段徐華 ，王鳴人 ，凌今 ，邵泓 ，陳鋼

1.上海市食品藥品檢驗(yàn)研究院國家局治療類單抗質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201203；2.復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院，上海 200032

重組人粒細(xì)胞集落刺激因子（recombinant human granulocyte colony-stimulating factor，rhG-CSF）主要用于放化療及骨髓移植后中性粒細(xì)胞減少癥［1-2］。目前，《美國藥典》（USP）、《歐洲藥典》（EP）、《英國藥典》（BP）、《印度藥典》（IP）、《日本藥局方》（JP）及《中國藥典》三部（2015版）均收錄了 rhG-CSF［3-8］，但各國藥典對該制品生物學(xué)活性測定的試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用的統(tǒng)計(jì)分析方法不盡相同。國外藥典均采用基于直線模型的量反應(yīng)平行線測定法，該方法對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性擬合后，采用方差分析進(jìn)行可靠性測驗(yàn)［2-6］，在可靠性成立的條件下，以共斜率的方式將直線平行化后按等反應(yīng)劑量比值計(jì)算供試品的相對效價(jià)，而《中國藥典》三部（2015版）通則中rhG-CSF生物活性檢測系采用基于S形logistic曲線模型的四參數(shù)回歸計(jì)算法，該統(tǒng)計(jì)方法目前尚未收載于現(xiàn)行版《中國藥典》生物檢定統(tǒng)計(jì)法中，在進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理時(shí)也未對可靠性測驗(yàn)作出要求。另外，USP、EP、BP及IP中rhG-CSF相對效價(jià)限度均為80%～125%，JP為 70%～140%，《中國藥典》三部（2015版）為80%～150%［3-8］；效價(jià)置信區(qū)間 USP 規(guī)定為測定值的75%～133%，EP、BP、IP均規(guī)定為測定值的74%～136%［3-6］，各國藥典置信區(qū)間寬度限度中USP為 ≤29%，EP、BP、IP均為 ≤31%，JP為 ≤30%，而《中國藥典》未作規(guī)定。由此可見，《中國藥典》對生物活性測定數(shù)據(jù)的可靠性判斷及實(shí)驗(yàn)誤差大小的控制與國際標(biāo)準(zhǔn)尚存在一定差距，而生物活性是反映藥品有效性的重要指標(biāo)，與產(chǎn)品質(zhì)量密切相關(guān)，且中國大部分法定標(biāo)準(zhǔn)中生物活性的統(tǒng)計(jì)分析方法均為四參數(shù)回歸計(jì)算法，因此，對四參數(shù)回歸計(jì)算法的試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析流程進(jìn)行規(guī)范化研究具有重要意義。

本研究擬以rhG-CSF生物活性測定研究數(shù)據(jù)的四參數(shù)回歸分析為例，參照量反應(yīng)平行線測定法的計(jì)算思路，采用方差分析法進(jìn)行可靠性測驗(yàn)，在可靠性成立的條件下，以共斜率及共漸進(jìn)線的方式進(jìn)行S形曲線的平行化，構(gòu)建平行曲線模型（也稱約束模型）進(jìn)行供試品相對效價(jià)的計(jì)算［9-11］，并參照EP及BP中置信區(qū)間估計(jì)方法計(jì)算效價(jià)的置信區(qū)間。按上述設(shè)想建立配套的Excel分析模板，比較其與國際公認(rèn)的統(tǒng)計(jì)分析軟件SoftMax及PLA分析結(jié)果的一致性。同時(shí)，采用EP中收載的四參數(shù)回歸計(jì)算法實(shí)例數(shù)據(jù)對其進(jìn)行驗(yàn)證，以期為分析軟件的選擇提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)數(shù)據(jù)及分析軟件 研究數(shù)據(jù)1來自A企業(yè)提供的20130704批rhG-CSF生物學(xué)活性測定數(shù)據(jù)（表1）；研究數(shù)據(jù)2來自EP第5.3章5.4.1節(jié)四參數(shù)回歸計(jì)算法破傷風(fēng)抗血清效價(jià)測定實(shí)例數(shù)據(jù)［10］（表 2）；軟件 Excel 2010、SoftMax Pro.6.5.1 及 PLA 3.0分別由美國Microsoft公司、美國Mole-cular Devices公司和德國Stegmann公司提供。

表1 rhG-CSF生物學(xué)活性測定（NFS-60細(xì)胞／MTT比色法）試驗(yàn)數(shù)據(jù)（A570／630）Tab.1 Readouts by microplate reader for rhG-CSF bioassay（NFS-60 cell／MTT）（A570 ／630）

表2 EP 5.4.1破傷風(fēng)抗血清效價(jià)測定試驗(yàn)數(shù)據(jù)（A值）Tab.2 Experimental data on potency of tetanus antiserum in EP 5.4.1（A value）

1.2 四參數(shù)logistic模型擬合 四參數(shù)logistic模型常用的一種方程形式如下。

y=D+（A-D）／［1+（x／C）B］

式中y表示反應(yīng)值；x表示藥物作用濃度；A、B、C、D為4個(gè)特征性參數(shù)，其中A為反應(yīng)下漸進(jìn)線，D為反應(yīng)上漸進(jìn)線，B為曲線斜率因子，C為半數(shù)有效濃度（median effective concentration，EC50）［9，12］。

軟件Excel采用規(guī)劃求解功能進(jìn)行四參數(shù)logistic自由模型與約束模型的擬合，其中自由模型分別進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品與供試品曲線4個(gè)參數(shù)的獨(dú)立擬合，而約束模型中標(biāo)準(zhǔn)品與供試品曲線的參數(shù)A、B、D保持相同，參數(shù)C分別進(jìn)行獨(dú)立擬合。按以下原則進(jìn)行A、B、C、D參數(shù)初始值賦值：A設(shè)置為比所有反應(yīng)值中最小值略低的值，D設(shè)置為比所有反應(yīng)值中最大值略高的值；四參數(shù)logistic模型方程式經(jīng)logit轉(zhuǎn)換后，對 ln［（A-D）／（y-D）］與 lnx 進(jìn)行線性回歸，若以b及γ分別表示回歸方程的斜率和截距，則B可賦值為 b，C 可賦值為 e（-γ／b）［13］。

用軟件Softmax及PLA相應(yīng)內(nèi)置程序?qū)ρ芯繑?shù)據(jù)1分別進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品和供試品劑量反應(yīng)曲線自由模型擬合及約束模型擬合。

1.3 方差分析及可靠性測驗(yàn)

1.3.1 方差分解思路 根據(jù)量反應(yīng)平行線測定法利用平行化直線模型計(jì)算供試品效價(jià)的思路，四參數(shù)回歸計(jì)算法利用約束模型計(jì)算效價(jià)的前提是方差分析顯示約束模型擬合試驗(yàn)數(shù)據(jù)與自由模型無顯著性差異，即可用約束模型代替自由模型進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及效價(jià)計(jì)算。

基于該計(jì)算思路，可將約束模型的總變異分解為試品間、回歸項(xiàng)及殘差項(xiàng)變異；約束模型的殘差項(xiàng)變異又可分解為自由模型的殘差項(xiàng)變異和偏離平行項(xiàng)變異；自由模型的殘差項(xiàng)變異又可分解為模型失擬項(xiàng)變異及純誤差項(xiàng)變異［14］。各變異項(xiàng)滿足如下關(guān)系。

差方和總=差方和試品間+差方和回歸+差方和殘差Ⅰ；

差方和殘差Ⅰ=差方和殘差Ⅱ+差方和偏離平行；

差方和殘差Ⅱ=差方和模型失擬+ 差方和純誤差

式中差方和殘差Ⅰ為標(biāo)準(zhǔn)品和供試品約束模型的殘差平方和；差方和殘差Ⅱ?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)品和供試品自由模型的殘差平方和。

1.3.2 方差分析公式 根據(jù)1.3.1項(xiàng)方差分解的思路以及各變異項(xiàng)所反映的意義，列出各項(xiàng)變異的差方和與自由度（f）的計(jì)算公式［15-18］，計(jì)算各變異項(xiàng)的方差（各變異項(xiàng)差方和／各變異項(xiàng)自由度）。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析 將①～⑧公式編輯入Excel軟件，建立配套的分析模板；對研究數(shù)據(jù)1分別采用建立的Excel分析模板、軟件SoftMax及PLA相應(yīng)內(nèi)置程序進(jìn)行方差分析及可靠性測驗(yàn)。其中SoftMax不具備回歸項(xiàng)和模型失擬項(xiàng)可靠性測驗(yàn)函數(shù)，僅進(jìn)行偏離平行性分析。

1.4 相對效價(jià)及置信區(qū)間計(jì)算

1.4.1 相對效價(jià) 按生物檢定中等反應(yīng)劑量對比原則，研究數(shù)據(jù)1的相對效價(jià)R按約束模型中標(biāo)準(zhǔn)品與供試品擬合曲線EC50的比值計(jì)算，在Excel中建立相應(yīng)計(jì)算模板。Softmax及PLA內(nèi)置程序按該原則進(jìn)行相對效價(jià)計(jì)算。

1.4.2 置信區(qū)間估計(jì) 按EP第5.3章4.2.節(jié)工作表4.2.1-Ⅰ和 4.2.1-Ⅱ及計(jì)算公式4.2.3-2在Excel中建立計(jì)算效價(jià)95%置信區(qū)間的表格模板［19］，軟件Softmax及PLA分別選擇profile（t distribution）法和基于約束模型進(jìn)行方差分解的分析模式計(jì)算置信區(qū)間。比較3種軟件計(jì)算研究數(shù)據(jù)1相對效價(jià)置信區(qū)間的一致性。

1.5 Excel計(jì)算模板的驗(yàn)證 對研究數(shù)據(jù)2分別采用建立的Excel計(jì)算模板及軟件PLA進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，對各軟件計(jì)算結(jié)果及EP報(bào)告值進(jìn)行一致性比較，驗(yàn)證Excel計(jì)算模板的準(zhǔn)確性。由于EP第5.3章5.4.1節(jié)實(shí)例可靠性測驗(yàn)采用加權(quán)卡方檢驗(yàn)法，而Excel分析模板中的可靠性測驗(yàn)為參照常規(guī)量反應(yīng)平行線測定法建立的方差分析法，因此其可靠性測驗(yàn)結(jié)果選擇與PLA軟件中分析結(jié)果相比較。

2 結(jié)果

2.1 四參數(shù)logistic模型擬合 結(jié)果顯示，Excel與Softmax及PLA對各參數(shù)的估計(jì)值基本一致。若以不同軟件各參數(shù)估計(jì)值的相對偏差（測量的偏差占平均值的百分比）計(jì)，最大相對偏差為0.08%，可忽略不計(jì)。見表3。

表3 標(biāo)準(zhǔn)品及供試品自由和約束模型擬合曲線中各參數(shù)的估計(jì)值Tab.3 Estimation of parameters in free model and constrained model for standards and test samples

2.2 方差分析及可靠性測驗(yàn)

2.2.1 方差分析 殘差Ⅱ方差用以進(jìn)行試品間、回歸及偏離平行3項(xiàng)變異的F統(tǒng)計(jì)量的計(jì)算，誤差項(xiàng)的方差用來進(jìn)行模型失擬的F統(tǒng)計(jì)量的計(jì)算，Excel方差分析結(jié)果見表4。

表4 Excel方差分析Tab.4 Analysis of variance by Excel software

2.2.2 可靠性測驗(yàn)及判斷 對表4中方差分析數(shù)據(jù)進(jìn)行各項(xiàng)變異顯著性F測驗(yàn)，使用Excel中FDIST（Fstat，df1，df2）函數(shù)計(jì)算概率 P 值，其中 Fstat為表4中F值，df1為F值計(jì)算公式中分子項(xiàng)的自由度，df2為分母項(xiàng)的自由度。Excel可靠性測驗(yàn)結(jié)果與Softmax及PLA相應(yīng)結(jié)果基本一致，回歸項(xiàng)非常顯著（P＜0.01）；偏離平行及模型失擬項(xiàng)均不顯著（P均＞0.05），判定可靠性測驗(yàn)結(jié)果成立。見表5。

表5 Excel、Softmax及PLA軟件的可靠性測驗(yàn)Tab.5 Tests of validity by Excel，Softmax and PLA software

2.3 相對效價(jià)及置信區(qū)間計(jì)算

2.3.1 相對效價(jià) 研究數(shù)據(jù)1中標(biāo)準(zhǔn)品和供試品擬合曲線的EC50即為表3中約束模型下Excel擬合的C值，R為103.9%（26.08／25.10×100%）。

2.3.2 置信區(qū)間估計(jì) 3種軟件計(jì)算效價(jià)的95%置信區(qū)間均為98.3%～109.7%，其相對置信區(qū)間均為94.6%～105.6%，表明3種軟件計(jì)算結(jié)果一致。

2.4 Excel計(jì)算模板驗(yàn)證 結(jié)果顯示，Excel曲線擬合結(jié)果、效價(jià)及置信區(qū)間計(jì)算結(jié)果與EP報(bào)告結(jié)果一致，可靠性測驗(yàn)結(jié)果與PLA分析結(jié)果一致，見表6。

表6 Excel分析結(jié)果與EP報(bào)告及PLA分析結(jié)果的比較Tab.6 Comparison of analysis result by Excel software with reported result in EP and analysis result by PLA software

3 討論

本研究以rh-GCSF生物活性測定數(shù)據(jù)的分析為例，參照量反應(yīng)平行線測定法中以平行化直線模型計(jì)算效價(jià)的思路，針對四參數(shù)回歸計(jì)算法，提出采用平行化曲線模型作為效價(jià)計(jì)算模型的設(shè)想。該設(shè)想的前提是實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性需成立。量反應(yīng)平行線測定法的可靠性測驗(yàn)主要是基于變異來源進(jìn)行各變異項(xiàng)的方差分析，包含在一定概率水平下試品間、回歸項(xiàng)、偏離平行項(xiàng)及偏離直線項(xiàng)的F檢驗(yàn)。通過分析量反應(yīng)平行線測定法中各變異項(xiàng)所反映的實(shí)際意義，可構(gòu)建出四參數(shù)回歸計(jì)算法中對應(yīng)的變異分析項(xiàng)：試品間、回歸項(xiàng)、偏離平行項(xiàng)及模型失擬項(xiàng)，進(jìn)而通過對各變異項(xiàng)的方差分析進(jìn)行可靠性判定。

置信區(qū)間寬度反映的主要是實(shí)驗(yàn)精密度，置信上下限的間距越寬表明實(shí)驗(yàn)誤差越大，反之誤差越小。因此，報(bào)告相對效價(jià)的置信區(qū)間可利于監(jiān)控實(shí)驗(yàn)誤差大小是否在可接受范圍內(nèi)，從而獲得準(zhǔn)確可靠的結(jié)果。量反應(yīng)平行線測定法中效價(jià)置信區(qū)間的計(jì)算多是基于適用于直線模型的Fieller理論［20］，由于四參數(shù)回歸計(jì)算法中擬合模型為S形曲線模型，因此，本研究參照EP 5.3章5.4.1節(jié)四參數(shù)回歸計(jì)算法實(shí)例，先通過對響應(yīng)值進(jìn)行l(wèi)ogit轉(zhuǎn)換，將S形曲線直線化，再按照直線模型計(jì)算效價(jià)置信區(qū)間的方式獲得其95%置信區(qū)間［10］。

本研究覆蓋了生物活性測定數(shù)據(jù)四參數(shù)回歸分析的3個(gè)核心環(huán)節(jié)：四參數(shù)logistic回歸模型擬合、可靠性測驗(yàn)、相對效價(jià)和置信區(qū)間估計(jì)。整個(gè)過程涉及大量運(yùn)算工作，本文對Excel、Softmax及PLA軟件進(jìn)行了比較，其中Softmax為美國Molecular Devices公司酶標(biāo)儀自帶軟件，在國內(nèi)較為常用；PLA為德國Stegmann公司開發(fā)，在歐美國家常用，目前已獲得國外監(jiān)管機(jī)構(gòu)的認(rèn)可。經(jīng)比較，3種軟件計(jì)算的結(jié)果基本一致；同時(shí)采用EP 5.4.1四參數(shù)回歸計(jì)算法實(shí)例數(shù)據(jù)對建立的Excel分析模板進(jìn)行驗(yàn)證，所建立模板的分析結(jié)果與EP報(bào)告結(jié)果也一致，表明其分析結(jié)果可靠。目前，Excel和PLA軟件涵蓋了所有計(jì)算功能，可實(shí)現(xiàn)從劑量反應(yīng)曲線的擬合至相對效價(jià)及置信區(qū)間估計(jì)的全過程運(yùn)算。因Excel本身四參數(shù)擬合和計(jì)算功能并未得到開發(fā)，需通過大量計(jì)算公式的編輯及函數(shù)的調(diào)用才能建立分析模板，過程繁瑣，數(shù)據(jù)處理量大，容易出錯(cuò)，基于此局限性，本實(shí)驗(yàn)室目前正致力于自動(dòng)化計(jì)算軟件的開發(fā)。PLA在導(dǎo)入試驗(yàn)數(shù)據(jù)后即可通過一鍵自動(dòng)化得到結(jié)果，操作簡便，但價(jià)格昂貴，且要求應(yīng)用人員具備一定的統(tǒng)計(jì)學(xué)基礎(chǔ)。Softmax內(nèi)量的方差分析功能目前僅限于平行性檢驗(yàn)，尚不包括試品間、回歸項(xiàng)和失擬項(xiàng)的顯著性檢驗(yàn)，需進(jìn)一步在Softmax軟件中編輯相關(guān)公式才方便使用。因此，建議不同檢測單位可根據(jù)各種軟件獲得及分析的便捷性選擇適宜的分析軟件。

基于量反應(yīng)平行線測定法的計(jì)算思路，本研究構(gòu)建四參數(shù)回歸計(jì)算法的效價(jià)計(jì)算設(shè)想，實(shí)現(xiàn)了從直線模型至S形曲線模型計(jì)算思路的沿革；并基于目前實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用最普遍的Excel軟件，實(shí)現(xiàn)了分析模板的建立與驗(yàn)證，深入剖解了四參數(shù)回歸計(jì)算法從擬合至置信區(qū)間估計(jì)每個(gè)步驟中的計(jì)算公式，為自動(dòng)化計(jì)算軟件的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)，旨在推動(dòng)四參數(shù)回歸計(jì)算法在生物活性測定中的規(guī)范化應(yīng)用。