劇檸, 茍萌, 張彤彤

(寧夏大學 農(nóng)學院，寧夏 銀川，750021)

生物的基因組在通常情況下只表達少部分基因，且表達程度及表達的基因類型也會因生物生存環(huán)境及內(nèi)在狀態(tài)的變化存在差異?；螂m然是遺傳信息的源頭，但功能性蛋白質(zhì)才是基因功能的執(zhí)行體[1]，它為認識各種生命活動提供直接的分子基礎。隨著分子生物學技術及計算機科學的發(fā)展，蛋白質(zhì)組學應運而生，并被廣泛應用于食品[2-3]、醫(yī)學[4-5]和動植物生理[6-8]等各個領域的基礎研究與應用研究。蛋白質(zhì)是乳及乳制品的重要營養(yǎng)成分。較傳統(tǒng)的研究方法而言，一方面蛋白質(zhì)組學技術為深入了解乳及乳制品中蛋白質(zhì)組成、數(shù)量、功能及差異變化提供了新視角，且有助于挖掘其中具有生物活性的微量成分。另一方面，利用蛋白質(zhì)組學技術可深入研究乳及各類發(fā)酵乳制品中由微生物產(chǎn)生的酶(即蛋白質(zhì))，了解這些酶在乳及乳制品加工和存儲過程中發(fā)揮的作用，從而在生產(chǎn)加工中對其進行調(diào)控，提高乳及乳制品的品質(zhì)。本文對蛋白質(zhì)組學技術進行介紹，并重點對其在乳及乳制品中的應用進行綜述與展望，以期為乳品研究的方向提供參考。

1 蛋白質(zhì)組學及其研究過程中的主要技術

一個細胞或生物體內(nèi)的基因通常是靜態(tài)不變的，而其蛋白質(zhì)的表達程度、翻譯后的修飾以及蛋白質(zhì)的相互作用等則會隨著發(fā)育時期和生存環(huán)境的不同而產(chǎn)生巨大差異[9]。蛋白質(zhì)組學(proteomics)以一個生物體或細胞中整體蛋白質(zhì)作為研究對象，對其組成成分、修飾狀態(tài)、表達水平以及各蛋白質(zhì)之間的作用和聯(lián)系進行分析，不僅可以獲得整體水平上蛋白質(zhì)的組成信息，更有助于了解生命活動的調(diào)控規(guī)律[10]。

目前蛋白質(zhì)組學研究過程中的主要技術包括樣品制備技術、蛋白質(zhì)分離技術、蛋白質(zhì)鑒定技術以及生物信息學分析技術。

1.1 樣品制備技術

蛋白質(zhì)樣品制備的好壞直接決定后續(xù)鑒定結(jié)果，針對不同研究對象，所采取的制備方法也不同?；诹呀庖航?、離心、超聲、丙酮沉淀這些操作的制備方法只適用于高豐度蛋白以及簡單體系中蛋白質(zhì)的提取，如動植物組織中的蛋白制備[11-12]；豆醬[13]、污泥[14]、大曲[15]中微生物蛋白的制備以及乳酸菌中[16]蛋白的提取。常規(guī)的蛋白質(zhì)提取方法并不能完全適用于普遍樣本。研究表明,低豐度蛋白往往具有重要的生物學意義[17]，而樣品制備環(huán)節(jié)存在的主要問題是一些高豐度蛋白會對低豐度蛋白的鑒定造成干擾，基于此點，目前已研制出成熟的試劑盒能夠去除血清樣本中的高豐度蛋白(清蛋白、白蛋白等)而留下低豐度蛋白以供后續(xù)研究[18]。但此法僅限于研究血清樣本，無法廣泛使用。乳及乳制品中常采用離心結(jié)合超聲與沉淀等方法制備乳脂肪球膜蛋白、乳清蛋白以及酪蛋白等高豐度蛋白[19-20]，而對這個復雜體系中低豐度乳蛋白(如乳鐵蛋白、免疫球蛋白、糖蛋白、激素和內(nèi)源性酶)以及體系中微生物蛋白的研究則受到了分離技術的限制。JARDIN等[21]在研究干酪時，對干酪水溶性提取物使用離心、過濾、親和層析與分子排阻色譜的手段去除乳脂、酪蛋白及乳鐵蛋白，最終達到了富集其中低豐度微生物蛋白質(zhì)的目的。另外有報道顯示，采用免疫吸附劑去除了人和牛的初乳與常乳中部分高豐度蛋白后，利用二維凝膠電泳技術分離其中部分低豐度蛋白，結(jié)果表明人乳與牛乳中的微量蛋白受哺乳期影響不大[22]。靳登鵬等[23]比較了免疫親和層析和ProteoMiner低豐度蛋白富集試劑盒2種方法去除母乳乳清中高豐度蛋白的效果，發(fā)現(xiàn)兩者都能去除部分高豐度蛋白，但試劑盒的效果更好，能夠增加檢測到低豐度蛋白的幾率。

1.2 蛋白質(zhì)的分離技術

蛋白質(zhì)分離技術主要包括凝膠分離技術和色譜技術兩大類。凝膠分離技術包括二維凝膠電泳(two-dimensional gel-electrophoresis，2-DE)、二維熒光差異凝膠電泳(two dimension fluorescence difference gel eleltrophoresis，2D-DIGE)以及毛細管電泳(capillary electrophoresis，CE)等。由于凝膠電泳技術本身存在的弊端，其分離效果受到諸多條件限制，無法完全實現(xiàn)復雜樣品中蛋白質(zhì)的有效分離，因此現(xiàn)階段多采用色譜技術進行研究。色譜技術可有效增加蛋白質(zhì)鑒定的種類及數(shù)量，彌補電泳技術的部分缺陷[24-27]。液相色譜(liquid chromatography，LC)是常用的色譜技術之一，常與2-DE聯(lián)合使用，具有更為自動化的實驗過程。高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)在LC基礎上發(fā)展而來，因其特異性強、靈敏度高的特點，常用于相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)、膜蛋白以及低豐度蛋白的分離[25]。CHEN等[28]通過LC/MS技術研究了山羊乳均質(zhì)化過程中蛋白質(zhì)的變化;楊梅等[29]通過HPLC系統(tǒng)對牛乳中不同蛋白質(zhì)組成及功能進行了分析。色譜分離技術已成為乳及乳制品中標記與非標記蛋白質(zhì)組學研究的主要手段。

1.3 蛋白質(zhì)的鑒定技術

質(zhì)譜(mass spectrum，MS)技術是目前最為常用的蛋白質(zhì)鑒定技術，通過分析經(jīng)特異性蛋白酶(如胰酶)水解后得到的肽段混合物，能夠快速鑒定蛋白質(zhì)組分，并準確測定肽和蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量、氨基酸序列和翻譯后的修飾物。因色譜與質(zhì)譜的高效性與準確性，兩者聯(lián)用已成為蛋白質(zhì)組學研究的重要手段。在蛋白質(zhì)組學中，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight- mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)和電噴霧離子化質(zhì)譜(electrospray ionization-mass spectrometry, ESI-MS)是使用頻率較高的質(zhì)譜。其中，MALDI-TOF-MS常與2-DE技術聯(lián)用。烏日娜等[16]采用這種技術探究了植物乳桿菌(L.plantarumFS5-5)在鹽脅迫下的蛋白質(zhì)組學變化。而ESI-MS常與HPLC技術聯(lián)用。PETRELLA等[31]通過兩者聯(lián)用獲得了有關意大利水牛干酪中蛋白質(zhì)水解的信息。

以質(zhì)譜技術為基礎的蛋白質(zhì)分析目前主要依靠非標記(label-free)技術與同位素標記相對和絕對定量(isobaric tagging for multiplexed relative and absolute protein quantitation, iTRAQ)、多肽體外標記定量(tandem mass tag，TMT)、細胞培養(yǎng)條件下穩(wěn)定同位素標記(stable isotope labeling with amino acids in cell culture, SILAC)等體內(nèi)外標記技術。Label free可分析大量蛋白質(zhì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，操作簡便，多用于微生態(tài)中宏蛋白質(zhì)組學研究。就標記技術而言，雖然試劑盒價格昂貴，但從早期只限于2個樣本分析的同位素親和標記，到可對4或8種樣本進行分析的iTRAQ技術，以及可同時對2、6或10種蛋白樣品進行標記的TMT技術，其分析過程也更加趨于簡便準確。這些定量技術主要采取數(shù)據(jù)依賴采集模式(data dependent acquisition,DDA)，隨著動態(tài)范圍更廣、準確度更高的數(shù)據(jù)非依賴采集模式(data independent acquisition,DIA)的發(fā)展與成熟，蛋白質(zhì)的定量與定性將達到前所未有的深度[3,32]。

1.4 生物信息學分析技術

蛋白質(zhì)組學的數(shù)據(jù)龐大、關系復雜，其鑒定與分析在很大程度上取決于生物信息學(bioinformatics)技術，需要依靠計算機網(wǎng)絡、數(shù)據(jù)庫和應用軟件來進行蛋白質(zhì)序列的比較分析、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能預測及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用與作用途徑分析。其中包括對生物信息的收集、加工、存儲、檢索與分析，獲得生物信息后不僅要與數(shù)據(jù)庫中已有信息進行比對，還要通過數(shù)據(jù)分析對未知功能進行預測。因此，能夠自動化處理大規(guī)模數(shù)據(jù)的工具與信息全面準確的數(shù)據(jù)庫是蛋白質(zhì)組學發(fā)展的必然要求。目前已有大量的分析搜索軟件和數(shù)據(jù)庫相繼出現(xiàn)，可根據(jù)不同研究需要進行選擇。常見的蛋白質(zhì)定性軟件有MASCOT、SEQUEST、X!Tandem等；定量軟件有MaxQuant、SILVER等；綜合性平臺如Protein Discover。另有SIMCA可進行主成分分析，DAVID等軟件進行基因本體分析，STRING與KEGG用于進行蛋白-蛋白互作分析與蛋白質(zhì)代謝途徑分析，PowerPoint、Venn Diagrams、Winvenn、cluster、R語言等數(shù)據(jù)處理軟件可繪制文氏圖或熱圖。數(shù)據(jù)庫可分為蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫，如SWISS-PROT、PIR等；蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫，如PDB、SCOP、CATH等；蛋白質(zhì)功能數(shù)據(jù)庫，如GO、GOG、KEGG等；另外有UniProt、NCBI、EBI等綜合性數(shù)據(jù)庫，覆蓋了蛋白質(zhì)的相關數(shù)據(jù)[3,24,32]。

隨著色譜、質(zhì)譜與生物信息學的快速發(fā)展，蛋白質(zhì)組學技術已在諸多領域發(fā)揮著重要作用,如動植物及微生物生理現(xiàn)象的研究，臨床診斷中癌癥及心腦血管等重大疾病生物標志物的篩選，食品加工與存儲過程研究，乳品質(zhì)量和成分檢驗、毒素檢測等。

2 蛋白質(zhì)組學技術在研究乳及乳制品中的應用

乳及乳制品占全球食品消費20%～30%[33]，動物乳對人類健康起著不可忽視的作用。近年來，隨著乳品工業(yè)技術的發(fā)展，除傳統(tǒng)牛乳外，羊乳、駱駝乳、馬乳甚至獼猴乳[34]因其營養(yǎng)價值和特殊功效都被開發(fā)出來。利用組學技術研究不同種類、不同品質(zhì)乳以及不同加工存儲過程中乳蛋白質(zhì)的組成、數(shù)量、表達差異以及變化規(guī)律，對把控優(yōu)質(zhì)乳源、提高乳品開發(fā)率與利用率以及乳品行業(yè)質(zhì)量監(jiān)控有著重要作用。

乳及乳制品中蛋白質(zhì)組成復雜、種類豐富，近年來，乳脂肪球膜蛋白與乳清蛋白由于其特殊的生物功能而備受關注。與其他具有生物活性但受限于分離技術和儀器檢測靈敏度的低豐度蛋白相比，這兩類蛋白質(zhì)均為高豐度蛋白質(zhì)，易于分離并檢測觀察，因此成為研究熱點。除此之外，乳制品加工中殺菌技術、存儲時間對蛋白質(zhì)造成的具體影響是乳品蛋白質(zhì)組學研究的另一關注點。而我國的奶豆腐、乳餅、乳扇等種類繁多的特色乳制品，也有待于利用組學技術闡明其加工原理與營養(yǎng)價值，推進地方特色食品標準化生產(chǎn)，增加經(jīng)濟效益。

2.1 利用蛋白質(zhì)組學技術研究乳脂肪球膜蛋白

乳脂肪球膜蛋白包含來自于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細胞膜及細胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)，盡管乳脂肪球膜蛋白只占總?cè)榈鞍椎?%～2%，但它卻是其中最具多樣性的蛋白質(zhì)。更有研究表明乳脂肪球膜蛋白具有抗癌、防止幽門螺桿菌感染和提高自身免疫的作用[26,35]，由此成為近年來備受關注的一個乳蛋白組分。JI等[19]對牦牛乳與奶牛乳中乳脂肪球膜進行研究，鑒定了兩者主要的乳脂肪球膜蛋白，發(fā)現(xiàn)它們的生物學功能幾乎沒有差異，部分乳脂肪球膜蛋白在相對豐度上有所不同。該團隊[36]同樣研究了水牛和奶牛乳脂肪球膜蛋白，共鑒定出424個蛋白質(zhì)，其中146個蛋白質(zhì)差異極顯著，大部分在細胞膜上，具備催化活性和蛋白質(zhì)結(jié)合功能，參與生物體的代謝過程。楊梅等[29]研究牛乳中不同的蛋白質(zhì)組成，發(fā)現(xiàn)牛乳脂肪球膜蛋白中存在201種蛋白，乳清中存在96種蛋白，酪蛋白中存在21種蛋白，乳粒中存在43種蛋白，各組分中共有27種表達相同的蛋白。該團隊另一項對人乳與牛乳中乳脂肪球膜蛋白的研究中發(fā)現(xiàn)兩者存在較大差異[37]。在鑒定出的488種牛乳脂肪球膜蛋白質(zhì)中有173種特異性蛋白；1 545種人乳脂肪球膜蛋白質(zhì)中有1 230種特異性蛋白質(zhì)，且有24種蛋白質(zhì)參與免疫相關的通路。最終表明牛乳雖與人乳較為相似但不能完全代替人乳。LU等[38]研究山羊初乳和常乳中乳脂肪球膜的差異蛋白質(zhì)，共鑒定出423種乳脂肪球膜蛋白，其中189種在初乳與常乳中豐度差異顯著。初乳中急性時相蛋白的含量明顯高于常乳，另外在初乳與常乳中均觀察到與長期抑郁癥相關的LTD蛋白質(zhì)。

YANG等[39]采用iTRAQ技術研究了荷斯坦牛乳、澤西島牛乳、牦牛乳、水牛乳、山羊乳、駱駝乳、馬乳和人乳中的乳脂肪球膜蛋白的組成。共鑒定出520種蛋白質(zhì)，其中僅18種蛋白質(zhì)在這些哺乳動物中不存在差異。經(jīng)過主成分分析和聚類分析，最后認為駱駝乳、馬乳與人乳的乳脂肪球膜蛋白組成相似，更有望成為人乳替代品為嬰幼兒提供營養(yǎng)。趙小偉等[40]在奶牛和山羊乳脂肪球膜蛋白中分別鑒定出284和334種蛋白質(zhì)，且奶牛與山羊乳中蛋白質(zhì)參與生物學過程的模式非常相似，而在分子功能與所涉及生物學通路上存在差異。SUN等[41]研究了關中山羊和荷斯坦奶牛成熟乳中乳脂肪球膜蛋白，分別鑒定出593和349種蛋白質(zhì)，雖然兩者均含有豐富的磷蛋白、膜相關蛋白和乙?；嚓P蛋白，但蛋白的種類、功能和生物途徑上存在差異。

以上研究多集中于不同畜種間乳脂肪球膜蛋白的差異研究，旨在對其分子結(jié)構(gòu)、表達模式、生物學功能進行更為詳細的表征與注釋，為開發(fā)與利用奠定基礎。

2.2 利用蛋白質(zhì)組學技術研究乳清蛋白

關于乳清蛋白的研究以羊乳居多，除此之外這些研究基于乳清蛋白獨特的生物學功能，比較了不同乳源下乳清蛋白的差異，并對不同健康狀態(tài)與產(chǎn)奶量的動物乳清蛋白進行比較，旨在尋找與之相關的蛋白質(zhì)，為乳房炎快檢及選育優(yōu)質(zhì)乳源提供生物標記。

2.3 利用蛋白質(zhì)組學技術研究不同加工方式下的乳及乳制品

蛋白質(zhì)組學技術同樣運用于乳品加工條件的探索。臧長江等[46]研究發(fā)現(xiàn)75 ℃/5 s熱處理對生鮮牛乳中的蛋白質(zhì)組分及含量無明顯影響，而135 ℃/4 s和145 ℃/4 s可造成乳中蛋白質(zhì)含量的降低。乳清蛋白尤其是免疫球蛋白的熱穩(wěn)定性相對較差，這與劉翠等[47]對山羊乳研究的結(jié)果相似。劉鳴暢等[48]研究不同熱加工條件對牛乳主要蛋白質(zhì)成分與含量的影響，結(jié)果表明，隨著加熱強度增加，蛋白質(zhì)著色點變淺，鮮乳、巴氏乳蛋白點光密度值明顯高于超高溫瞬時滅菌乳和復原乳，對這些蛋白點進行質(zhì)譜分析，鑒定出α-S1酪蛋白、α-S2酪蛋白、β-酪蛋白、β-乳球蛋白、κ-酪蛋白、乳糖脫氫酶A蛋白。另外，復原乳在不同熱處理條件下，隨著溫度升高，蛋白著色點變淺，蛋白點出現(xiàn)模糊、拖帶現(xiàn)象，部分蛋白異構(gòu)體增多。FELFOUL等[49]對熱處理下駱駝乳與奶牛乳進行蛋白組學分析，結(jié)果表明在80 ℃下加熱60 min后，駱駝乳和牛乳酪蛋白組分保持完整，而乳清蛋白受到較大影響。駱駝乳中α-乳清蛋白和肽聚糖識別蛋白未能被檢出，血清白蛋白含量則顯著減少。而牛乳中未檢測到α-乳清蛋白和β-乳球蛋白。CHEN等[33]通過LC/MS研究山羊乳蛋白的熱依賴性變化，對高溫短時、超巴氏殺菌、超高溫和低溫長時間加熱處理的山羊乳進行蛋白質(zhì)組學分析。所有樣品中共鑒定出843種蛋白質(zhì)，在對照組和加熱組中分別定量了527、543、537、533和539種蛋白質(zhì)，其中共同蛋白質(zhì)438種。該團隊也采用同樣的技術手段研究了山羊奶在均質(zhì)化過程中蛋白質(zhì)的變化[28]。對照組和均質(zhì)化組分別量化了310、315種蛋白質(zhì)，其中16種蛋白質(zhì)在兩組之間有顯著差異。在均質(zhì)化處理組中發(fā)現(xiàn)與山羊乳糖酵解/糖異生代謝相關的蛋白質(zhì)發(fā)生了顯著變化。這些發(fā)現(xiàn)為熱處理和均質(zhì)羊乳的蛋白質(zhì)特征提供了最新信息。

不同加工條件下乳蛋白質(zhì)研究中以加熱條件為主，采用色譜與質(zhì)譜聯(lián)用，旨在探究生產(chǎn)過程中合適的加工參數(shù)，以減少加工過程中蛋白質(zhì)的損失，提高乳制品的營養(yǎng)價值。盡管存在畜種差異，但熱加工對乳清蛋白均造成了不同程度的影響。

2.4 利用蛋白質(zhì)組學技術研究發(fā)酵乳制品

干酪是牛乳經(jīng)凝乳并排出部分乳清而制成的新鮮或發(fā)酵成熟的產(chǎn)品，富含多種營養(yǎng)成分，并可有效緩解乳糖不耐癥。干酪作為發(fā)達國家的膳食主體，占其全部乳品消耗量的60%[50]，國外對干酪已有了較為深入的研究。JARDIN等[21]分別選取2種干酪成熟期間3個時間點的水溶性提取物中蛋白質(zhì)進行研究，鑒定了多種來自牛乳與細菌的蛋白質(zhì)。結(jié)果顯示,2種干酪既擁有部分共同的牛乳蛋白質(zhì)，也存在部分相同的細菌蛋白質(zhì)。成熟期間細菌蛋白質(zhì)的濃度從成熟的第7天至第69天增加2.5～20倍。PETRELLA等[31]利用蛋白質(zhì)組學方法研究河水牛mozzarella干酪中蛋白質(zhì)水解，對60個市面mozzarella干酪和10個標準mozzarella干酪進行分析，結(jié)果顯示市面干酪中大部分酪蛋白含量偏多，表明在儲存過程中纖溶酶引起了劇烈的蛋白質(zhì)水解，或是由于使用劣質(zhì)半成品進行干酪制作所致。PAPPA等[51]分析了由綿羊乳、山羊乳和牛乳制備的成熟120 d后的Teleme干酪水溶性提取物中的組成肽和蛋白質(zhì)，結(jié)果表明,綿羊乳干酪和山羊乳干酪的水溶性提取物中蛋白濃度沒有顯著差異，且均高于牛乳干酪，而綿羊乳干酪水溶性提取物相比山羊乳和牛乳干酪，能提供更廣譜的肽。

IZOUIERDO-GONZALEZ等[52]對山羊乳開菲爾酸乳制品3個發(fā)酵時間點的蛋白質(zhì)消化與生物活性肽進行了研究，以探究發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)的消化模式，最后在對應的22個注釋蛋白質(zhì)下鑒定出2 328個特異性肽，并在發(fā)酵24 h時發(fā)現(xiàn)了肽的最高濃度，鑒定出了11個屬于酪蛋白的生物活性肽。

這些研究通過比較不同類型干酪的蛋白質(zhì)差異、干酪成熟期間微生物蛋白質(zhì)變化以及儲存過程中蛋白質(zhì)的水解，借此為干酪的生產(chǎn)與摻假檢測提供理論基礎。這也為我國豐富的乳制品尤其是具有民族特色的發(fā)酵乳制品的深入研究提供了方向與思路。而隨著發(fā)酵乳制品走入我國人民的日常生活，對其進行深入研究也是工業(yè)發(fā)展的必然要求。

3 展望

目前，蛋白質(zhì)組學在乳及乳制品中的應用主要集中于原料乳，著重研究不同品種乳間差異蛋白質(zhì)。受分離技術的限制，研究對象多為高豐度乳源蛋白，對于乳中具有特異生物活性功能的低豐度乳蛋白和對乳品質(zhì)有影響的微生物蛋白研究報道較少。而隨著研究深入，發(fā)酵或保藏期間乳及乳制品受微生物影響，特別是其中蛋白質(zhì)的變化已逐漸成為目前研究的難點與重點。探索新的蛋白質(zhì)分離技術，揭示乳體系與微生物之間關系，蛋白組學將成為有力的工具。另外，蛋白質(zhì)組學與基因組學、轉(zhuǎn)錄組學、代謝組學的聯(lián)合分析將對揭示微生物與乳環(huán)境之間的關系起到重要作用，多組學聯(lián)合技術將在工業(yè)生產(chǎn)領域發(fā)揮其獨特的優(yōu)勢。