竇越超 王雪飛

糖尿病性骨質(zhì)疏松癥(diabetes osteoporosis，DOP)是糖尿病的一種并發(fā)癥，是由于血糖升高導(dǎo)致骨組織代謝紊亂而引起的骨組織結(jié)構(gòu)破壞、骨量減少、骨脆性增加、易引發(fā)骨折為特征的全身性骨骼疾病，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，目前尚無(wú)有效藥物治療DOP，亟需開發(fā)新的治療藥物和方法[1]。成骨細(xì)胞是促進(jìn)骨形成的主要功能細(xì)胞，成骨細(xì)胞凋亡是引起骨質(zhì)疏松的重要原因，研究成骨細(xì)胞的凋亡機(jī)制對(duì)預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥具有重要意義[2]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)參與了多種生物學(xué)過(guò)程，與骨質(zhì)疏松也密切相關(guān)，可作為骨質(zhì)疏松(osteoporosis，OP)骨代謝過(guò)程中的生物標(biāo)志物，為OP診斷、治療及判斷預(yù)后提供新的靶標(biāo)[3]。有研究報(bào)道rs3820282是染色體1p36.12上具有最強(qiáng)子宮內(nèi)膜異位癥風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)，通過(guò)細(xì)胞分裂周期蛋白42(cell division cycle protein 42，CDC42)和LINC00339的反向調(diào)節(jié)起作用[4]。染色體1p36.12的骨質(zhì)疏松癥風(fēng)險(xiǎn)SNP rs6426749-G等位基因可以提高LINC00339的表達(dá)，而LINC00339的下調(diào)可促進(jìn)骨代謝關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子CDC42的表達(dá)，表明LINC00339可能與骨質(zhì)疏松癥有關(guān)[5]。但目前筆者未發(fā)現(xiàn)LINC00339對(duì)成骨細(xì)胞生物行為的影響及其機(jī)制還未有研究。研究發(fā)現(xiàn)miR-195-5p通過(guò)靶向成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(fibroblast growth factor 2，F(xiàn)GF2)抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其可作為子宮內(nèi)膜癌的治療靶點(diǎn)[6]。上調(diào)miR-195-5p通過(guò)降低其靶基因骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體-1α(bone morphogenetic protein receptor-1α，Bmpr1α)的表達(dá)可降低骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成脂分化，改善骨質(zhì)疏松癥狀[7]。本實(shí)驗(yàn)旨在研究LINC00339和miR-195-5p對(duì)成骨細(xì)胞增殖、凋亡的影響及LINC00339是否通過(guò)調(diào)控miR-195-5p影響成骨細(xì)胞的增殖和凋亡。為骨質(zhì)疏松的預(yù)防和治療提供新思路和新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料 成骨細(xì)胞hFOB1.19購(gòu)自上海通派生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Lipofectamine TM 2000轉(zhuǎn)染試劑盒、RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；二辛可寧酸(BCA)試劑盒、聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)、十二烷基硫酸鈉，鈉鹽-聚丙烯酰胺凝膠電泳(dodecyl sulfate,sodium salt-Polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)試劑盒、四甲基偶氮唑鹽(MTT)試劑盒、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙錠(PI)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；抗體均購(gòu)自北京博奧森生物科技有限公司；載體質(zhì)粒均購(gòu)自上海斯信生物科技有限公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司。Bio-Rad2550型全自動(dòng)酶標(biāo)儀、FACSCanto Ⅱ流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組:將hFOB1.19細(xì)胞在37℃的培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，每隔2～3 d傳代1次，將融和至80%的細(xì)胞無(wú)血清饑餓培養(yǎng)24 h，用終濃度為22 mmol/L的葡萄糖溶液培養(yǎng)細(xì)胞48 h作為高糖組，同時(shí)以終濃度為5 mmol/L的葡萄糖溶液處理作為對(duì)照組。將pcDNA3.1、pcDNA3.1-LINC00339、si-NC、si-LINC00339分別轉(zhuǎn)染至正常hFOB1.19細(xì)胞中，記為pcDNA3.1組，pcDNA3.1-LINC00339組、si-NC組、si-LINC00339組。將si-NC、si-LINC00339轉(zhuǎn)染至高糖處理的hFOB 1.19細(xì)胞中，記為高糖+si-NC組、高糖+si-LINC00339組；將si-LINC00339與anti-miR-NC、anti-miR-195-5p分別共同轉(zhuǎn)染至高糖處理的hFOB1.19細(xì)胞中，記為高糖+si-LINC00339+anti-miR-NC、高糖組+si-LINC00339+anti-miR-195-5p組；轉(zhuǎn)染按Lipofectamine TM 2000轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行。

1.2.2 熒光實(shí)時(shí)定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測(cè)miR-195-5p和LINC00339的表達(dá)水平:提取總RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照熒光定量試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行PCR，miR-195-5p和LINC00339分別以U6和GAPDH為內(nèi)參，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，循環(huán)條件為95℃ 5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；60℃延長(zhǎng)5 min。相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt法計(jì)算。miR-195-5p上游引物序列：5’-GATAGCAGCACAGAAATATTGGC-3’，下游引物序列：5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’；U6上游引物序列：5’-CTGGTAGGGTGCTCGCTT-3’，下游引物序列：5’-CGGCAGCAACTGGTGTCGTGGA-3’；LINC00339上游引物序列：5’-GGTTGACGAAGTCTGGAACG-3’，下游引物序列：5’-GCCCATCATTTCATTGGGTA-3’；GAPDH上游引物序列：5’-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3’，下游引物序列：5’-CCATGTAGTTGAGGTCAATGAAG-3’。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡(Western Blot)檢測(cè)細(xì)胞周期素D1(CyclinD1)、P21、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)表達(dá)水平:各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品用SDS-PAGE電泳轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗4℃過(guò)夜，TBST洗滌3次；加入二抗室溫孵育90 min，TBST洗滌3次，用ECL發(fā)光法染色，用ChemiDoc XRS+系統(tǒng)成像，用Quantity One凝膠分析軟件處理，檢測(cè)蛋白條帶的灰度值，蛋白相對(duì)表達(dá)水平=目的條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。每個(gè)蛋白樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.4 MTT檢測(cè)細(xì)胞活性:各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h、48 h、72 h時(shí)，每孔加入5 mg/ml MTT溶液20 μl，置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h；1 000 r/min離心10 min，吸棄培養(yǎng)液，每孔加150 μl的DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。酶標(biāo)儀上檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)的吸光度(OD)值。細(xì)胞活性(%)=實(shí)驗(yàn)組OD值/空白對(duì)照組OD值×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡:各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后用預(yù)冷的PBS漂洗2次，與500 μl的結(jié)合緩沖液混勻。先加入10 μl的Annexin V-FITC，再加入5 μl的PI，混勻后避光孵育10 min。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LINC00339對(duì)miR-195-5p的靶向調(diào)控:構(gòu)建LINC00339野生型和突變型3′UTR熒光素酶表達(dá)載體WT-LINC00339和MUT-LINC00339，用LipofectamineTM 2000將WT-LINC00339和MUT-LINC00339分別與miR-NC和miR-195-5p共轉(zhuǎn)染至轉(zhuǎn)染hFOB1.19細(xì)胞中。按照說(shuō)明書操作檢測(cè)熒光活性，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 LINC00339、miR-195-5p在高糖作用的細(xì)胞hFOB1.19中的表達(dá) 與對(duì)照組比較，高糖組細(xì)胞hFOB1.19中LINC00339表達(dá)水平顯著升高，miR-195-5p表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。在高糖作用的細(xì)胞hFOB1.19中LINC00339高表達(dá)，miR-195-5p低表達(dá)。見表1。

表1 LINC00339、miR-195-5p在高糖作用的細(xì)胞hFOB1.19中的表達(dá)

2.2 抑制LINC00339對(duì)高糖作用的細(xì)胞hFOB1.19增殖的影響 與高糖+si-NC組比較，高糖+si-LINC00339組細(xì)胞hFOB1.19中LINC00339表達(dá)水平顯著降低，Cyclin D1表達(dá)水平顯著升高，P21表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞活性顯著升高(P<0.05)。抑制LINC00339表達(dá)促進(jìn)高糖作用的細(xì)胞hFOB1.19增殖。見圖1，表2。

圖1 抑制LINC00339對(duì)高糖作用的細(xì)胞hFOB1.19增殖蛋白表達(dá)的影響；1 高糖+si-NC，2 高糖+si-LINC00339

表2 抑制LINC00339對(duì)高糖作用的細(xì)胞hFOB1.19增殖的影響

2.3 抑制LINC00339對(duì)高糖作用的細(xì)胞hFOB1.19凋亡及BMP-2的表達(dá)的影響 與高糖+si-NC組比較，高糖+si-LINC00339組細(xì)胞hFOB1.19中BMP-2、Bcl-2表達(dá)水平顯著升高，Bax表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。抑制LINC00339抑制高糖作用的細(xì)胞hFOB1.19凋亡及促進(jìn)BMP-2表達(dá)。見圖2，表2。

圖2 抑制LINC00339對(duì)高糖作用的細(xì)胞hFOB1.19凋亡及BMP-2的表達(dá)的影響；A 抑制LINC00339對(duì)高糖作用的細(xì)胞hFOB1.19凋亡的影響;B 抑制LINC00339對(duì)高糖作用的細(xì)胞hFOB1.19凋亡蛋白及BMP-2表達(dá)的影響

表3 抑制LINC00339對(duì)高糖作用的細(xì)胞hFOB1.19凋亡及BMP-2的表達(dá)的影響

2.4 LINC00339靶向、調(diào)控miR-195-5p TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)顯示LINC00339與miR-195-5p有結(jié)合位點(diǎn)。轉(zhuǎn)染野生型和突變型表達(dá)載體WT-LINC00339和MUT-LINC00339后，與miR-NC組比較，miR-195-5p組轉(zhuǎn)染野生型細(xì)胞hFOB1.19的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；而轉(zhuǎn)染突變型細(xì)胞hFOB1.19的熒光素酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與pcDNA3.1組比較，pcDNA3.1-LINC00339組miR-195-5p表達(dá)水平顯著降低；與si-NC組比較，si-LINC00339組miR-195-5p表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。LINC00339可靶向調(diào)控miR-195-5p。見圖3，表4、5。

圖3 LINC00339靶向miR-195-5p

表4 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

2.5 抑制miR-195-5p能逆轉(zhuǎn)抑制LINC00339對(duì)高糖作用的細(xì)胞hFOB1.19增殖的影響 與高糖+si-NC組比較，高糖+si-LINC00339組細(xì)胞hFOB1.19中miR-195-5p表達(dá)水平顯著升高，Cyclin D1表達(dá)水平顯著升高，P21表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞活性顯著升高(P<0.05)；與高糖+si-LINC00339+anti-miR-NC組比較，高糖+si-LINC00339+anti-miR-195-5p組細(xì)胞hFOB1.19中miR-195-5p表達(dá)水平顯著降低，Cyclin D1表達(dá)水平顯著降低，P21表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞活性顯著降低(P<0.05)。抑制miR-195-5p能逆轉(zhuǎn)抑制LINC00339對(duì)高糖作用的細(xì)胞hFOB1.19增殖的促進(jìn)作用。見圖4，表6。

表5 LINC00339調(diào)控miR-195-5p的表達(dá)

表6 抑制miR-195-5p能逆轉(zhuǎn)抑制LINC00339對(duì)高糖作用的細(xì)胞hFOB1.19增殖的影響

圖4 抑制miR-195-5p能逆轉(zhuǎn)抑制LINC00339對(duì)高糖作用的細(xì)胞hFOB1.19增殖蛋白表達(dá)的影響；1 高糖+si-NC；2 高糖+si-LINC00339；3 高糖+si-LINC00339+anti-miR-NC；4 高糖+si-LINC00339+anti-miR-195-5p

2.6 抑制miR-195-5p能逆轉(zhuǎn)抑制LINC00339對(duì)高糖作用的細(xì)胞hFOB1.19凋亡的影響 與高糖+si-NC組比較，高糖+si-LINC00339組細(xì)胞hFOB1.19中BMP-2、Bcl-2表達(dá)水平顯著升高，Bax表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)；與高糖+si-LINC00339+anti-miR-NC組比較，高糖+si-LINC00339+anti-miR-195-5p組細(xì)胞hFOB1.19中BMP-2、Bcl-2表達(dá)水平顯著降低，Bax表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。抑制miR-195-5p能逆轉(zhuǎn)抑制LINC00339對(duì)高糖作用的細(xì)胞hFOB1.19凋亡的抑制作用。見表7，圖5。

表7 抑制miR-195-5p能逆轉(zhuǎn)抑制LINC00339對(duì)高糖作用的細(xì)胞hFOB1.19凋亡及BMP-2表達(dá)的影響

圖5 抑制miR-195-5p能逆轉(zhuǎn)抑制LINC00339對(duì)高糖作用的細(xì)胞hFOB1.19凋亡蛋白及BMP-2表達(dá)的影響；1 高糖+si-NC；2 高糖+si-LINC00339；3 高糖+si-LINC00339+anti-miR-NC；4 高糖+si-LINC00339+anti-miR-195-5p

3 討論

DOP以高血糖和骨密度減低為特點(diǎn)，近些年來(lái)，DOP發(fā)病率升高，且易致病理性骨折、致殘率高，深入研究其發(fā)病機(jī)制，控制血糖和OP相關(guān)危險(xiǎn)因素，有利于防治DOP[8]。有研究表明高糖高脂可抑制成骨細(xì)胞分化能力[9]；高糖高脂還可時(shí)間依賴性抑制成骨細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在高糖作用的成骨細(xì)胞hFOB1.19中LINC00339表達(dá)水平顯著升高，miR-195-5p表達(dá)水平顯著降低。提示，LINC00339和miR-195-5p可能參與成骨細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等生物學(xué)過(guò)程。

有研究報(bào)道LINC00339在非小細(xì)胞肺癌組織和細(xì)胞中顯著上調(diào)，LINC00339沉默通過(guò)靶向miR-145調(diào)控FOXM1在體外和體內(nèi)抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲，加速細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤生長(zhǎng)[11]。LINC00339在膠質(zhì)瘤組織以及膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中也上調(diào)表達(dá)，敲除LINC00339抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和管形成[12]。LINC00339通過(guò)miR-1182/SKA1途徑促進(jìn)肝細(xì)胞癌的生長(zhǎng)和侵襲[13]；LINC00339過(guò)表達(dá)通過(guò)miR-377-3p促進(jìn)三陰性乳腺癌增殖，抑制細(xì)胞周期停滯和抑制細(xì)胞凋亡[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在高糖處理的成骨細(xì)胞hFOB1.19中轉(zhuǎn)染si-LINC00339后，細(xì)胞活性顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低。且細(xì)胞周期素D1(CyclinD1)、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2)表達(dá)水平顯著升高，P21、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 assiociated X protein，Bax)表達(dá)水平顯著降低；抑制LINC00339表達(dá)，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)表達(dá)水平顯著升高，而BMP-2可在體內(nèi)和體外促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化[15]。說(shuō)明抑制LINC00339表達(dá)促進(jìn)了成骨細(xì)胞增殖，抑制了高糖作用的成骨細(xì)胞凋亡。

有研究報(bào)道m(xù)iR-195通過(guò)靶向SMAD7可促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化[16]。miR-195-5p高表達(dá)可以抑制膀胱癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡[17]。lncRNA XIST通過(guò)miR-195-5p靶向YAP促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞增殖和侵襲[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LINC00339靶向調(diào)控miR-195-5p，在高糖作用的成骨細(xì)胞中，同時(shí)抑制miR-195-5p和LINC00339的表達(dá)，Cyclin D1、Bcl-2、BMP-2表達(dá)水平顯著降低，P21、Bax表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞活性顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高。即抑制miR-195-5p逆轉(zhuǎn)了抑制LINC00339對(duì)高糖作用的成骨細(xì)胞增殖促進(jìn)和凋亡抑制的作用。說(shuō)明LINC00339可能通過(guò)調(diào)控miR-195-5p影響成骨細(xì)胞的增殖和凋亡。

綜上所述，抑制LINC00339可促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，對(duì)高糖作用的成骨細(xì)胞有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與miR-195-5p表達(dá)水平有關(guān)。將可為骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防和治療提供新策略和新思路。