衡文，葉光斌，鄒偉

(四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 宜賓 644005)

丁酸(butyric acid)又名酪酸，是含4個碳原子的飽和一元羧酸，具有揮發(fā)性。丁酸應(yīng)用十分廣泛：在化工領(lǐng)域可作為原料用于熱塑性材料合成[1]；在食品領(lǐng)域可作為風(fēng)味成分增強食物風(fēng)味[2-4]；在飼料行業(yè)可作為新型飼料添加劑，提高牲畜的免疫力水平和營養(yǎng)價值，減少抗生素的使用[5]；在醫(yī)藥領(lǐng)域可作為輔助用藥對腸道具有修護作用[6-7]。2016年全球丁酸年產(chǎn)量已超過8×104t[8]，且呈逐年上升的態(tài)勢。目前，丁酸主要的生產(chǎn)方法可分為化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法。其中，微生物發(fā)酵法相較于化學(xué)合成法在環(huán)境保護、資源再利用等方面更具優(yōu)勢，更符合可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略，受到國內(nèi)外學(xué)者普遍關(guān)注。厭氧條件下，丁酸是酪丁酸梭菌(Clostridiumtyrobutyricum)、丁酸梭菌(C.butyricum)、楊木梭菌(C.populeti)等菌株主要代謝產(chǎn)物[9-11]。其中，C.tyrobutyricum因丁酸產(chǎn)量大、產(chǎn)率高、純度高、穩(wěn)定性好等優(yōu)勢，被認為是發(fā)酵生產(chǎn)丁酸最具商業(yè)化潛力的菌株[12-13]。

1 C. tyrobutyricum基本生物學(xué)特征

酪丁酸梭菌(Clostridiumtyrobutyricum)隸屬于芽孢桿菌科(Bacillaceae)、梭菌屬(Clostridium)，是具有丁酸生產(chǎn)能力的有機化能異養(yǎng)型專性厭氧菌。菌體中間隆起，其直徑約為0.3～2.0 μm×1.5～2.0 μm，端圓，單個或成對出現(xiàn)，菌體呈短鏈，偶見長絲狀菌體，周身鞭毛，能運動，革蘭氏染色呈陽性。平板上菌落表面呈圓形，稍突，邊緣完整，呈煎蛋狀，灰色半透明，表面有光澤，直徑約在1～3 mm。由于菌體中常有圓形或卵圓形的巨大芽孢，對高溫、高鹽、強酸等惡劣環(huán)境的耐受性強，在pH 4.5～7.0，35～37 ℃的條件下均能很好地生長[14]。C.tyrobutyricum因發(fā)酵乳酸破壞奶酪制品風(fēng)味而為人所熟知，常分離于動物消化系統(tǒng)、土壤、廢水、青貯飼料、乳制品污染環(huán)境樣品中。

2 C. tyrobutyricum丁酸發(fā)酵途徑解析

C.tyrobutyricum的主要代謝產(chǎn)物為丁酸和丁醇，常伴有副產(chǎn)物乙酸，也能產(chǎn)生少量乳酸和乙醇[15]。結(jié)合文獻和數(shù)據(jù)庫信息重構(gòu)C.tyrobutyricum利用不同底物(葡萄糖、木糖、甘油、甘露糖)合成丁酸及其相關(guān)副產(chǎn)物的代謝途徑，見圖1。

圖1 C. tyrobutyricum發(fā)酵產(chǎn)丁酸代謝途徑Fig.1 The metabolic pathway of producing butyric acid by C. tyrobutyricum注：(1)EMP途徑；(2)xylAB：木糖異構(gòu)酶、木糖激酶；(3)glyK：甘油激酶；(4)MK：甘露糖激酶；(5)LDH：乳酸脫氫酶；(6)PTA：磷酸甘油酯酶；(7)乙酸激酶；(8)THL：硫解酶；(9)BHBD：β-羥丁基輔酶A；(10)PTB：磷酸轉(zhuǎn)乙酰輔酶；(11)BUK：丁酰激酶；(12)AAD：醇/醛脫氫酶；(13)BDHA/BDHB：丁醇脫氫酶。

以葡萄糖作為底物時[16]，當(dāng)葡萄糖進入代謝途徑，通過EMP途徑將葡萄糖分解生成丙酮酸、NADH和ATP。生成的丙酮酸一部分在乳酸脫氫酶的作用下生成乳酸、NADH；另一部分丙酮酸在丙酮酸脫氫酶的作用下生成中間產(chǎn)物乙酰CoA。乙酰CoA又分別參與乙酸、乙醇及丁酸代謝通路：在乙酸代謝通路中，乙酰CoA在磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶的作用下生成乙酰磷酸，再進一步在乙酸激酶的催化下生成乙酸；在乙醇支路中，乙酰CoA在丙酮酸脫氫酶催化下生成乙醛，再在醇脫氫酶的作用下生成乙醇。丁酸合成途徑首先乙酰CoA在硫解酶的作用下生成乙酰乙酰CoA，再在β-羥基丁酰CoA脫氫酶的作用下繼續(xù)生成β-氫羥基丁酰CoA，此時巴豆酸酶發(fā)揮作用將β-羥基丁酰CoA轉(zhuǎn)化為巴豆酰CoA，后在丁酰CoA脫氫酶的作用下進一步生成關(guān)鍵前體物質(zhì)丁酰CoA，前體物質(zhì)在磷酸丁酰轉(zhuǎn)移酶、丁酰激酶的催化下最終形成丁酸。以木糖作為底物時[17]，木糖底物經(jīng)戊糖-磷酸途徑分解為果糖-6-磷酸和甘油醛-3-磷酸，然后經(jīng)過一系列酶的磷酸化、外膜化形成丙酮酸木糖[18]。以甘油作為底物時[19]，甘油在甘油激酶的催化下生成α-甘磷酸甘油，再通過脫氫變?yōu)榱姿岫u丙酮，再經(jīng)糖降解轉(zhuǎn)化為丙酮酸。以甘露糖為底物時[20]，在甘露糖激酶的作用下生成6-P-甘露糖，再經(jīng)異構(gòu)酶、激酶催化生成丙酮酸。不論是木糖、甘油還是甘露糖，都是通過一系列反應(yīng)生成中間產(chǎn)物丙酮酸，后續(xù)代謝途徑與葡萄糖代謝途徑一致，故不贅述。

3 C. tyrobutyricum利用生物質(zhì)原料發(fā)酵產(chǎn)丁酸

化學(xué)合成帶來的環(huán)境污染以及不可再生的自然資源消耗殆盡等問題不斷凸顯，迫使人們不得不尋找綠色經(jīng)濟可再生的原料代替化石燃料生產(chǎn)丁酸。生物質(zhì)資源作為地球上儲量最豐富的可再生性資源，全球每年通過光合作用生成的生物質(zhì)資源可以達到 2000億噸，所蘊含的能量是全球能量需求的數(shù)十倍[21]。其中以木質(zhì)纖維素形式儲存的能量能夠占到 60%以上，是地球上最為豐富的有機資源[22]，是代替化石燃料生產(chǎn)丁酸的絕佳原料。

表1 C. tyrobutyricum利用不同生物質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)丁酸研究Table 1 Study on production of butyric acid by fermentation of C. tyrobutyricum with different biomass

由表1可知，C.tyrobutyricum在不同發(fā)酵方式下對生物質(zhì)原料均具備較好的利用能力。自由細胞發(fā)酵時，由于傳質(zhì)能力的遞減及產(chǎn)物濃度的反饋抑制作用，C.tyrobutyricum發(fā)酵生產(chǎn)丁酸的能力未得到充分展現(xiàn)。利用固定化細胞進行發(fā)酵生產(chǎn)能夠一定程度上解決生產(chǎn)能力低下的問題[23-24]。生物質(zhì)原料雖然來源廣、成本低，但其復(fù)雜的細胞結(jié)構(gòu)增加了生物轉(zhuǎn)化的難度，水解液中酚類化合物對C.tyrobutyricum會造成毒害，這些問題在不同程度影響了C.tyrobutyricum產(chǎn)丁酸的發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，利用稀硫酸[25]、γ-戊內(nèi)酯/1-甲基咪唑二甲基亞磷酸復(fù)合體系[26]進行預(yù)處理能夠一定程度上破壞生物質(zhì)復(fù)雜結(jié)構(gòu)，目的產(chǎn)物產(chǎn)量分別增加了42.62%、46.8%。另外，采用混合生物質(zhì)發(fā)酵，能一定程度上降低水解液的毒害作用從而提高丁酸產(chǎn)量[27]。這些方法不僅對于C.tyrobutyricum發(fā)酵生物質(zhì)有效，同時也為其他具有生物質(zhì)發(fā)酵能力菌株的研究提供了參考思路。

4 遺傳工程改造C. tyrobutyricum發(fā)酵產(chǎn)丁酸

目前，C.tyrobutyricum發(fā)酵產(chǎn)丁酸主要受三類因素限制：底物攝取率低；菌株對丁酸、酚類物質(zhì)耐受程度低；丁酸代謝途徑復(fù)雜，代謝流分支較多。研究顯示：依靠遺傳工程技術(shù)，對菌株進行定向改造能夠有效打破這些限制，提高丁酸產(chǎn)量。

4.1 提高底物吸收效率

以葡萄糖介導(dǎo)的碳分解代謝物抑制效應(yīng)(carbon catabolite repression, CCR)是造成C.tyrobutyricum木糖分解率低下的主要原因。過量表達木糖質(zhì)子——同工酶(xylT)、木糖異構(gòu)酶(xylA)和木糖激酶(xylB)3個基因，通過分批發(fā)酵，產(chǎn)物產(chǎn)量由3.2 g/L提升至12.0 g/L，能有效打破CCR的限制。若在發(fā)酵液中加入紫羅堿(viologen BV)，人工電子載體加快電子的傳遞，Ct-pTBA的突變體經(jīng)自由細胞分批發(fā)酵，最終產(chǎn)量可達46.4 g/L，產(chǎn)率為0.43 g/g，產(chǎn)率為0.87 g/(L·h)。實驗還發(fā)現(xiàn)，該突變體在各種未脫毒木質(zhì)纖維素生物質(zhì)水解物中具備優(yōu)異的葡萄糖和木糖協(xié)同利用能力，通過自由細胞分批發(fā)酵丁酸終產(chǎn)量達29.7～42.6 g/L的較高濃度[34]。此外，克隆α-隆葡糖苷酶中的agluⅠ和agluⅡ?qū)隒.tyrobutyricum細胞內(nèi)，可使其獲得分解麥芽糖、淀粉的能力[35]?？寺≌崽谴x途徑的scrA，scrB，scrK基因，可使C.tyrobutyricum獲得蔗糖分解的能力[36]。此類研究拓展了C.tyrobutyricum可利用底物的范圍。

4.2 提高菌株耐受性

C.tyrobutyricum對環(huán)境中丁酸及酚類物質(zhì)濃度的耐受能力與Ⅰ類熱休克蛋白基因相關(guān)性較高，過表達groESL基因能有效提高C.tyrobutyricum對丁酸的耐受能力，而過表達dnaK則會降低其耐受能力。利用過表達groESL基因的菌株進行固定化細胞補料分批發(fā)酵丁酸最終產(chǎn)量可達52.2 g/L，較之前提高了15.2%[37]。天然基因groESL的過表達還能提高菌株對水解物中酚類物質(zhì)的耐受性，丁酸產(chǎn)量較野生型增加了26.5%，達到29.6 g/L[38]。除Ⅰ類熱休克蛋白外，過表達短鏈脫氫酶/還原酶(short-chain dehydrogenase/reductase，SDR)也能增強菌株對呋喃衍生物和酚類化合物的耐受性，當(dāng)SDR與groESL基因共表達時，丁酸產(chǎn)量還能得到進一步提升[39]。

4.3 調(diào)控丁酸代謝流

在丁酸代謝途徑中，磷酸甘油酯酶(phosphoransacetylase，pta)、乙酸激酶(butyrate kinase，ak)、磷酸轉(zhuǎn)乙酰輔酶(phosphotransbutyrylase，ptb)和丁酸激酶(butyrate kinase，bk)基因起著重要的作用。其中，pta和ak酶將乙酰CoA轉(zhuǎn)化為乙酸，ptb和bk酶催化丁基CoA生成丁酸。從代謝途徑進行分析，抑制乙酸支路代謝的進行，能促進代謝流更多流向丁酸發(fā)酵途徑，見圖1。

Zhu Y等[40]通過滅活pta基因?qū)⒍∷釢舛忍岣吡?0.8%(野生型：20.2 g/L，突變型：32.5 g/L)，pta、ak活性分別降低了60%、80%；進一步采用基因敲除技術(shù)敲除ak基因，在新型纖維床生物反應(yīng)器(fibrous bed bioreactor，F(xiàn)BB)體系中，細胞固定化發(fā)酵的最終丁酸濃度達到50.1 g/L較高水平[41]。Ptb基因在丁酸形成中十分重要，根據(jù)代謝通路圖可合理推測敲除ptb基因，丁酸生成將會降低。然而，Zhang Y等[42]研究發(fā)現(xiàn)敲除C.tyrobutyricum中的ptb基因，丁酸產(chǎn)量并無明顯變化。這可能是細胞中其他同工酶代替磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶發(fā)揮了作用。此外，過表達EMP途徑中的6-磷酸果糖激酶(pfkA)和丙酮酸激酶(pykA)也可一定程度上促進丁酸的累積[43]。研究發(fā)現(xiàn)，不管以何種方式去除乙酸、丁酸途徑中的關(guān)鍵基因，并不能完全阻斷對應(yīng)代謝產(chǎn)物的生成。這表明必須掌握完整的C.tyrobutyricum代謝網(wǎng)絡(luò)內(nèi)通量分布，進行系統(tǒng)全面的分析。目前已有13株C.tyrobutyricum完成全基因組測序[44]。借助于這些基因組信息可以構(gòu)建C.tyrobutyricum基因組規(guī)模的代謝網(wǎng)絡(luò)模型，結(jié)合相關(guān)約束性算法，可以更理性地指導(dǎo)C.tyrobutyricum代謝工程改造工作[45]。

5 生物反應(yīng)器改良

C.tyrobutyricum通過自由細胞發(fā)酵生產(chǎn)丁酸存在產(chǎn)量低、濃度低、產(chǎn)率低等不足[46]。傳統(tǒng)的生物反應(yīng)器周期長、設(shè)備利用率低、發(fā)酵中后期產(chǎn)率低等缺陷也不能滿足工業(yè)化產(chǎn)丁酸的目的。纖維床生物反應(yīng)器(fibrous bed bioreactor，F(xiàn)BB)能夠?qū)⒓毎潭ㄔ诶w維基質(zhì)中，并被廣泛應(yīng)用各種底物發(fā)酵生產(chǎn)丁酸，生產(chǎn)效率和產(chǎn)率得到顯著提高[47]。利用FBB法，C.tyrobutyricum經(jīng)補料分批發(fā)酵，丁酸產(chǎn)量達86.9 g/L，為現(xiàn)有報道最高值[48]。王金等[49]創(chuàng)新性地采用四柱FBB，與單柱發(fā)酵相比，四柱FBB提高了發(fā)酵效率，丁酸產(chǎn)量提高7.19%，產(chǎn)量提高136.7%，補料分批發(fā)酵丁酸最終濃度達到61.4 g/L。Huang J等針對丁酸發(fā)酵生產(chǎn)的需要，研制了一種新型的內(nèi)盤狀基體，該基體由不銹鋼絲組成，織物覆蓋在盤狀基體上，優(yōu)化各項因素后丁酸產(chǎn)率最優(yōu)值可達0.47 g/g。Luo H等[50]構(gòu)建了內(nèi)纖維床反應(yīng)器(internal fibrous bed bioreactor，IFBB)，通過補料分批發(fā)酵，丁酸的產(chǎn)量和生產(chǎn)效率分別達到45.38 g/L、0.630 g/(L·h)。在FBB的生產(chǎn)過程中，降低質(zhì)量梯度需要通過多次循環(huán)泵來實現(xiàn)，不僅增加了總投資，pH值也沒有得到及時的控制。而IFBB克服了FBB的不足，以更簡單的施工程序、更好的傳質(zhì)混合和更低的價格實現(xiàn)丁酸增產(chǎn)的目的，在工業(yè)化應(yīng)用上具有一定優(yōu)勢。

6 展望

目前，提高C.tyrobutyricum丁酸產(chǎn)量的途徑主要通過提高底物利用率、增強菌體耐受性以及促進丁酸代謝流3個方面進行。其中，江凌等人經(jīng)補料分批發(fā)酵得到丁酸產(chǎn)量最高值86.9 g/L。盡管國內(nèi)外對C.tyrobutyricum產(chǎn)丁酸已有較為深入的研究，但其代謝與調(diào)控機理仍并未得到全面解析。因此，提高C.tyrobutyricum丁酸產(chǎn)量的主要研究方向?qū)⒁岳眠z傳工程技術(shù)，借助生物信息學(xué)手段，對遺傳信息進行全面解析為目的，從而實現(xiàn)系統(tǒng)科學(xué)地指導(dǎo)丁酸發(fā)酵。同時，生物反應(yīng)器的不斷改進和優(yōu)化也是實現(xiàn)其規(guī)?；a(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵。隨著未來研究過程中對C.tyrobutyricum遺傳信息的進一步揭示以及蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等技術(shù)的發(fā)展與成熟，C.tyrobutyricum的生理代謝機制將被逐漸明確，其用于工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)丁酸也指日可待。