張晶晶 方 翌 劉麗雅 沈阿靈 沈志清 張 鈴 彭 軍 魏麗慧 陳友琴

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；2.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350122；3.美國(guó)凱斯西儲(chǔ)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，俄亥俄州 克利夫蘭 44106）

據(jù)美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)2020年統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，大腸癌（colorectal cancer，CRC）在致死性癌癥中占第三位，美國(guó)每年有超過(guò)150萬(wàn)新發(fā)病例，其中死亡人數(shù)高達(dá) 1／3［1］。研究表明，腫瘤干細(xì)胞是癌癥治療后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和耐藥的關(guān)鍵因素，這些細(xì)胞在實(shí)體瘤組織中占比較小，并具有自我更新、高成瘤能力、多向分化等生物學(xué)特性［2-3］。其中，自我更新是腫瘤干細(xì)胞的基本特征，指其通過(guò)對(duì)稱或不對(duì)稱分裂產(chǎn)生至少一個(gè)保留干細(xì)胞特性子細(xì)胞的過(guò)程，可使癌細(xì)胞無(wú)限增殖，從而影響腫瘤發(fā)生發(fā)展［4］。因此，如何抑制大腸癌干細(xì)胞的自我更新和成瘤能力及其機(jī)制研究，對(duì)防治大腸癌具有重要意義。半枝蓮（Scutellaria barbataD.Don）系唇形科黃芪屬植物，功效清熱解毒、化瘀散結(jié)，對(duì)大腸癌、胃癌等惡性腫瘤均有良好療效［5］。課題組前期實(shí)驗(yàn)表明半枝蓮具有降低大腸癌干細(xì)胞比例及誘導(dǎo)其調(diào)亡的作用［6-7］，但對(duì)大腸癌干細(xì)胞自我更新功能和體內(nèi)成瘤能力的作用及機(jī)制尚未闡明。因此，本課題研究半枝蓮對(duì)大腸癌干細(xì)胞自我更新和成瘤能力的影響及可能的調(diào)控通路。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥物和細(xì)胞株 半枝蓮購(gòu)自福建中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)醫(yī)堂；人源SW480大腸癌細(xì)胞株購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4～5周齡SPF級(jí)BALB／c雄性裸鼠，8只，體質(zhì)量（20±2）g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：2015000553480。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 DMEM／F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清、B-27、Antibiotic-Antimycotic、StemPro Accutase cell Dissociation Reagent（美國(guó) Thermo Fisher Scientific 公司）；Leibovitz’s L-15 培養(yǎng)基（江蘇凱基生物公司）；表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，F(xiàn)GF-basic）（美國(guó) Peprotech 公司）；一抗 Nanog、SRY 同源框 2（SRY homology box 2，SOX2）、八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子（octamer-binding transcription factor 4，OCT4）、磷酸化蛋白激酶 B（p-Akt）、蛋白激酶 B（Akt）、GAPDH、β-actin 及鼠二抗、兔二抗（美國(guó)Cell Signaling Technology公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；CO2培養(yǎng)箱、低速離心機(jī)（美國(guó) Thermo Fisher Scientific公司）；MOFLO XDP分選型流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman Coulter公司）；高內(nèi)涵細(xì)胞分析系統(tǒng)（美國(guó)BD Biosciences公司）；電泳儀、電泳槽、化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 常用試劑配制

2.1.1 半枝蓮溶液的配制 參照文獻(xiàn)［6］中的方法制備半枝蓮乙醇提取物，用PBS和DMSO按1∶1比例配制成濃度為500 mg／mL的半枝蓮溶液，超聲30 min，待溶解后分裝，并儲(chǔ)存于-20℃。

2.1.2 大腸癌干細(xì)胞培養(yǎng)基配制 在不含胎牛血清的 DMEM／F12培養(yǎng)基中加入 20 ng／mL EGF、20 ng／mL FGF-basic、1×B-27 和 1%Antibiotic-Antimycotic，分裝儲(chǔ)存于0℃。

2.2 大腸癌干細(xì)胞培養(yǎng) 采用側(cè)群細(xì)胞分選法分離大腸癌干細(xì)胞［8］，收集大腸癌干細(xì)胞后用PBS清洗1次，加入配置好的干細(xì)胞培養(yǎng)基，并按照1.5×103個(gè)／mL密度接種在超低粘附6孔板中培養(yǎng)。

2.3 克隆球?qū)嶒?yàn) 將大腸癌干細(xì)胞按3×105個(gè)／mL的密度接種于超低黏附6孔板培養(yǎng)過(guò)夜后，用不同濃度的半枝蓮（0、0.25、0.5、0.75 mg／mL）干預(yù) 24 h，然后消化離心收集細(xì)胞重新按5×102個(gè)／mL的密度分別接種于超低粘附6孔板，在干細(xì)胞培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)10 d。期間，每隔3 d添加1 mL干細(xì)胞培養(yǎng)基。最后移至96孔板，采用高內(nèi)涵細(xì)胞分析系統(tǒng)在10×物鏡下，以10×10的模式進(jìn)行圖片采集，并進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2.4 皮下移植瘤模型 將BALB／c雄性裸鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房微生物隔離籠中，添加無(wú)菌墊料、飼料、水。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。大腸癌干細(xì)胞經(jīng)半枝蓮（0、0.5 mg／mL）干預(yù)后，調(diào)整細(xì)胞數(shù)，用PBS（50 μL）和基質(zhì)膠（50 μL）混合液重懸，采用皮下注射法，按 1 000 個(gè)細(xì)胞 ／只（100 μL／只），注射到小鼠的右腋下（對(duì)照組4只，半枝蓮0 mg／mL；實(shí)驗(yàn)組4只，半枝蓮0.5 mg／mL）。接種后每日觀察小鼠狀態(tài)及瘤體生長(zhǎng)情況，49 d后用過(guò)量異氟烷處死小鼠，剝除所有腫瘤并稱重。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均嚴(yán)格按照《福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)協(xié)議書(shū)及承諾書(shū)》中的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

2.5 Western blot檢測(cè) Nanog、SOX2、OCT4、p-Akt、Akt蛋白的表達(dá) 用不同濃度半枝蓮（0、0.25、0.5、0.75 mg／mL）干預(yù)大腸癌干細(xì)胞24 h后，棄上清，用預(yù)冷的PBS清洗2次，加入細(xì)胞裂解液（含蛋白酶抑制劑），在冰上裂解30 min以提取總蛋白，用BCA法測(cè)定總蛋白濃度。加入蛋白上樣緩沖液（5×SDS-PAGE）使蛋白變性，然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳（90 V，45 min；120 V，55 min），接著用 PVDF 膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜（110 V，60 min）。轉(zhuǎn)膜結(jié)束加封閉液封閉1 h，按目的蛋白分子量大小進(jìn)行裁膜，并加入對(duì)應(yīng)的一抗 Nanog（1∶2 000）、SOX2（1∶1 000）、OCT4（1∶1 000）、p-Akt（1∶2 000）、Akt（1∶1 000）、β-actin（1∶5 000）、GAPDH（1∶5 000），4 ℃搖床孵育 14～16 h。一抗孵育結(jié)束后用1×TBST清洗3次，每次10 min。再加入兔二抗或鼠二抗（1∶5 000）常溫孵育1 h，二抗孵育后用1×TBST清洗3次，每次10 min。用ECL化學(xué)發(fā)光法顯影，在化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀上檢測(cè)蛋白表達(dá)。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以（±s）表示，符合正態(tài)分布且方差齊，用t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布，則用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。多組數(shù)據(jù)之間比較采用單因素方差分析。

3 結(jié) 果

3.1 半枝蓮對(duì)大腸癌干細(xì)胞體外成球能力的影響

在倒置顯微鏡下觀察克隆球數(shù)目，可見(jiàn)0 mg／mL組細(xì)胞生長(zhǎng)密集，成球狀況良好，而不同濃度半枝蓮干預(yù)后克隆球數(shù)目較0 mg／mL組均明顯減少（P＜0.05），且隨濃度的增加克隆球數(shù)目遞減，見(jiàn)圖1。

圖1 半枝蓮對(duì)大腸癌干細(xì)胞體外成球能力的影響（×100）

3.2 半枝蓮對(duì)大腸癌干細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力的影響

皮下接種后，隨時(shí)間推移，可見(jiàn)對(duì)照組裸鼠瘤體體積逐漸增大，而實(shí)驗(yàn)組瘤體生長(zhǎng)較為緩慢，49 d后剝除瘤體，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組的瘤體明顯比對(duì)照組小，見(jiàn)圖2。進(jìn)一步稱量瘤體質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組的瘤體質(zhì)量較對(duì)照組顯著降低（P＜0.05）。

圖2 半枝蓮對(duì)大腸癌干細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力的影響

3.3 半枝蓮對(duì) Nanog、SOX2、OCT4蛋白表達(dá)的影響 與0 mg／mL組相比，不同濃度的半枝蓮干預(yù)24 h后均能明顯下調(diào)Nanog、SOX2、OCT4的蛋白表達(dá)水平（圖3），且抑制作用隨著半枝蓮的濃度增加而變強(qiáng)。

3.4 半枝蓮對(duì)p-Akt、Akt蛋白表達(dá)的影響 與0 mg／mL組相比，不同濃度的半枝蓮干預(yù)24 h后，均能明顯抑制Akt的磷酸化，見(jiàn)圖4。

圖3 半枝蓮對(duì)大腸癌干細(xì)胞Nanog、SOX2、OCT4蛋白表達(dá)的影響

圖4 半枝蓮對(duì)大腸癌干細(xì)胞p-Akt、Akt蛋白表達(dá)的影響

4 討論

大腸癌是臨床常見(jiàn)的難治性消化道腫瘤，目前臨床療法以手術(shù)切除和化療為主［9］，但術(shù)后易發(fā)生臟器轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致患者生存率降低［10］；化療又伴隨毒副作用，嚴(yán)重危害患者生存質(zhì)量。針對(duì)上述局限性，近年來(lái)中醫(yī)藥抗腫瘤研究逐漸興起。中醫(yī)藥在防治癌癥方面具有多組分、多靶標(biāo)、副作用少等獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，但目前研究多集中在抗腫瘤細(xì)胞方向，對(duì)腫瘤干細(xì)胞的研究較少，而腫瘤干細(xì)胞才是癌癥轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵［11］。腫瘤干細(xì)胞是實(shí)體瘤中一小群明顯不同的細(xì)胞亞群，相當(dāng)于癌組織里的“種子細(xì)胞”，通常處于休眠狀態(tài)，可逃脫外界傷害，當(dāng)環(huán)境適宜時(shí)則惡性增殖，并易產(chǎn)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。因此，研究能抑制大腸癌干細(xì)胞自我更新和成瘤能力的中藥及其調(diào)控機(jī)制，有望解決大腸癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移這一難題。

半枝蓮是臨床常用抗癌中藥，研究表明它含有黃酮、多糖、二萜等活性物質(zhì)，這些有效成分可調(diào)節(jié)免疫、抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)和腫瘤血管生成，從而發(fā)揮抗腫瘤功效［12-16］?？寺∏?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，相比0 mg／mL組，半枝蓮干預(yù)后大腸癌干細(xì)胞成球數(shù)目明顯減少；裸鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)顯示，實(shí)驗(yàn)組大腸癌干細(xì)胞所形成的瘤體質(zhì)量較對(duì)照組顯著減輕。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)綜合表明半枝蓮可抑制大腸癌干細(xì)胞的體外自我更新能力和體內(nèi)成瘤能力。

據(jù)報(bào)道，腫瘤干細(xì)胞的自我更新和成瘤能力受到多條信號(hào)通路調(diào)控，其中Akt信號(hào)通路的異?；罨墙?jīng)典的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一［17-18］。Akt蛋白屬于AGC激酶家族，最初被描述為病毒癌基因的人類同源物，可調(diào)控細(xì)胞代謝、增殖、癌癥發(fā)生等生理病理過(guò)程［19-20］。研究表明，活化的Akt存在于大腸癌組織中，且與大腸癌患者預(yù)后不良有關(guān)［21］。當(dāng)Akt通路受細(xì)胞外信號(hào)刺激時(shí)，可發(fā)揮細(xì)胞內(nèi)下游效應(yīng)子功能，通過(guò)聚集Akt并轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜后，在磷酸肌醇依賴性激酶1（PDK1）和雷帕霉素復(fù)合物激酶2（mTORC2）的活化作用下，促進(jìn)磷酸化，最終活化的Akt會(huì)進(jìn)一步誘導(dǎo)多種底物磷酸化，從而維持腫瘤干細(xì)胞的自我更新和成瘤能力［22］，該途徑中重要的下游靶基因主要有 Nanog、SOX2、OCT4 等［23］。 Nanog 是一種同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子，在維持干細(xì)胞多能性和自我更新中起著重要作用［24］。ALMOZYAN 等［25］發(fā)現(xiàn)下調(diào)PD-L1可通過(guò)激活A(yù)kt信號(hào)通路靶向Nanog，從而抑制乳腺干細(xì)胞的體外自我更新能力和體內(nèi)成瘤能力。SOX家族涉及癌細(xì)胞生長(zhǎng)遷移、克隆球形成和成瘤能力［26］，其中，SOX2是維持腫瘤干細(xì)胞特性所必需的轉(zhuǎn)錄調(diào)控子［27］，ZHOU 等［28］發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-135b可通過(guò)激活A(yù)KT／mTOR途徑增加SOX2的表達(dá)，并最終促進(jìn)胰腺癌干細(xì)胞自我更新和成瘤能力。OCT4也調(diào)控干細(xì)胞多能分化和自我更新［29］，ZHU等［30］發(fā)現(xiàn)通過(guò)靶向轉(zhuǎn)錄因子ZIC2可激活OCT4，促進(jìn)克隆球形成及小鼠異種移植瘤生長(zhǎng)，從而驅(qū)動(dòng)肝癌干細(xì)胞自我更新和成瘤能力。

因此，本課題通過(guò)檢測(cè)與大腸癌干細(xì)胞中自我更新和成瘤能力相關(guān)標(biāo)志物Nanog、SOX2、OCT4及Akt信號(hào)通路中p-Akt、Akt蛋白的表達(dá)，探討半枝蓮抑制大腸癌干細(xì)胞自我更新和成瘤能力的分子機(jī)制。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)半枝蓮干預(yù)后，大腸癌干細(xì)胞中Nanog、SOX2、OCT4的表達(dá)明顯下調(diào)，且Akt的磷酸化被顯著抑制。提示通過(guò)抑制Akt信號(hào)通路的活化可能是半枝蓮抑制大腸癌干細(xì)胞自我更新和成瘤能力的重要機(jī)制之一。