劉建東，張靜飛 綜述，劉建凱，鄭海發(fā)審校

北京民海生物科技有限公司結(jié)合疫苗新技術(shù)研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102600

人呼吸道合胞體病毒（respiratory syncytial virus，RSV）為一種副黏病毒科肺病毒屬的有囊膜、非節(jié)段性的單股負(fù)鏈RNA病毒，是導(dǎo)致全球嬰幼兒細(xì)支氣管炎及肺炎的主要致病原，6月以下嬰兒感染RSV的風(fēng)險(xiǎn)最高，RSV也可導(dǎo)致老人及免疫缺陷人群發(fā)生嚴(yán)重的呼吸道疾病，主要癥狀為發(fā)熱、咳嗽、鼻炎及呼吸困難［1］。RSV每年導(dǎo)致全球約3.3億病例感染，其中約20%患者需住院治療，16萬 ～19萬死亡，造成嚴(yán)重的社會(huì)負(fù)擔(dān)。RSV具有高度傳染性，主要通過感染者的體液分泌物進(jìn)行傳播，勤洗手和遠(yuǎn)離感染者是最好的預(yù)防措施。RSV于1955年首次從感冒癥狀的黑猩猩體內(nèi)分離獲得，1956年在患有細(xì)支氣管炎的兒童體內(nèi)分離到RSV［2］。RSV僅有1個(gè)血清型，A和B兩個(gè)亞型，基因組長(zhǎng)15 200，編碼11種蛋白，包括黏附蛋白（G）、小疏水蛋白（SH）、融合蛋白（F）、核衣殼蛋白（N）、磷蛋白（P）、聚合酶及基質(zhì)蛋白（M1、M2-1、M2-2）等9個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和2個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NS2，其中F、G及N蛋白是疫苗研究的主要靶抗原［3］。

一種安全有效的RSV疫苗對(duì)預(yù)防病毒傳播具有極其重要的作用，本文就RSV免疫逃逸機(jī)制及其疫苗的研究進(jìn)展作一綜述。

1 RSV免疫逃逸機(jī)制

RSV被發(fā)現(xiàn)已超60年，但目前仍無上市的RSV疫苗來預(yù)防RSV感染。主要原因是RSV通過進(jìn)化形成了多種免疫逃逸機(jī)制：①RSV感染的是呼吸道淺層上皮細(xì)胞。通過這種感染方式可避免或推遲病毒暴露于樹突狀細(xì)胞，暴露于樹突狀細(xì)胞在抗原誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫反應(yīng)過程中具有至關(guān)重要的作用[4-5］。②RSV可隱藏中和抗體表位。F蛋白在病毒與宿主融合的過程中具有重要作用，也是RSV誘導(dǎo)中和抗體反應(yīng)的主要免疫原，融合前F蛋白不穩(wěn)定，融合過程中會(huì)發(fā)生結(jié)構(gòu)改變，形成融合后的F蛋白，該蛋白結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定。相比于融合后F蛋白，融合前F蛋白能誘導(dǎo)更強(qiáng)的中和抗體反應(yīng)。通過改變F蛋白的結(jié)構(gòu)，RSV可逃避融合前蛋白誘導(dǎo)的中和抗體的殺傷［6］。③RSV調(diào)節(jié)宿主的免疫反應(yīng)。RSV主要感染人群為嬰兒，嬰兒的免疫系統(tǒng)尚不完善，樹突狀細(xì)胞不成熟，B細(xì)胞體細(xì)胞突變具有缺陷，RSV感染可導(dǎo)致Th2細(xì)胞偏好性的免疫反應(yīng)［7-9］。此外，病毒能通過NS1及NS2蛋白抑制感染的上皮細(xì)胞釋放Ⅰ型IFN，通過G蛋白調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，還可通過分泌形式的G蛋白掩蓋抗體的中和能力［10-12］。

2 RSV疫苗

1966年開展了首個(gè)RSV疫苗的臨床試驗(yàn)。研究者使用福爾馬林滅活的RSV病毒（FI-RSV）作為疫苗，免疫了20名2～7月齡嬰兒，結(jié)果顯示，疫苗不僅不能產(chǎn)生足夠的中和抗體抵抗感染，且還使16名嬰兒引發(fā)了更嚴(yán)重的肺炎及細(xì)支氣管炎而住院，其中2名嬰兒在感染RSV后導(dǎo)致死亡［13］。病毒不能啟動(dòng)免疫記憶反應(yīng)是RSV預(yù)防類疫苗無效的主要原因，隨著FI-RSV疫苗的失敗，研究者開始開發(fā)其他類型RSV疫苗，主要包括弱毒活疫苗、嵌合體疫苗、亞單位疫苗、病毒樣顆粒疫苗及納米顆粒疫苗。正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)的RSV疫苗見表1。

表1 正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)的RSV疫苗Tab.1 RSV vaccines in clinical trial

2.1 減毒活疫苗 最初研究的RSV減毒活疫苗是通過在體外26℃連續(xù)傳代制備的，相比于福爾馬林滅活的RSV疫苗，減毒活疫苗暴露于天然RSV感染后不會(huì)導(dǎo)致疾病增強(qiáng)現(xiàn)象［14］。對(duì)于弱毒活疫苗，需在弱化的病毒復(fù)制與誘導(dǎo)有效的免疫反應(yīng)中維持平衡。近來研究顯示，移除G蛋白的CX3C基序，可通過將增強(qiáng)呼吸道疾病相關(guān)性的Th2型細(xì)胞反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)門h1型細(xì)胞反應(yīng)來增強(qiáng)病毒的安全性，但這種基因弱化的減毒活疫苗在選擇壓力下能否保持還有待研究［15］。另一種候選的減毒活疫苗OE5是將NS1、NS2及G蛋白進(jìn)行部分優(yōu)化，同時(shí)完全去除SH蛋白，這種方法產(chǎn)生的減毒活疫苗較好的限制了病毒復(fù)制，且保留了誘導(dǎo)最強(qiáng)中和抗體的F蛋白完整性［16］。在一項(xiàng)小鼠實(shí)驗(yàn)中顯示，OE5可在感染RSV后，誘導(dǎo)持續(xù)100 d的保護(hù)性抗體反應(yīng)，且不導(dǎo)致增強(qiáng)呼吸道疾病反應(yīng)。因此，減毒活疫苗OE5為一種較有潛力的安全有效的候選疫苗［16］。

2.2 嵌合病毒疫苗 減毒活疫苗一個(gè)缺點(diǎn)是自然感染RSV不能產(chǎn)生持久的保護(hù)性免疫記憶反應(yīng)，在F及G蛋白上的多種表位可被適應(yīng)性免疫反應(yīng)識(shí)別，但隨著病毒的清除，保護(hù)性反應(yīng)消逝，嬰兒可被相同亞型的RSV連續(xù)感染，為克服這種困難，許多研究團(tuán)隊(duì)研制了表達(dá)RSV蛋白的重組嵌合體。有研究者構(gòu)建了表達(dá)RSV N蛋白的卡介苗（Bacillus Calmette Guerin vaccine，BCG），BCG 為一種從牛分支桿菌分離的用于預(yù)防結(jié)核的疫苗，可誘導(dǎo)持久的T細(xì)胞免疫反應(yīng)，研究顯示，該疫苗可有效刺激CD4+和CD8+細(xì)胞免疫反應(yīng)，在小鼠實(shí)驗(yàn)中可預(yù)防RSV的感染［17］。另一項(xiàng)研究是利用仙臺(tái)病毒作為載體，構(gòu)建RSV嵌合體，仙臺(tái)病毒屬副黏病毒科，主要感染小鼠及嚙齒類動(dòng)物，研究者利用復(fù)制缺陷的仙臺(tái)病毒作為疫苗骨架，用RSV的F蛋白取代仙臺(tái)病毒的F蛋白，這種嵌合體疫苗可通過鼻內(nèi)黏膜免疫及肌肉免疫誘導(dǎo)T細(xì)胞和抗體免疫反應(yīng)［18］。最有前景的嵌合體疫苗是副流感病毒5型（parainfluenza virus 5，PIV5）與RSV的嵌合體，副流感病毒是導(dǎo)致兒童感染重要的呼吸道病原體。用表達(dá)RSV F或G蛋白的兩種PIV5嵌合體接種棉鼠及非洲綠猴，結(jié)果顯示，兩種嵌合體均能保護(hù)動(dòng)物免受感染，其中在非洲綠猴試驗(yàn)中，表達(dá)F蛋白的PIV5嵌合體比表達(dá)G蛋白的PIV5嵌合體誘導(dǎo)更高水平的抗體滴度［19］?；蚍€(wěn)定性研究顯示，嵌合體疫苗在體內(nèi)及體外的傳代過程中會(huì)發(fā)生隨機(jī)突變，這種基因不穩(wěn)定性可能是RNA嵌合體疫苗的一個(gè)最大擔(dān)憂，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，將RSV的F蛋白插入至PIV5的HN和L基因之間是穩(wěn)定的［20］。一種改進(jìn)表達(dá)穩(wěn)定融合前F蛋白的PIV5嵌合體疫苗，在小鼠試驗(yàn)中能誘導(dǎo)與自然感染野生型RSV相似的中和抗體反應(yīng)，并能在RSV攻毒實(shí)驗(yàn)中提供免疫保護(hù)［21］。

2.3 亞單位疫苗 亞單位疫苗的優(yōu)點(diǎn)是可產(chǎn)生對(duì)病毒蛋白的免疫記憶而不導(dǎo)入活病原體或造成增強(qiáng)呼吸道疾病的風(fēng)險(xiǎn)。近年來，在棉鼠模型中研究發(fā)現(xiàn)，低免疫劑量RSV的F蛋白會(huì)導(dǎo)致增強(qiáng)呼吸道疾病，而高免疫劑量卻不會(huì)，這增加了人們對(duì)免疫劑量在免疫人群安全性的擔(dān)憂［22］?；诖?，靶向特異表位的亞單位疫苗是RSV疫苗研究的一個(gè)全新的方向。在一項(xiàng)研究中，以poly IC（雙鏈RNA的合成類似物）為佐劑的RSV F蛋白多肽單次經(jīng)鼻內(nèi)黏膜免疫小鼠，能產(chǎn)生持續(xù)150 d的免疫保護(hù)［23］。另一項(xiàng)研究用脂質(zhì)體核心多肽免疫BALB／c小鼠，雖產(chǎn)生了很強(qiáng)的抗體免疫反應(yīng)，但這些抗體不能結(jié)合天然RSV的F蛋白，更不能產(chǎn)生任何的免疫保護(hù)［24］。這些研究表明，對(duì)于亞單位疫苗，攻毒實(shí)驗(yàn)檢測(cè)免疫保護(hù)比檢測(cè)抗體滴度更加重要。RSV的G蛋白是另一個(gè)能誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)的疫苗候選抗原，未糖基化的G蛋白不會(huì)導(dǎo)致增強(qiáng)的呼吸道疾病，可產(chǎn)生對(duì)RSV的免疫保護(hù)。研發(fā)RSV疫苗的另一種擔(dān)憂是毒株差異的問題，因?qū)嶒?yàn)室研究常用RSV A2毒株，該毒株為實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)株，而嬰兒感染的毒株可能是一些不同的毒株，這需要研發(fā)的疫苗可提供對(duì)不同亞型毒株均具有免疫保護(hù)反應(yīng)［25］。研究者通過構(gòu)建結(jié)合A和B亞型RSV的G蛋白疫苗，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該疫苗可產(chǎn)生針對(duì)兩種亞型的很強(qiáng)的體液免疫反應(yīng)［26］。

2.4 病毒樣顆粒（virus like particle，VLP）疫苗 VLP是不含任何基因物質(zhì)、具有復(fù)制缺陷、能自我組裝的病毒蛋白。研究者用流感病毒的M1蛋白及RSV的F蛋白或G蛋白構(gòu)建VLP疫苗，兩種疫苗均能產(chǎn)生RSV特異的抗體免疫反應(yīng)，在小鼠模型中也能保護(hù)小鼠不受RSV感染［27］。各種類型的VLP疫苗均能誘導(dǎo)產(chǎn)生Th1型的細(xì)胞免疫反應(yīng)，現(xiàn)階段對(duì)于使用融合前F蛋白還是融合后F蛋白構(gòu)建VLP疫苗還有待研究，盡管融合前F蛋白VLP疫苗能產(chǎn)生更高水平的中和抗體反應(yīng)，但融合后F蛋白VLP疫苗可產(chǎn)生更高的Th1型免疫反應(yīng)，產(chǎn)生更高占比的IgG2a抗體［28］。在活RSV（A2毒株）攻毒實(shí)驗(yàn)中，VLP疫苗免疫小鼠比未免疫小鼠具有更高的免疫保護(hù)，但不比前期感染活RSV小鼠的免疫保護(hù)高，今后需進(jìn)一步改進(jìn)來增強(qiáng)VLP疫苗的保護(hù)效果［29］。

2.5 微米或納米顆粒疫苗 微米或納米顆粒的大小影響抗原呈遞至引流淋巴結(jié)的方式，小的納米顆粒（2～200 nm）可輕易引流至淋巴結(jié)，大的納米顆粒（＞500 nm）需由樹突狀細(xì)胞吞噬，這種被抗原提呈細(xì)胞吞噬使大的納米顆粒比小的在淋巴結(jié)中保留更長(zhǎng)的時(shí)間［30］。一種靶向RSV N蛋白的納米顆粒疫苗臨床前研究顯示，該疫苗可在小鼠及豬體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)性的CD4+T細(xì)胞免疫反應(yīng)［31］。另一種RSV F蛋白的納米顆粒疫苗已進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗(yàn)，目標(biāo)人群為成年女性，結(jié)果顯示，疫苗對(duì)RSV感染者具有50%的保護(hù)效果，發(fā)展前景較好，但還需在目標(biāo)感染人群中進(jìn)一步檢測(cè)；為了將產(chǎn)生的抗體通過胎盤傳給胎兒，保護(hù)1月齡的胎兒，Ⅲ期臨床計(jì)劃免疫妊娠晚期的孕婦；另外，感染RSV的母親也有57%概率將病毒傳染給胎兒，免疫母親可通過產(chǎn)生母源抗體保護(hù)其嬰兒；目前該疫苗Ⅲ期臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中［32］。上述RSV F蛋白的納米顆粒疫苗對(duì)老年人的臨床實(shí)驗(yàn)也在進(jìn)行中，結(jié)果顯示，疫苗安全性較好，受試者在接種12個(gè)月后，仍具有較高的抗體滴度，在Ⅱ期臨床實(shí)驗(yàn)中需檢測(cè)這些抗體反應(yīng)是否可為老年人提供免疫保護(hù)［33］。

3 小結(jié)

RSV是導(dǎo)致嬰兒發(fā)病及死亡的一個(gè)主要病原，對(duì)醫(yī)療系統(tǒng)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。近年來，研究者始終在研發(fā)各種可有效預(yù)防RSV傳播的疫苗，但因RSV自然感染不能誘導(dǎo)針對(duì)保守免疫原的長(zhǎng)期免疫記憶反應(yīng)，以及前期臨床實(shí)驗(yàn)一些候選疫苗會(huì)造成呼吸疾病增強(qiáng)等原因，現(xiàn)階段還無上市RSV疫苗可用。隨著近年來技術(shù)的不斷發(fā)展，一些新型的疫苗已在臨床實(shí)驗(yàn)中顯示具有很好的安全性和有效性，相信在不久的將來，能成功研發(fā)出可在嬰兒和其他目標(biāo)人群有效預(yù)防RSV感染的疫苗。