李明哲,須燕玲,張英杰,鄭飛 ,汪文靜,徐鳴曙,單春雷

(1.上海中醫(yī)藥大學,上海 201203;2.上海市針灸經(jīng)絡研究所,上海 200030;3.上海市寶山區(qū)仁和醫(yī)院,上海200431)

缺血性卒中,中醫(yī)學稱之為卒中,系由各種原因所致的局部腦組織區(qū)域血液供應障礙,導致腦組織缺血缺氧性病變壞死,進而產(chǎn)生臨床上對應的神經(jīng)功能缺失。在中國,卒中已超過惡性腫瘤居致死病因首位[1],卒中疾病負擔比過去30年增加,負擔最大的地區(qū)是在北部和中部地區(qū)[2]。缺血性卒中可引發(fā)多種復雜的病理變化,其治療一是抵抗腦細胞缺血損傷;二是保護腦細胞,促進修復再生,如促進神經(jīng)、血管的保護與再生[3]。隨著醫(yī)療的進步、治療水平的提高,卒中的致死率降低,但其后遺癥的患者群體顯著增長,急需尋求簡、便、廉、效的治療手段。

目前,電針無法廣泛應用于卒中患者的早期康復中,本課題組多年來一直關注卒中康復,采用動物實驗研究針刺中晚期干預MCAO大鼠,有一定的療效[4-5]。故本文用電針干預早期MCAO大鼠,以觀測其步態(tài)行為的變化,以期為今后的臨床研究提供一定的依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

8周齡健康清潔級 SD大鼠 24只,雄性,體質量180～220 g,由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供,飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結合醫(yī)院動物房,許可證號為SYXK(滬)2013-0109。飼養(yǎng)環(huán)境為晝夜12 h交替,室內溫度25℃,濕度50%～60%,自由攝取食物和水。實驗過程對大鼠的各種干預手段均按照科技部2006年頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》。適應性飼養(yǎng) 3 d后,將大鼠按體質量采用SPSS24.0的隨機法進行隨機分組,分為假手術組、模型組和電針組,每組 8只。同時將大鼠進食量控制為80%,并開始大鼠步態(tài)訓練。

1.2 模型制備

參照相關文獻[6]制備 MCAO模型大鼠。采用 R540增強型小動物麻醉機(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)在氣麻下采用頸內動脈線栓法制備大鼠右側局灶性腦缺血模型,將大鼠取仰臥位固定于手術臺上,充分暴露右側頸區(qū),在右側CCA活結與死結之間(“Y”形交叉處下約3 mm處)作切口;將前端浸蠟的栓線(北京西儂科技有限公司,型號為 2636-A4)插入此切口,將線栓插至大腦前動脈近段,堵塞大腦中動脈起始端口。2 h后緩慢回抽魚線,剪去多余栓線,逐層縫合皮膚。

1.3 干預方法

1.3.1 假手術組(S)和模型組(M)

采用4%異氟烷、氧氣4 L/min誘導下麻醉1 min,并在2.5%異氟烷、氧氣0.5 L/min維持氣麻20 min,每次氣麻20 min,連續(xù)干預5 d。

1.3.2 電針組(EA)

造模后 1 d,采用氣麻下電針干預,根據(jù)《實驗針灸學》[7]取足三里(雙側)、曲池(雙側),采用0.30 mm×25 mm一次性使用無菌針灸針(吳江市云龍醫(yī)療器械有限公司,執(zhí)行標準GB2024-94針灸針)進行針刺。接通 G6805-Ⅱ低頻電子脈沖治療儀(上海醫(yī)用電子儀器廠生產(chǎn)),連續(xù)脈沖波,刺激頻率 2 Hz,電流范圍為1.5～2 mA,每次干預20 min,連續(xù)干預5 d。

1.4 觀察指標

1.4.1 大鼠體質量

分別在大鼠步態(tài)訓練造模前(B)、造模后1 d(D1)、造模后5 d(D5)、造模后7 d(D7)記錄各組大鼠體質量變化。

1.4.2 大鼠神經(jīng)功能缺損評分(Neurological Deficit Scores, NDS)

造模完成后2 h,待大鼠清醒后采用Bederson評分進行NDS,0分為未見行為缺陷;1分為肢屈曲,即提尾懸空試驗陽性;2分為側推抵抗力下降,即側向推力試驗陽性,伴前肢屈曲,無轉圈行為;3分同2級行為,伴自發(fā)性旋轉。評分為2分及以上表明模型大鼠大腦中動脈阻塞成功,即清醒后出現(xiàn)左前肢屈曲,站立不穩(wěn),前進時向左側傾斜。記錄B、造模后2 h(2 h)、D1、D5、D7的NDS。

1.4.3 腦血流

測定右側大腦中動脈供血區(qū)域血流值,當所示數(shù)值平穩(wěn)時開始記錄,每次記錄時間＞3 min,并記錄B、2 h、D1、D5、D7時的血流變化值及平均血流速度,血流灌注單位為PU。

1.4.4 步態(tài)分析

采用荷蘭Noldus公司Catwalk步態(tài)分析系統(tǒng)進行大鼠步態(tài)訓練。將大鼠飼養(yǎng)在行為學實驗環(huán)境中進行適應性生活3 d,然后每日16:00—20:00對大鼠進行步態(tài)訓練,以大鼠順利通過整個玻璃板為1次,每日訓練5次,每次不少于10步,共連續(xù)訓練10 d。分別記錄B、D1、D5、D7時大鼠的四足步態(tài)數(shù)據(jù)。

1.5 統(tǒng)計學方法

應用SPSS24.0軟件進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差表示,采用重復測量方差分析,LSD檢驗比較組間差異,對學生化殘差的分析,以 Mauchly’s檢驗是否滿足球形假設,有交互作用,分析各因素的單獨效應;無交互作用時,分析各因素的主效應,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 3組不同時間體質量比較

體質量組別和時間無交互作用(P＜0.05)。不同時間比較,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);M組、EA組D1時體質量較B顯著下降(P＜0.05);S組、EA組的體質量D5、D7與B及D1比較顯著上升(P＜0.05)。組間比較,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);與S組比較,M組在D1、D5、D7時體質量顯著下降(P＜0.05);與M組比較,EA組D5、D7體質量顯著上升(P＜0.05)。詳見圖1。

圖1 3組不同時間體質量比較(±s,g)

2.2 3組不同時間NDS比較

NDS組別和時間無交互作用(P＜0.05)。不同時間比較,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);M組2 h、D1、D5的NDS較B顯著上升(P＜0.05);EA組各時間點NDS比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),EA組D5、D7較2 h顯著下降(P＜0.05)。組間比較,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);與S組比較,M組各時間點NDS顯著增加(P＜0.05);與 M組比較,EA組 NDS在 D5時顯著減少(P＜0.05)。詳見圖2。

圖2 3組不同時間NDS比較( ±s,分)

2.3 3組不同時間腦血流量比較

腦血流量組別和時間無交互作用(P＞0.05)。組間比較,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),與S組比較,M組腦血流量在 D1、D5、D7時顯著下降(P＜0.05);與 M組比較,EA組腦血流量在D1和D5時上升(P＜0.05)。不同時間腦血流量比較,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);與 B時比較,各組其他時間點腦血流量顯著下降(P＜0.05);與2 h和D1時比較,各組D5和D7時間點腦血流量顯著下降(P＜0.05)。詳見圖3。

圖3 3組不同時間腦血流量比較( ±s,PU)

2.4 3組平均血流速度比較

平均血流速度組別與時間有交互作用(P＜0.05)。組間比較,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);與S組比較,M組D1和D5時平均血流速度顯著下降(P＜0.05);與M組比較,EA組與 D5時平均血流速度顯著上升(P＜0.05)。不同時間比較,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);與B時比較,S組D5、D7時平均血流速度顯著下降(P＜0.05),M組其他時間點顯著下降(P＜0.05),EA組D1、D7顯著下降(P＜0.05);與D1時比較,S組D5、D7平均血流速度顯著下降(P＜0.05),EA組D5顯著上升(P＜0.05)。詳見表1。

表1 3組平均血流速度比較 (±s,PU)

表1 3組平均血流速度比較 (±s,PU)

注:與同組B比較1)P＜0.05;與同組D1比較2)P＜0.05;與S組比較3)P＜0.05;與M組比較4)P＜0.05

組別 n B 2 h D1 D5 D7 S 組 8 102.80±41.98 99.75±59.76 89.42±16.95 55.08±12.941)2) 48.73±24.021)2)M 組 8 129.28±45.93 65.55±37.441) 29.68±20.201)3) 43.47±6.561)3) 34.67±14.261)EA 組 8 100.82±32.51 64.35±28.32 30.07±18.741)3) 67.32±25.502)4) 60.12±29.351)

2.5 3組干預前后步態(tài)分析結果比較

時間參數(shù)(平均速度)、空間參數(shù)(最大接觸面積、壓印面積、壓印寬度、支撐相、步長)組別和時間有交互作用(P＜0.05),組別和不同時間比較,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。與S組比較,M組在D1時右前最大接觸面積、壓印面積均值、壓印寬度均值、支撐相均值顯著增加(P＜0.05),平均速度、右前步長均值顯著降低(P＜0.05);與M組比較,EA組在D5、D7時右前最大接觸面積、壓印面積均值、壓印寬度均值、支撐相均值顯著降低(P＜0.05),平均速度、右前步長均值顯著增加(P＜0.05)。詳見圖4。

圖4 步態(tài)分析結果

3 討論

近年來,卒中的康復干預主要集中在慢性康復期,研究顯示,DAPT能夠促進移植的NSCs向神經(jīng)元分化,對腦缺血大鼠神經(jīng)干細胞移植后有神經(jīng)保護作用[8],血府逐瘀丸對慢性腦缺血大鼠腦部NOX表達起保護腦缺血的作用[9],梔子苷可以透過血腦屏障,推測黃芩苷、梔子苷(7:3)配伍可能通過抑制興奮性氨基酸的釋放而發(fā)揮腦保護作用[10]。事實上康復的早期介入尤為重要,已有研究顯示早期的主動性的康復治療方式能使卒中患者的運動功能得到改善[11-13]。

以往研究中,多采用激光多普勒血流儀(laser doppler flowmetery, LDF)測定缺血再灌注大鼠局部腦血流量以判斷MCAO模型大鼠是否制作成功,而連續(xù)的血流監(jiān)測也開始用于MCAO模型大鼠的研究中,如丹燈通腦膠囊、眼針、EA均可提高缺血早期梗死側局部腦血流量或腦血流速度、增加健側對梗死側的血流代償[14-16]。本研究發(fā)現(xiàn)M組的血流量在D1、D5、D7時顯著下降(P＜0.05);說明腦缺血后會造成腦血流量減少,而與M組比較,EA組腦血流量在D1和D5時上升(P＜0.05),說明早期的電針干預可以增加腦部的血流量,改善腦部因缺血缺氧造成的損傷。平均血流速度中,S組D5、D7時較B及D1時顯著下降(P＜0.05),說明連續(xù)的氣麻下監(jiān)測對正常大鼠的腦血流也會產(chǎn)生一定的影響;與S組比較,M組D1和D5時平均血流速度顯著下降(P＜0.05),說明模型組的血流速度是持續(xù)下降的,腦損傷不可逆,而因為早期的電針干預,EA組的平均血流速度上升,腦損傷可能得到了一定程度的修復,說明干預電針起到腦保護作用,從而可能減少運動功能損傷。

行為學變化是神經(jīng)功能的直觀體現(xiàn),步態(tài)是構成大鼠行進行為的基本要素,步態(tài)指標多種多樣,主要分為時間特征參數(shù)、空間特征參數(shù)以及時空特征參數(shù),其中時間特征指標包括步態(tài)周期、支撐相、擺動相以及支撐系數(shù)等[17]。運動學測量的本質是對動物行進行為的定量和詳細描述,CatWalk是一種評估運動行為的方法,較其他行為學檢測手段而言具有明顯的優(yōu)勢,它可實時捕捉及自動化分析大鼠的日常動作,經(jīng)過步態(tài)訓練,形成步態(tài)模式,避免了人為觀察導致的干擾因素,更為客觀評價大鼠的行為學變化,如評估切口痛模型早期機械性痛覺超敏[18],且運動訓練本身對運動功能康復也是有作用的[19],這樣的動物行為學研究和臨床研究也更切合。

大鼠的步態(tài)行為是各個肢體共同協(xié)調運動行為的結果,不同的動物模型,步態(tài)行為異常表現(xiàn)往往不一樣,但主要關注各足的步寬、步行周期、支撐時長、擺動時長、足跡平均面積、平均強度等[20]。本研究結果發(fā)現(xiàn),M組大鼠D1時右前最大接觸面積、壓印面積、壓印寬度增加,EA組明顯下降,這3個參數(shù)有可能作為評價EA或其他干預手段是否起效的指標,表明了存在步態(tài)代償?shù)那闆r,即兩側肢體的支撐系數(shù)均增大(如拖行步態(tài)),以減小患肢承受的壓力。步速是步態(tài)時空特征指標,它影響著步態(tài)周期,是步態(tài)分析中的時間參數(shù),本研究發(fā)現(xiàn),M組大鼠D1、D5和D7時平均速度均值降低,EA組D5、D7時升高。M組大鼠D1、D5和D7時步長均值降低,EA組D5、D7時升高。M組大鼠支撐相D1、D5和D7升高,EA組D5、D7時下降。

針刺治療卒中后運動功能障礙歷史悠久,電針能夠改善局灶性腦缺血后大腦神經(jīng)元的損傷,對神經(jīng)功能的恢復具有一定的促進作用[21];促進局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)功能恢復,可能與血管新生抑制因子 ES、TSP-1的表達下調有關[22]。本研究選擇雙側曲池、足三里1.5～2 mA的刺激強度、進行電針干預,以起到自下而上的腦功能調節(jié)作用。研究顯示電針曲池、足三里可促進腦缺血大鼠皮質 BDNF的合成和分泌,上調SYN的表達,可能在調控腦可塑性方面發(fā)揮重要作用[23];可改善腦缺血大鼠的神經(jīng)缺損癥狀,作用機制可能與PI3K/AKT信號通路有關[24]。足三里穴屬于足陽明經(jīng),曲池穴屬于手陽明大腸經(jīng),兩穴均是本經(jīng)的“合穴”,經(jīng)氣由此匯聚,陽明經(jīng)多氣多血,對卒中后肢體活動不利尤為適宜,兩穴合用具有調和陰陽、益氣養(yǎng)血之效。

本研究的創(chuàng)新之處在于對步態(tài)行為的無干擾的標準化步態(tài)訓練方式,使其形成一種行為模式,故在MCAO模型的早期-D1就可進行步態(tài)測試,得到最真實有效數(shù)據(jù),而這在臨床中是很難實現(xiàn)的。本研究發(fā)現(xiàn)了在步態(tài)功能檢測中有意義的參數(shù),從而可以更好地了解腦神經(jīng)功能,將腦神經(jīng)功能劃分得更細微,為臨床提供更好的向導。

綜上所述,大鼠腦缺血發(fā)生后步態(tài)行為中最大接觸面積、壓印面積、壓印寬度、壓印長度等參數(shù)持續(xù)上升,可能與腦缺血后運動功能障礙有直接關系,腦缺血不僅損傷動物的運動功能,而且會造成認知障礙,電針干預不僅對運動功能有促進作用,對認知功能也有作用,但本研究沒有涉及,所以在今后的研究中都應該繼續(xù)深入研究,以進一步闡明其意義,為臨床研究提供更多的依據(jù)。