董威 ，袁軍，李紅 ，陳煜 ，劉昊智 ，2，李津 ，莊再成 ，吳克

1.武漢博沃生物科技有限公司，湖北 武漢 430075；2.華東理工大學生物工程學院，上海 200237

異脲鍵連接反應是多糖-蛋白結合疫苗生產中過程中連接多糖與載體蛋白的常用方式之一［1］。1-氰基，4-二甲氨基吡啶四氟硼酸鹽（1-cyano-4-dimethylamino-pyridinium，CDAP）是一種可用于異脲鍵連接反應中多糖活化的試劑，多應用于腦膜炎球菌結合疫苗、流行性嗜血桿菌結合疫苗、肺炎球菌結合疫苗及A族乙型溶血性鏈球菌疫苗等多糖-蛋白結合疫苗的工藝［2-5］。與廣泛使用的溴化氰活化劑（多糖活化率為1%～2%）比較，使用CDAP多糖的活化率可高達50%［6］，且其毒性較低，更易儲存［6-7］；CDAP雖能在水溶液的環(huán)境中活化多糖，但在水溶液中并不穩(wěn)定，在中性水溶液中數(shù)小時即降解，而在堿性水溶液中則會迅速降解［6］。目前，已有多篇文獻報道CDAP活化多糖制備的結合疫苗中殘留CDAP的測定方法［8-9］，但基于CDAP在中性和堿性水溶液中不穩(wěn)定的特點，其在水溶液中的降解產物也應納入相關疫苗的雜質檢測中。

核磁共振波譜（nuclear magnetic resonance spectrum，NMR）分析作為一種定性手段，常應用于藥品雜質的研究中。參考歐洲專利（EP 1 162 998 B1）［0113］項［10］的描述，在肺炎球菌結合疫苗的制備過程中應進行 4-二甲氨基吡啶（4-dimethylaminopyridine，DMAP）殘留的測定，因此，本研究采用一維核磁氫譜（1H-NMR）及碳譜（13C-NMR）對 CDAP及DMAP進行檢測，以確認CDAP降解產物的結構，并測定降解程度。

1 材料與方法

1.1 樣品 CDAP和DMAP均購自美國Sigma公司，其中CDAP純度為99.7%。

1.2 主要試劑及儀器 重水（99.9%）購自美國Sigma公司；NaOH（分析純）購自國藥集團化學試劑有限公司；600 MHz核磁共振波譜儀購自美國瓦里安公司；紫外-可見光分光光度計（型號UV-4802）購自尤尼柯（上海）儀器有限公司。

1.3 CDAP降解產物定性檢測 稱取20 mg的CDAP，經(jīng)1 mL重水溶解，用1 mol／L NaOH調節(jié)pH至9.0，室溫靜置過夜，即為CDAP降解溶液，終濃度18.2 mg／mL。將CDAP和DMAP分別用重水配制成20和10 mg／mL的溶液。20 mg／mL CDAP溶液及CDAP降解溶液經(jīng)200倍稀釋后進行紫外光譜分析（200～ 400 nm）；20 mg／mL CDAP溶液、10 mg／mL DMAP溶液及CDAP降解溶液進行1H-NMR和13CNMR分析。

1.4 核磁分析條件1H-NMR分析條件：探頭溫度25℃，掃描次數(shù)16次，增益值為20，弛豫系數(shù)5，采集時間1.4 min，頻率600 MHz。13C-NMR分析條件：探頭溫度25℃，掃描次數(shù)28次，增益值為30，弛豫系數(shù)5，采集時間2.6 min，頻率400 MHz。

1.5 CDAP降解程度的檢測 將CDAP用重水配制成 1、0.5、0.2、0.1 和 0.05 mg／mL 的溶液，進行1H-NMR分析。樣品在測定前配制，迅速上樣分析，防止降解。

2 結果

2.1 CDAP降解產物的定性

2.1.1 紫外光譜分析 經(jīng)堿性溶液過夜處理，CDAP降解產物的紫外吸收峰由300 nm移動至280 nm，見圖1。

圖1 CDAP與CDAP降解產物的紫外掃描圖譜Fig.1 Ultraviolet spectra of CDAP and its degra-dation product

2.1.21H-NMR譜分析 CDAP及DMAP圖譜在3.5～2.5 ppm處均有6個質子的單峰，可確定為甲氨基結構中甲基上的6個質子。在9.0～6.0 ppm處有2個裂分峰，與發(fā)生對位取代的苯環(huán)或1，4位取代的吡啶環(huán)吻合。CDAP的圖譜中，2，6位質子的化學位移為8.08 ppm，3，5位質子的化學位移為6.95 ppm，甲氨基上質子的化學位移為3.27 ppm；DMAP的圖譜中，2，6位質子的化學位移為7.85 ppm，3，5位質子的化學位移為6.38 ppm，甲氨基上質子的化學位移為2.74 ppm；CDAP降解產物圖譜中，主峰有3.00的6個質子的單峰，6.67 ppm處2個質子和7.85 ppm處2個質子的裂分峰，其結構符合吡啶環(huán)上1、4位取代的結構。根據(jù)CDAP結構，該降解產物為DMAP或DMAP的某種N-末端衍生物，其N-末端基團無氫或其氫為活性氫。其中，3.00 ppm處為甲氨基上6個質子化學位移，6.67 ppm處為吡啶環(huán)上3、5位質子的化學位移，7.85 ppm處為吡啶環(huán)上2、6位質子的化學位移。由于其2，6位的質子化學位移與DMAP相同（均為7.85 ppm），表明降解產物在吡啶環(huán)的N-末端已不存在對相鄰質子產生去屏蔽效應的基團連接。見圖2。

圖2 CDAP（A）、DMAP（B）與 CDAP 降解產物（C）的 1HNMR譜Fig.21H-NMR spectra of CDAP（A），DMAP（B）and degradation product of CDAP（C）

2.1.313C-NMR譜分析 CDAP在124 ppm處有典型氰基（-CN）碳原子化學位移，CDAP降解產物未見化學位移峰，與DMAP的13C譜基本一致，僅出現(xiàn)4種碳的化學位移峰，見圖3。可推斷該降解產物的氰基（-CN）上的碳原子已丟失。

圖3 CDAP（A）、DMAP（B）與 CDAP 降解產物（C）的 13CNMR譜Fig.313C-NMR spectra of CDAP（A），DMAP（B）and degradation product of CDAP（C）

CDAP降解主要產物保留了吡啶環(huán)4位與甲氨基連接的結構，其吡啶環(huán)氮端無氰基連接也無其他具有去屏蔽效應的基團連接。因此推斷，CDAP降解的主產物結構與DMAP一致。

2.2 CDAP的降解程度 CDAP于8.08 ppm處的裂分峰，當其濃度為0.2 mg／mL以上時，8.08處質子峰信號已明顯高于檢測限（圖略）；濃度為0.1 mg／mL時為基線噪音的3倍以上；濃度為0.05 mg／mL時降低至2倍以下。見圖4。因此認為1H-NMR法測定CDAP的檢測限為0.1 mg／mL。由于CDAP降解產物中的CDAP濃度配制時為18.2 mg／mL，結合2.1.2項結果（CDAP降解產物圖譜未見8.08 ppm處的質子化學位移），表明其中CDAP已降解至無法檢出（0.1 mg／mL以下），因此其中CDAP的降解程度≥99.5%。

圖4 不同濃度CDAP的降解情況Fig.4 Degradation of CDAP at various concentrations

3 討論

基于CDAP的多糖蛋白結合工藝在pH 9.0有較高的多糖活化效率［11］，且多篇文獻均采用了pH 9.0作為活化多糖的條件［3-4］，因此，本研究選擇該環(huán)境進行CDAP降解，以模擬在結合過程中CDAP所處的溶液環(huán)境。本研究對多糖活化試劑CDAP在水環(huán)境中的降解產物進行了1H-NMR和13C-NMR分析，證實了CDAP在pH 9.0的堿性水溶液（重水）中降解的主產物為DMAP。

本研究紫外光譜分析表明，CDAP經(jīng)降解后其吸收峰由300 nm移至280 nm，與文獻［3］報道的一致，但無法依此判斷降解產物的結構。NMR分析條件溫和，且對樣品溶液pH環(huán)境無要求，可確保分析過程中供試品的穩(wěn)定性。由于-CN基團為吸電子基團（電負性），CDAP中各質子的化學位移受其去屏蔽效應影響，向低場移動。因此CDAP吡啶環(huán)2，6位質子的化學位移在8.08 ppm，而DMAP的質子化學位移在7.85 ppm，可依此區(qū)別CDAP與DMAP。本實驗通過基于8.08 ppm峰的變化情況，根據(jù)檢測限度進行了CDAP降解程度的分析。表明CDAP在堿性（pH 9.0）條件下的降解程度達99.5%。

考慮到多糖及多糖-蛋白結合物中質子峰可能對CDAP氫譜分析的干擾，本實驗僅在重水溶液環(huán)境中進行了純CDAP的降解研究，未在實際的多糖-蛋白結合過程中或過程后進行CDAP降解的研究。在今后的實驗中，將結合過程前后對反應體系取樣并通過透析、層析等手段獲得CDAP的降解產物，以對真實結合環(huán)境下的CDAP降解產物進行結構分析。

本研究結果表明，在多糖-蛋白結合過程中，未被消耗的過量CDAP會在堿性水溶液環(huán)境中降解成以DMAP為主的雜質，應將DMAP殘留納入基于CDAP活化的多糖-蛋白結合疫苗生產過程中殘留物分析的質量控制范圍。

志謝感謝武漢生物樣本庫有限公司及其核磁共振波譜設備負責人楊中正博士在核磁共振波譜技術和儀器使用上對本研究的支持