吳俊峰，任淑婷

（西安交通大學醫(yī)學部基礎醫(yī)學院，陜西 西安 710000）

0 引言

結核病是由結核分枝桿菌感染引起的一種慢性肉芽腫性病，以肺結核病最為常見，但亦見于全身各臟器和器官，危害性極大[1]，是嚴重危害人類健康的全球性傳染病之一[2]。近年來，我國結核病的發(fā)病率持續(xù)上升，其發(fā)病率及死亡率在我國法定傳染病中居首位，是我國重點防治疾病之一[3]。因此，早期準確診斷是結核病患者得以及時治療的關鍵，而提高診斷技術對早期發(fā)現(xiàn)結核病患者至關重要[4]。目前，醫(yī)院實驗室檢測結核分枝桿菌的方法既有傳統(tǒng)的抗酸染色、細菌培養(yǎng)等技術，又有免疫學診斷技術和各種PCR的衍生技術[5]。本次實驗采用抗酸染色與PCR-熒光探針法同時檢測經福爾馬林固定、石蠟包埋組織中的結核分枝桿菌，比較兩種方法檢測結果的一致性，探討兩種方法在結核病病理診斷中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 研究資料

本組資料選自2018年1月至2019年10月西京醫(yī)院疑似結核患者，共543例，年齡1～90歲，平均（48.29±16.17）歲，其中男性231例，女性312例，檢測標本類型包括肺組織、淋巴結、肝臟組織、腎臟組織、軟組織包塊、大網膜、胰腺、胸腹膜、子宮、關節(jié)滑膜、椎間盤、胸椎及腰椎、前列腺組織、附睪等，所有組織標本均經10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，3μm切片，HE染色、抗酸染色及PCR-熒光探針法檢測。

1.2 試劑與方法

1.2.1 抗酸染色試劑與方法

抗酸染色試劑盒購于珠海貝索生物技術有限公司，采用Ziehl-Neelsen法,操作步驟如下：①切片經脫蠟后滴加石碳酸復紅溶液，微火加熱5～10min，重復滴加并加熱；②冷后水洗，濾紙吸干水分；③滴加酸性酒精溶液脫色1～2min；④水洗后加亞甲基藍溶液20～30s；⑤水洗，梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。

1.2.2 PCR-熒光探針法試劑與方法

PCR-熒光探針法試劑盒購于湖南圣湘生物科技有限公司，操作步驟如下：①取出試劑盒中的各組分，室溫放置，待其溫度平衡至室溫，混勻后備用；②根據(jù)待測樣本、陰性對照、陽性對照和陽性參照品A、B、C、D，按比例取相應量的反應液、酶混合液，充分混勻成PCR混合液，瞬時離心后備用；③在樣本中加入2～3倍體積的4%NaOH溶液，震蕩混勻后靜置液化30min。取液化后的樣本500μL于1.5mL離心管，12000r/min，離心3min，吸除上清；加入1mL無菌生理鹽水重懸沉淀，12000r/min，離心3min，吸除上清；加入50μL核酸釋放劑，100℃處理10min，12000r/min，離心3min，上清作為待測樣本備用；④每個PCR反應管中依次加入待測樣本、陰性對照、陽性對照和陽性參照品各5μL；⑤每管加入PCR混合液40μL，蓋上管蓋，2000r/min離心30s；⑥將PCR反應管放入擴增儀樣品槽，按對應順序設置陰性對照、陽性對照、陽性參照品及未知樣本，并設置樣本名稱；⑦選擇熒光檢測通道，50℃UNG酶反應2min，94℃Taq酶活化5min，94℃變性15s 45次，57℃退火，延伸及熒光采集30min 45次，25℃儀器冷卻10min。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗進行分析，組內比較采用行×列表資料的χ2檢驗進行分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 抗酸染色陽性結果

結核分枝桿菌為長1.3～3.5μm，寬0.3～0.5μm桿菌，可有彎曲，沒有鞭毛和芽孢，鏡下抗酸菌或呈成群桿菌，或呈小點狀（退變時），菌量少時可見每2～3個細菌連成“V”、“Y”、“T”等形狀的特有集結，呈鮮紅色，其他細菌及細胞呈藍色（圖1）。

圖1 抗酸染色陽性結果圖

2.2 抗酸染色與PCR-熒光探針法染色結果（表1）

2.3 抗酸染色與PCR-熒光探針法結果的比較

在543例疑似結核患者病例中，抗酸染色與PCR-熒光探針法同為陽性者53例，同為陰性者327例，抗酸染色陰性，PCR-熒光探針法陽性者158例，抗酸染色陽性，PCR-熒光探針法陰性者5例，兩種方法符合率為69.98%，抗酸染色陽性檢出率為10.68%，PCR-熒光探針法陽性檢出率為38.86%，差異有顯著性（P<0.001,見表2）。

2.3.1 抗酸染色與PCR-熒光探針法檢測不同性別MTB陽性率比較

抗酸染色與PCR-熒光探針法檢測不同性別MTB的陽性檢出率差異均有統(tǒng)計學意義（P均<0.001，見表3）且PCR-熒光探針法在不同性別患者的MTB陽性檢出率均高于抗酸染色法。

2.3.2 抗酸染色與PCR-熒光探針法檢測不同年齡MTB陽性率比較

抗酸染色與PCR-熒光探針法檢測不同年齡MTB的陽性檢出率差異均有統(tǒng)計學意義（P均<0.05，見表4）且PCR-熒光探針法在不同年齡患者的MTB陽性檢出率均高于抗酸染色法。

2.3.3 抗酸染色與PCR-熒光探針法檢測不同組織來源MTB陽性率比較

除胸壁、胸膜、腹膜及肝組織外，抗酸染色與PCR-熒光探針法檢測不同組織來源MTB的陽性檢出率差異均有統(tǒng)計學意義（P均<0.05，見表5）且PCR-熒光探針法在不同組織來源患者的MTB陽性檢出率均高于抗酸染色法。

2.4 187例明確臨床診斷結果中兩種方法Youden指數(shù)的比較

見表6、表7。

表1 抗酸染色與PCR-熒光探針法染色結果

表2 抗酸染色法與PCR-熒光探針法檢測結果的比較

表3 兩種方法檢測不同性別MTB陽性率比較[n(%)]

表4 兩種方法檢測不同年齡MTB陽性率比較[n(%)]

表5 兩種方法檢測不同組織來源MTB陽性率比較[n(%)]

表6 抗酸染色法的Youden指數(shù)

表7 PCR-熒光探針法的Youden指數(shù)

3 討論

結核病病理形態(tài)學主要表現(xiàn)為壞死性肉芽腫性炎，中央為干酪樣壞死，外圍由類上皮細胞、朗格漢斯巨細胞、反應性增生纖維母細胞及淋巴細胞構成[6]，但在實際工作中，結核病的病理變化既有典型的病變，也常出現(xiàn)不典型的病變，給結核病的診斷造成困難，因此，找到病灶組織中結核分枝桿菌成為病理學診斷的重要依據(jù)[7]。

抗酸染色是檢測結核分枝桿菌的傳統(tǒng)方法，可用于痰涂片和組織切片染色，其方法簡單、成本低、特異性高，但是靈敏度低，易造成假陰性[8]。PCR法是根據(jù)DNA復制原理而設計的體外DNA或RNA擴增方法,優(yōu)點是具有高度的敏感性和特異性，且操作較簡單，已成為結核診斷的最佳檢測方法[9]。本實驗對來自西京醫(yī)院的543例疑似結核患者同時進行抗酸染色和PCR-熒光探針法檢測，比較兩種方法的陽性檢出率及符合率。結果顯示：抗酸染色法陽性檢出率為10.68%（58/543），PCR-熒光探針法陽性檢出率為38.86%（211/543），兩者符合率為69.98%，其中抗酸染色法陽性而PCR-熒光探針法陰性者有5例，分析其原因可能為：①抗酸染色法不僅使結核分枝桿菌呈陽性，非結核分枝桿菌如麻風桿菌也會呈陽性；②若樣本含菌量極少，經修片、切片后抗酸染色切片內含少量菌，PCR組織內可能會不含菌?？顾崛旧幮远鳳CR-熒光探針法陽性者158例，分析其原因可能為：①結核分枝桿菌較小，在鏡下觀察有一定的難度，具有觀察者的主觀差異，尤其是活檢小標本菌量少的易漏診[10]；②若取材組織來自壞死灶中心特別是陳舊性壞死中心，而非肉芽腫內或干酪樣壞死灶周圍，常因中心缺氧，不利于細菌生長，難以查見；③結核分枝桿菌在較陳舊或經過治療的病灶內可見短桿、顆粒及彎桿狀的變異形態(tài)，易誤診。

本文還比較了不同性別及年齡對抗酸染色和PCR-熒光探針法檢出率的影響，結果顯示：不同性別及年齡對抗酸染色和PCR-熒光探針法結果無明顯影響；同時，本文還對來自不同性別、年齡及組織來源的患者標本采用兩種方法檢測的陽性檢出率進行比較，結果顯示：在不同性別及年齡的患者標本中，PCR-熒光探針法陽性檢出率均顯著高于抗酸染色法；在不同組織來源中，除胸壁、胸膜、腹膜及肝組織外，抗酸染色與PCR-熒光探針法檢測不同組織來源MTB的陽性檢出率差異均有統(tǒng)計學意義且PCR-熒光探針法陽性檢出率均顯著高于抗酸染色法。胸壁、胸膜、腹膜及肝組織等組織來源可能因標本例數(shù)太少導致兩種方法的陽性檢出率無統(tǒng)計學意義。

543例疑似結核患者中已知明確臨床診斷結果者共187例，其中陽性105例，陰性82例，PCR-熒光探針法Youden指數(shù)（J=0.5245）顯著高于抗酸染色法Youden指數(shù)（J=0.2095）。

綜上所述，PCR-熒光探針法檢測石蠟包埋組織中的結核分枝桿菌，陽性檢出率顯著高于抗酸染色法，具備較高的診斷價值，可結合病理組織學特點為臨床提供可靠的診斷依據(jù)。