集中在螺旋的核心,因此PPO表面疏水性的增加表明HTU的處理導致了PPO蛋白結構的展開,使得疏水性氨基酸暴露于蛋白的表面,酶分子之間聚集的程度下降,從而影響PPO的活性。而后續(xù)表面疏水性的上升程度減緩可能是由于更多的酶分子的疏水性基團暴露,酶分子之間由于疏水相互作用而發(fā)生聚集,從而導致了疏水性的上升減慢。Jia Na等[29]在研究蘆丁對蛋白的疏水性影響中也得出了類似的結論,同時這也與上述圓二色譜的結果相一致。綜上所述,HTU的加入能夠提高PPO的表面疏水性,這可能影響PPO的二級或三級結構,從而影響酶活性。

        圖5 HTU對PPO表面疏水性的影響Fig.5 Effect of HTU on surface hydrophobicity of PPO

        2.7 內源熒光光譜分析

        當激發(fā)波長為280 nm時,蛋白質中的色氨酸、酪氨酸殘基能夠發(fā)射熒光,因此對于蛋白質周圍微環(huán)境的變化非常敏感,當其他分子與蛋白質相互作用時,蛋白質的這些氨基酸殘基的內源熒光強度也會受到影響,從而可以通過熒光強度的變化監(jiān)測蛋白質構象的變化[30]。

        圖6 HTU對PPO內源熒光光譜的影響Fig.6 Effect of HTU on endogenous fluorescence spectrum of PPO

        如圖6所示,未加入HTU時,PPO具有較大的熒光強度和較短的最大熒光發(fā)射波長(λmax),說明色氨酸等氨基酸殘基位于蛋白質的核心,酶蛋白處于折疊狀態(tài)。HTU的添加以質量濃度依賴的方式降低了PPO內源熒光強度,當HTU質量濃度為20 g/L時,PPO的內源熒光強度比原酶降低了29.85%。同時隨著HTU質量濃度的增加,PPO的λmax顯示出了348.2~349.7 nm輕微紅移。這表明HTU與PPO相互作用后,蛋白質發(fā)生解折疊,導致色氨酸等疏水性氨基酸殘基位于蛋白質的表面,暴露于親水環(huán)境中,使得氨基酸殘基周圍環(huán)境的極性增強,因此HTU的加入降低了PPO的熒光強度并使λmax發(fā)生紅移[16]。Liu Wei等[31]研究表明檸檬酸會導致蘑菇酪氨酸酶發(fā)生熒光猝滅,最大熒光發(fā)射波長從341 nm紅移到344 nm。方志超等[32]對乳酸處理后的蘑菇酪氨酸酶構象進行了研究,發(fā)現(xiàn)酶的最大峰值從346 nm移動到353 nm。這些結論與HTU處理后PPO內源熒光強度的改變類似,同時上述蛋白表面疏水性的增加也能證明PPO發(fā)生了解折疊,導致了疏水性基團的暴露。因此可以推測HTU可能誘導PPO分子構象發(fā)生部分去折疊,猝滅了其固有熒光,導致酶的最大發(fā)射波長發(fā)生紅移,從而使得酶的三級結構發(fā)生了變化,同時酶活性也隨之下降,表明酶構象的變化可能影響了酶活性,兩者之間存在一定的相關性。

        3 結 論

        對南美白對蝦進行分離純化,獲得了比活力為34.45 U/mg(182.25 U/mL)的PPO粗提液。研究表明HTU質量濃度與PPO抑制活性呈正相關,說明HTU是PPO活性的有效抑制劑,當HTU質量濃度為20 g/L時,其抑制率最高達到79.38%,IC50值為16.09 g/L。HTU對PPO活性的抑制屬于競爭性抑制,其抑制常數(shù)KI為0.445 mmol/L。隨著HTU的加入,PPO分子質量沒有發(fā)生顯著變化,圓二色譜結果表明酶的α-螺旋與β-折疊含量降低,而β-轉角和無規(guī)卷曲的含量略有增多,表明酶蛋白分子展開,導致了疏水性氨基酸殘基的暴露。表面疏水性的結果也證實了PPO的疏水性隨著HTU質量濃度的增加而增強。內源熒光光譜的結果說明HTU會導致酶發(fā)生熒光猝滅,最大發(fā)射波長發(fā)生紅移。這些結果均說明HTU與PPO結合后,可能通過影響酶空間結果導致酶活性發(fā)生變化。

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