曹春

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)，是心血管疾病系統(tǒng)的終末階段[1]。心血管系統(tǒng)疾病致死率很高，所以目前臨床上急需新的、有較好價(jià)值的生物診斷指標(biāo)。外泌體miRNA有高度的生物學(xué)穩(wěn)定性，儲(chǔ)存在-70℃ 1個(gè)月，其基因表達(dá)譜仍然具有研究?jī)r(jià)值[2]，且外泌體miRNA具有耐酸性質(zhì)。有研究顯示，外泌體中miR-194、miR-192在急性心肌梗死后期、心力衰竭早期表達(dá)水平明顯上升，外泌體miRNA與心力衰竭早期左心室的舒張功能相關(guān)，所以外泌體miRNA可能是心力衰竭早期的診斷標(biāo)志物[3]。另有報(bào)道m(xù)iR-184在心血管疾病、結(jié)腸癌疾病、肺癌等疾病中都具有抑制作用[4]。然而，外泌體miR-214-3p、miR-184在心力衰竭中研究報(bào)道較少。本研究擬探討miR-214-3p、miR-184在CHT患者血漿外泌體表達(dá)情況，并分析其與CHT的關(guān)系，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016至2018年在本院就診的CHF患者106例(心衰組)，其中男57例，女49例；年齡54～89歲，平均年齡(70.90±11.90)歲；另外選取本院健康體檢者127例(對(duì)照組)，其中男62例，女65例；年齡53～87歲，平均年齡(68.70±12.80)歲。本研究通過倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者知情同意并簽署臨床研究協(xié)議書，符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 心力衰竭納入標(biāo)準(zhǔn)：①參照《中國(guó)心力衰竭診斷和治療指南2014》，診斷明確的慢性心力衰竭。②符合紐約心臟協(xié)會(huì)心功能分級(jí)(NYHA心功能分級(jí))，Ⅰ級(jí)：體力活動(dòng)不受限制；Ⅱ級(jí)：體力活動(dòng)輕度受限；Ⅲ級(jí)：體力活動(dòng)明顯受限；Ⅳ級(jí)：不能從事任何體力活動(dòng)。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：伴有肺源性心臟病、風(fēng)濕性心臟病、嚴(yán)重內(nèi)分泌疾病、嚴(yán)重肝腎功能異常、嚴(yán)重的感染性疾病、妊娠、血液透析、惡性疾病者。

1.3 儀器與試劑 外泌體抽提試劑盒，美國(guó)Invitrogen公司；miRcute miR親和柱，北京天根生化有限公司；引物，上海生工生物公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒，日本TaKaRa公司；低速離心機(jī)，美國(guó)賽默飛世爾公司；-80℃超低溫冰箱，上海生工生物公司；熒光定量PCR儀，美國(guó)Bio-Rad公司；貝克曼生化分析儀，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司；iu22心臟彩色多普勒超聲，荷蘭飛利浦電子集團(tuán)。

1.4 研究方法

1.4.1 樣品采集與保存:入院治療CHF患者及健康體檢者晨起后，空腹抽靜脈血5 ml，裝于EDTA-K2抗凝管中，置于4℃、3000×g，半徑10 cm，離心5 min，分離血漿。將樣品備份保存于-80℃超低溫冰箱中。

1.4.2 熒光定量PCR檢測(cè)血漿外泌體miR-214-3p、miR-184的表達(dá):按照外泌體提取試劑盒指示說明，提取樣本血漿中外泌體。使用天根公司miRcute miR親和柱提取和純化外泌體小RNA。將純化好的樣品miRNA裝于200 μl無RNA酶EP管中，用15 μl無RNA酶ddH2O溶解。備份保存于-80℃超低溫冰箱中。分光光度計(jì)檢測(cè)產(chǎn)物的OD260/OD280，取OD260/OD280值介于1.9～2.1進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。miR-214-3p、miR-184及內(nèi)參基因U6引物序列由上海生工合成。將得到的cDNA反應(yīng)液作為模板，以U6作為內(nèi)參進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)。qRT-PCR反應(yīng)體系20 μl：2×UltraSYBR Mixture 10.0 μl，Template cDNA(50 ng/μl)2.0 μl，F(xiàn)orward Primer 1.0 μl，Reverse Primer 1.0 μl，ddH2O 6.0 μl。反應(yīng)條件：95℃，3 min；95℃，25 s；62℃，20 s；72℃，15 s；35個(gè)循環(huán)。對(duì)miR-214-3p、miR-184相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCT法計(jì)算。見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4.3 相關(guān)臨床指標(biāo)檢測(cè):①超聲心動(dòng)圖:檢測(cè)所有受試者，進(jìn)行心臟超聲檢測(cè)，檢測(cè)項(xiàng)目包括左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、左心室短軸縮短率(FS)、左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)等。②血漿腦鈉肽(BNP)水平:所有受試者清晨空腹抽靜脈血6 ml，室溫靜置35 min，于4℃、3000×g離心10 min，分離血清，使用貝克曼生化分析儀測(cè)定血漿BNP水平。

2 結(jié)果

2.1 2組一般資料比較 與對(duì)照組比較，心衰組年齡、性別比、糖尿病、高血壓比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，心衰組FS、LVEF水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，心衰組BNP、LVEDD、顯著高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 2組臨床資料比較

2.2 2組血漿外泌體中miR-214-3p、miR-184表達(dá) 與對(duì)照組比較，心衰組患者血漿外泌體中miR-184表達(dá)水平顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，miR-214-3p表達(dá)水平顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 CHF患者血漿外泌體中miR-214-3p、miR-184表達(dá)水平

2.3 不同心功能分級(jí)患者血漿外泌體miR-214-3p、miR-184表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)不同心功能分級(jí)患者血漿外泌體miR-214-3p表達(dá)水平依次升高，miR-184表達(dá)水平依次降低，兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 不同心功能分級(jí)患者miR-214-3p、miR-184表達(dá)水平

2.4 不同心功能分級(jí)患者BNP、LVEDD、FS、LVEF水平比較 與對(duì)照組比較，Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)不同心功能分級(jí)患者LVEDD、血漿BNP水平依次升高，兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，F(xiàn)S、LVEF水平依次降低(P<0.05)。見表5。

表5 4組患者BNP、LVEDD、FS、LVEF水平比較

2.5 Pearson相關(guān)分析 Pearson相關(guān)分析顯示，CHF組血漿外泌體miR-214-3p表達(dá)水平與BNP、LVEDD呈正相關(guān)(P<0.05)，與LVEF呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)；miR-184表達(dá)水平與BNP、LVEDD呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與LVEF呈正相關(guān)(P<0.05)。見表6。

表6 血漿外泌體中miR-214-3p、miR-184水平與臨床指標(biāo)相關(guān)性分析

3 討論

CHF是各種心血管疾病發(fā)展的終末階段。研究表明，miRNA在糖尿病性心肌病的發(fā)生及脂肪分化中均具有重要作用[5,6],因此研究miRNA表達(dá)水平對(duì)臨床CHF早期診斷意義重大。

BNP與心功能有密切關(guān)系，邸玉青[7]證實(shí)BNP在心力衰竭患者血漿中濃度隨心功能等級(jí)遞增(NYHA心功能分級(jí)Ⅰ～Ⅳ)逐漸增加。本研究發(fā)現(xiàn)，BNP在CHF血漿中水平顯著升高。BNP的分泌主要與左心室壁張力有關(guān)，張惠敏[8]發(fā)現(xiàn)心力衰竭患者LVEF的降低程度與BNP分泌顯著相關(guān)，外周血血漿BNP水平可反映LVEF損害程度。王小燕等[9]發(fā)現(xiàn)在NYHA Ⅲ、Ⅳ級(jí)CHF患者LVEDD水平顯著高于NYHA Ⅰ、Ⅱ級(jí)患者，F(xiàn)S水平顯著低于Ⅰ、Ⅱ級(jí)患者。本研究發(fā)現(xiàn)Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級(jí)不同心功能分級(jí)CHF患者LVEF、FS水平呈下降趨勢(shì)，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級(jí)不同心功能分級(jí)CHF患者LVEDD水平呈遞增趨勢(shì)，提示CHF患者心室均存在不同程度損傷。

Zhou等[10]研究發(fā)現(xiàn)miR-184通過與lncRNA UCA1競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合靶位點(diǎn)，促進(jìn)心臟肥大疾病發(fā)生，且miR-184表達(dá)水平與心臟肥大患者心肌細(xì)胞中的lncRNA UCA1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。Huang等[11]利用大鼠研究實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-184在紫紺型先天性心臟病缺氧性心肌細(xì)胞中表達(dá)水平下調(diào)，因此可能減少心肌細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的凋亡。在臨床上，Gurha等[12]研究發(fā)現(xiàn)miR-184在幼兒胚胎心臟中表達(dá)最高，在成人心肌細(xì)胞中最低。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-184在CHF組血漿外泌體中表達(dá)水平顯著下降，提示miR-184可能參與CHF疾病發(fā)生。miR-184表達(dá)水平隨CHFⅡ級(jí)、Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)不同心功能分級(jí)增加而減少，進(jìn)一步相關(guān)性分析顯示，miR-184表達(dá)水平與BNP、LVEDD存在負(fù)相關(guān)性，與LVEF存在正相關(guān)性，提示miR-184可能與CHF患者心功能損傷程度有關(guān)。

有研究顯示腫瘤細(xì)胞的發(fā)育、分化及乳腺癌、胰腺癌等疾病與miRNA-214表達(dá)異常有密切關(guān)系，可作為腫瘤診斷的分子標(biāo)志物[13]。Onrat等[14]發(fā)現(xiàn)，miR-214-3p在缺血性擴(kuò)張型心肌病和特發(fā)性擴(kuò)張型心肌病血清中表達(dá)水平呈升高趨勢(shì)。Yan等[15]發(fā)現(xiàn)miR-214-3p在心臟衰竭患者成人心臟心肌細(xì)胞中表達(dá)水平較胎兒時(shí)期低。本研究顯示miR-214-3p在心衰組血漿外泌體中表達(dá)水平顯著上升，且miR-214-3p表達(dá)水平隨CHFⅡ、Ⅲ、Ⅳ級(jí)不同心功能分級(jí)增加而增加。相關(guān)性分析顯示，miR-214-3p表達(dá)水平與BNP、LVEDD呈正相關(guān)，與LVEF呈負(fù)相關(guān)，提示miR-214-3p與CHF患者心功能有關(guān)，可能參與調(diào)節(jié)CHF發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，miR-184在CHF患者血漿外泌體呈低表達(dá)，miR-214-3p呈高表達(dá)，與患者心功能有關(guān)，可能參與CHF疾病發(fā)生發(fā)展。本研究超聲心動(dòng)圖檢查結(jié)果會(huì)受到儀器的敏感度、檢查者的技術(shù)等影響，患者心功能等級(jí)劃分是由臨床醫(yī)師執(zhí)行，二者均存在一定的不足，miR-184、miR-214-3p成為生物學(xué)標(biāo)志物尚需更多臨床研究。