李亞會，周偉，李積華*，龔霄，曹玉坡，陸旭麗

（1.中國熱帶農業(yè)科學院農產品加工研究所農業(yè)農村部熱帶作物產品加工重點實驗室，廣東 湛江 524001；2.海南省果蔬貯藏與加工重點實驗室，廣東 湛江 524001）

羅非魚是我國主要的養(yǎng)殖水產品種，具有生長快、抗逆性強、易養(yǎng)殖、產量高等特點，是我國重點科研培養(yǎng)的淡水養(yǎng)殖魚類，被譽為未來動物性蛋白質的主要來源之一[1]。羅非魚屬于高蛋白低脂肪的優(yōu)質蛋白來源，具有極高的營養(yǎng)價值[2]。為充分利用這些優(yōu)質蛋白質，采用酶解法得到的魚蛋白酶解液富含生物活性肽和氨基酸，所含必需氨基酸比例適當，且富含礦物質和微量元素，能被人體腸道直接吸收，是高檔食品和營養(yǎng)補充劑[3]。魚蛋白酶解液雖然營養(yǎng)豐富，但通常都具有較重的腥異味[4]，直接影響著水產蛋白的應用前景，因此如何去除腥味成為水產制品迫在眉睫的任務。

目前水產制品脫腥的研究方法較多[5]，主要包括化學法脫腥[6]、物理法脫腥[7]和微生物脫腥[8]等?；瘜W脫腥法是利用酸堿物質進行反應，容易產生化學物質殘留，存在食品安全隱患。物理脫腥法一般是添加生姜、活性炭[9]和環(huán)狀糊精[10]等進行吸附或包埋，脫腥效果持續(xù)時間較短。微生物脫腥法是利用微生物發(fā)酵技術除去腥味成分和異味的方法，是一種綠色的有發(fā)展前景的脫腥方法[11]。微生物發(fā)酵菌種主要有酵母[12]、乳酸菌[13]、李斯特菌等。如曾少葵等[14]采用不同的菌種對羅非魚下腳料蛋白酶解液進行脫腥，通過感官評定比較發(fā)現乳酸菌的脫腥效果較好；段振華等[10]研究發(fā)現，采用酵母和β-糊精復合脫腥方法對羅非魚碎魚肉酶解液也具有一定的脫腥效果。酵母發(fā)酵在水產制品脫腥工藝中研究較多，但對脫腥后的揮發(fā)性風味物質研究較少[15]。

本研究以腥味值和DPPH自由基清除率為評價指標，通過正交試驗優(yōu)化酵母發(fā)酵脫腥工藝條件。選擇最優(yōu)組為試驗組，進一步采用氣相色譜-質譜聯用（gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS）技術對酶解液發(fā)酵前后的風味成分進行比較，篩選出差異較大的揮發(fā)性物質，在分子水平上探索其酵母發(fā)酵脫腥的作用機理。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

羅非魚：湛江市東風市場，動物蛋白水解酶（14.5 U/g）、酵母DV-10、DPPH（分析純）：湛江科銘有限公司。

1.2 儀器與設備

QP2010-plus GC-MS聯用儀：日本島津；FA2104A分析天平：上海天平儀器廠；SHZ-B水浴恒溫振蕩器：佳美儀器公司（江蘇）；QL-901混合器：精科實業(yè)有限公司（上海）；3-30K高速冷凍離心機：美國sigma公司；UV8000紫外分光光度計：上海元析儀器有限公司；FD-U1100冷凍干燥機：東京理化公司；GB-SS-1500G超聲波均質系統(tǒng)：上海禾工科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

新鮮羅非魚，手動去皮、去內臟，清洗干凈后，用絞肉機絞碎成均勻糜狀，用保鮮袋包裝，儲存于-20℃，備用。

1.3.2 羅非魚酶解液的制備

準確稱量冷凍的羅非魚魚肉約10 g于150 mL錐形瓶中，以料液比1∶（g/mL）加入超純水，均質器攪拌均勻，再加動物蛋白水解酶0.3%，在50℃恒溫振蕩3 h后，100℃水浴鍋中滅酶10 min，快速冷卻后于10 000 r/min離心15 min，取上清液即得酶解液[16]。

1.3.3 發(fā)酵脫腥的單因素試驗

以腥味值和DPPH自由基清除率為指標，考察酵母添加量（g/L）、發(fā)酵時間（h）和發(fā)酵溫度（℃）3個因素對羅非魚酶解液脫腥效果的影響[17]，以確定后續(xù)正交試驗各因素水平。

1.3.3.1 不同酵母添加量對羅非魚酶解液脫腥效果的影響

分別選擇 3、5、7、9、11 g/L 的酵母添加量進行測定。具體方法：準確稱量酵母粉后將其加入已經制備好的羅非魚酶解液中，攪拌均勻，放置在30℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)1.5 h后取出，于10 000 r/min離心15 min，取上清液檢測其腥味值及DPPH自由基清除能力。

1.3.3.2 不同發(fā)酵時間對羅非魚酶解液脫腥效果的影響

分別選擇 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h 的發(fā)酵時間進行測定，操作方法同1.3.3.1。

1.3.3.3 不同發(fā)酵溫度對羅非魚酶解液脫腥效果的影響

分別選擇 25、30、35、40、45 ℃的發(fā)酵溫度進行測定，操作方法同1.3.3.1。

1.3.4 發(fā)酵脫腥工藝優(yōu)化

根據單因素試驗結果，以酵母添加量、發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度為因素，設計三因素三水平正交試驗，進一步優(yōu)化發(fā)酵法脫腥的工藝參數。試驗因素水平見表1。

表1 正交因素水平Table 1 Design of orthogonal experiment

1.3.5 腥味感官評價

由經過感官評定訓練的10個感官評定員（5男5女，22歲～30歲）組成評定小組，將30 mL樣品裝在100mL密閉錐形瓶中，密封平衡0.5 h。采用5分制評定腥味強度，0分為最弱，5分為最強，最后得分取平均值。

1.3.6 氣相色譜-質譜（GC-MS）

GC條件：色譜柱Rtx-5 ms（30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣為 He，流速 0.9 mL/min，進樣口溫度為250℃，不分流；程序升溫初始溫度為40℃，保持3 min，以5℃/min升至90℃，再以10℃/min升至230℃，保持 7 min[18]。

MS條件：離子化方式為電子轟擊離子源（electron impactionsource，EI），電子能量 70eV，發(fā)射電流 80μA，接口溫度250℃，離子源溫度200℃，檢測電壓1000V，質量掃描范圍m/z 33～450[19]。

1.3.7 數據處理

采用Excel及SPSS19數據分析軟件對數據進行處理。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵脫腥的單因素與正交試驗結果

2.1.1 酵母添加量的影響

不同酵母添加量對羅非魚酶解液脫腥效果和DPPH自由基清除率的影響見圖1。

酵母發(fā)酵對水產蛋白酶解液脫腥效果較好[20-21]，其主要是脫除原料中的小分子腥味物質，但對其生物活性影響不明確，因此有必要對脫腥之后的抗氧化活性進行探討[22]，故選擇腥味值和DPPH自由基清除率為指標進行分析。由圖1可知，隨著酵母添加量的增加，腥味值呈現先減少后逐漸趨于平緩的趨勢，當酵母添加量為7 g/L時，其腥味值約為2.1，感官評價顯示腥味較弱，繼續(xù)加大酵母添加量，腥味值趨于平衡；隨著酵母添加量的增加，其DPPH自由基清除率整體先增加后降低，其可能原因是酵母利用活性蛋白組分作為發(fā)酵底物，酵母添加量過大，從而降低其抗氧化活性，使得DPPH自由基清除率降低，根據腥味值和DPPH自由基清除率綜合判斷，初步選定酵母添加量5、7、9 g/L作為正交試驗的因素水平。

圖1 不同酵母添加量對羅非魚酶解液腥味值和DPPH自由基清除率的影響Fig.1 Effect of different addition of yeast on fishy value and DPPH free radical scavenging rate of tilapia hydrolysate

2.1.2 發(fā)酵時間的影響

不同發(fā)酵時間對羅非魚酶解液脫腥效果和DPPH自由基清除率的影響見圖2。

圖2 不同發(fā)酵時間對羅非魚酶解液腥味值和DPPH自由基清除率的影響Fig.2 Effect of different fermentation time on fishy value and DPPH free radical scavenging rate of tilapia hydrolysate

由圖2可知，隨著發(fā)酵時間的增加，腥味值先減少后趨于平緩，當發(fā)酵時間達到1.5 h時，其腥味值約為1.88，感官評價顯示略有腥味，繼續(xù)延長發(fā)酵時間，發(fā)現其腥味值變化較??；隨著發(fā)酵時間的增加，其DPPH自由基清除率先增加后降低，發(fā)酵時間達到1.5 h時，DPPH自由基清除率最高為87.15%，繼續(xù)延長發(fā)酵時間，其DPPH自由基清除率有所下降，但高于未脫腥時的清除率，說明發(fā)酵時間在2.5 h以內均能提高其抗氧化活性，綜合分析，初步選定發(fā)酵時間1.0、1.5、2.0 h作為正交試驗的因素水平。

2.1.3 發(fā)酵溫度的影響

不同發(fā)酵溫度對羅非魚酶解液脫腥效果和DPPH自由基清除率的影響見圖3。

圖3 不同發(fā)酵溫度對羅非魚酶解液腥味值和DPPH自由基清除率的影響Fig.3 Effect of different fermentation temperature on fishy value and DPPH free radical scavenging rate of tilapia hydrolysate

由圖3可知，隨著發(fā)酵溫度的增加，腥味值先減少后慢慢趨于平緩，當溫度達到35℃時，其腥味值約為2.1，感官評價顯示略有腥味，繼續(xù)提高溫度，發(fā)現其腥味值趨于平衡；其DPPH自由基清除率隨著發(fā)酵溫度升高先增加后降低，當溫度達到30℃，DPPH自由基清除率最高為87.69%，繼續(xù)升高發(fā)酵溫度后，其DPPH自由基清除率有所下降，但均高于未脫腥組。綜合分析，初步選定發(fā)酵溫度25、30、35℃作為正交試驗的因素水平。

2.1.4 正交試驗設計與結果

正交試驗結果見表2。

由表2可知，極差分析結果得到影響腥味值的主次順序為A＞B＞C，最優(yōu)組合為A3B3C2；影響DPPH自由基清除率的主次順序為A＞B＞C，最優(yōu)組合為A2B2C2；結合實際綜合考慮兩個指標，選擇A2B2C2為最優(yōu)組合。經驗證試驗得到A2B2C2條件下的腥味值為1.8，DPPH自由基清除率為86.96%，綜合腥味值和DPPH自由基清除率兩個指標，該結果優(yōu)于正交試驗其它組合。因此得到最佳脫腥工藝為酵母添加量7 g/L，發(fā)酵時間1.5 h，發(fā)酵溫度30℃。

2.2 羅非魚酶解液脫腥前后揮發(fā)性成分分析

氣相色譜-質譜聯用是最常用的揮發(fā)性風味分析方法，在魚、對蝦、牡蠣等水產制品的風味分析中應用非常廣泛。根據GC-MS結果分析，由NIST 98質譜數據庫檢索[23]，酵母脫腥前后分別檢出68、73種成分，包括醇類、醛類、酮類、含氮化合物、烷烴類、酯類和醚類等，進一步采用峰面積歸一法[5]進行定量分析，結果見表3。

表2 正交試驗結果Table 2 Orthogonal test results

表3 酶解液脫腥前后的揮發(fā)性成分的種類及相對含量Table 3 Types and relative contents of volatile components before and after deodorization of enzymatic hydrolysate

根據表3可知，羅非魚酶解液脫腥前后相對含量差異較大的物質為醛類、醇類、酮類、烷烴及含氮化合物，醚類、烯烴、酸類、酯類相對含量差異較小。其中醛類由49.17%降為16.43%；醇類由原來的26.63%增加到55.91%；酮類及含氮化合物有一定的降低；烷烴類物質含量由2.45%增加到12.81%，由于烷烴類閾值較高，其含量與貢獻閾值不成正比，不作為主要研究物質類別，這一結果與麥雅彥等[24]的研究一致。根據種類和其相對含量能大致分析風味物質的變化，但是很難分辨出它們之間的具體差異，因此進一步研究脫腥前后相對含量有較大差異的醛類及醇類物質，對其風味特征、相對含量、保留時間進行單獨分析，其結果如表4所示。

表4 揮發(fā)性成分的主要物質的保留時間及相對百分含量Table 4 Retention time and relative percentage of the main substances of volatile components

2.2.1 醇類物質

根據表4可知，羅非魚酶解液主要醇類物質為乙醇、庚醇、1-辛烯-3-醇、辛烯醇、沉香醇。根據其風味特征，判定其表現為愉悅的香氣，說明這5種物質能在一定程度上增加羅非魚酶解液的香氣。王紅麗等[25]通過釀酒酵母J4對海帶進行脫腥處理后，檢測到具有花香味的苯乙醇，該物質是釀酒酵母J4發(fā)酵產生的特征醇類物質。本研究中經酵母發(fā)酵脫腥處理后醇類物質含量明顯增加，其中增加較大的為乙醇，含量高達16.10%，其可能原因是所采用的酵母為釀酒酵母，乙醇為其主要的特征醇類物質，具有愉快的香氣，與趙亮等[26]的研究結果相似；具有芳香味的庚醇相對含量由3.00%增加到9.47%，能產生較為柔和的氣味；1-辛烯-3-醇和辛烯醇為不飽和醇，經過脫腥后含量均減少，該結果與崔方超等[17]研究發(fā)現魚肉中的1-辛烯-3-醇、2-癸烯-1-醇等醇類物質經脫腥后均有明顯的減少結論相同；脫腥后檢測到具有玫瑰花香味的沉香醇[27]。醇類物質整體上產生愉悅的香氣[28]，能掩蓋不良風味物質，因此對腥味有一定的掩蓋作用。

2.2.2 醛類物質

醛類物質在水產特征性風味中起到主要作用，周益奇等[20]采用蒸餾萃取結合氣質聯用方法初步判定己醛、庚醛和2，4-二烯癸醛為魚腥味的主要化合物。表4顯示羅非魚酶解液中主要醛類物質為庚醛、2-庚醛、苯甲醛、辛醛、辛烯醛、壬醛、癸烯醛、癸二烯醛、十一碳烯醛，共9種。酵母脫腥處理后，未檢測到庚醛、2-庚醛、十一碳烯醛，其它醛類物質含量均減少。其中庚醛和2-庚醛的風味特征顯示為不愉悅的氣味[29]，與Zhao等[30]研究結果相似。具有苦杏仁味的苯甲醛含量由1.80%降為0.36%；具有蘑菇香味的壬醛相對含量由8.93%降低為4.86%；辛烯醛、癸烯醛、癸二烯醛為不飽和醛類，脫腥后含量均減少，其風味特征顯示為不愉悅氣味[17]。Sae-leaw等[31]以沙丁魚為原料，用GC-MS分析結果表明，3，5-辛二烯醛、2，4-庚二烯醛、2，4-癸二烯醛和2，4，7-癸三烯醛等是形成沙丁魚特征腥味的主要成分，本研究與該結論相似。醛類物質為主要的水產品風味物質，通過酵母脫腥后，醛類物質種類及相對含量均減少，說明發(fā)酵能較好地脫除酶解液中的腥味物質。

3 結論

通過單因素和正交試驗優(yōu)化羅非魚酶解脫腥工藝，得到最優(yōu)脫腥條件：酵母的添加量為7 g/L、發(fā)酵時間為1.5 h、發(fā)酵溫度為30℃，在該條件下腥味值為1.8，DPPH自由基清除率為86.96%。采用GC-MS探究羅非魚酶解液脫腥前后的揮發(fā)性成分，著重分析差異較大的醛類和醇類，其主要揮發(fā)性物質為庚醛、2-庚醛、苯甲醛、辛醛、辛烯醛、壬醛、癸烯醛、癸二烯醛、庚醇、1-辛烯3-醇、辛烯醇等。根據揮發(fā)性物質產生的香氣特征及其相對含量，對比發(fā)酵前后，發(fā)現酵母發(fā)酵顯示較好的脫腥效果。本研究為羅非魚的附加值提升和水產品精深加工提供有力的理論依據。