李 琰

(齊齊哈爾大學 食品與生物工程學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

醇法生產(chǎn)大豆?jié)饪s蛋白過程中，乙醇溶解了大部分可溶物質(zhì)，再經(jīng)多次濃縮處理后，得到副產(chǎn)物大豆糖蜜，故大豆糖蜜是大豆?jié)饪s蛋白產(chǎn)業(yè)的副產(chǎn)品[1]。大豆糖蜜全球年產(chǎn)量達10萬噸[2]，由于其性狀粘稠，深加工困難，故常用作廉價飼料，易造成資源浪費和環(huán)境污染[3]。大豆糖蜜中的主要成分糖類占比大約為59%～62%，同時含有蛋白質(zhì)、異黃酮、皂甙等，是很好的發(fā)酵底物，可用于多種產(chǎn)品的開發(fā)[4]。

目前，大豆糖蜜的研究呈多元化[5-6]，大豆糖蜜可用作微生物發(fā)酵的豐富碳源，用以產(chǎn)生乳酸、細菌纖維素、檸檬酸、生物燃料乙醇和丁醇等[7-10]。

大豆糖蜜的主要成分中，糖類占比最高，前期崔元峰等[11]、李振林[12]對大豆糖蜜發(fā)酵制備酒精開展了研究，但制作酒精造成大豆糖蜜中的低聚糖及功能性成分流失，本研究用大豆糖蜜添加活性干酵母釀造酒，生產(chǎn)出一種顏色鮮艷、口感宜人并具有保健功能的調(diào)味液基料，可作為調(diào)味液的酒香成分來源，并可提供調(diào)味醬的風味物質(zhì)，提高調(diào)味醬的防腐性能，抑制調(diào)味醬漲袋產(chǎn)酸等現(xiàn)象，并可進一步通過好氧發(fā)酵生產(chǎn)大豆肽食醋，具有一定的理論及現(xiàn)實意義。

對發(fā)酵型的調(diào)味液基料而言，菌種添加量、營養(yǎng)鹽添加量及發(fā)酵過程中溫度和pH對發(fā)酵結(jié)果有重要意義，本文以大豆糖蜜為材料，經(jīng)預處理，通過單因素實驗考察酵母添加量、營養(yǎng)鹽添加量、溫度和pH，設(shè)計正交實驗進行參數(shù)優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 原料

大豆糖蜜：黑龍江雙河松嫩大豆生物工程有限責任公司提供。

1.1.2 儀器

Waters 600高效液相色譜儀 美國Waters公司；HWS-250B生化培養(yǎng)箱 天津市泰斯特儀器有限公司；WZS10手提式折光糖度計、PHS-3C pH計 上海精密科學儀器有限公司；JA31001電子分析天平 上海良平儀器儀表有限公司；TU-1810紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.1.3 試劑

W-ADY葡萄酒高活性酵母：安琪酵母有限公司；磷酸氫二氨(分析純)、氫氧化鈉(分析純)：天津市凱通化學試劑有限公司；乙腈(色譜純)、蔗糖(標準品)、水蘇糖(標準品)、棉子糖(標準品)：北京譜析公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大豆糖蜜的預處理方法

因為其含有雜質(zhì)，導致微生物的污染比較嚴重，所以，在糖蜜稀釋的同時，需要進行滅菌、靜置、澄清等預處理，包括對其進行適當比例的稀釋，放入高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌，自然冷卻后靜置澄清。

1.2.1.1 稀釋

用量筒量取800 mL糖蜜置于三角燒瓶中，再加入800 mL無菌水，用玻璃棒混合至均勻，做好棉塞，包上報紙，待用。

1.2.1.2 加熱滅菌

加熱滅菌不僅可以去除待發(fā)酵液中的野生菌種，也對接下來的澄清有幫助。放入高壓蒸汽滅菌鍋中，121 ℃，30 min?？稍跍缇皩μ且旱膒H進行調(diào)節(jié)，可有助于滅菌。

1.2.1.3 澄清

滅菌后的液體自然冷卻后會出現(xiàn)明顯的分層，其較為澄清的上清液即可進行發(fā)酵(在未使用之前，盡量不要打開牛皮紙，避免染菌)。

1.2.2 大豆糖蜜釀造工藝流程

測量預處理后大豆糖蜜上清液的糖度；

確定糖蜜與水的稀釋比例，調(diào)節(jié)折光儀初始糖度為20 °Brix；

用30%的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH；

在121 ℃下滅菌30 min；

靜置冷卻后，添加磷酸氫二銨；

加入適當濃度的活性干酵母，混合均勻后發(fā)酵；

放入生化箱中恒溫培養(yǎng)72 h；

每隔12 h測量發(fā)酵液的糖度，并蒸餾測量酒度，監(jiān)測發(fā)酵進程；

選取發(fā)酵72 h后的樣品進行色譜分析。

1.2.3 酒度的測定

發(fā)酵液開始發(fā)酵后，每隔12 h取出100 mL的樣品，再加入100 mL的蒸餾水，混合均勻后進行蒸餾，取100 mL的液體置于量筒中，用酒度計測酒度，再根據(jù)溫度對照酒精計手冊得出酒度值。

1.2.4 還原糖的測定

用移液管取2 mL的發(fā)酵液，0號管中加入2 mL的蒸餾水，再分別在每個試管中加入1.5 mL的DNS溶液，放入沸水浴煮沸加熱5 min，拿出后立即冷卻，再加入21.5 mL的蒸餾水稀釋，然后測量吸光值，代入到標準曲線中求出糖度值。

1.2.5 低聚糖的測定

樣品前處理：將用水1∶1稀釋過的樣品與80%乙醇溶液等量混合，在10000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心5 min，取上清液過0.22 μL針頭過濾器，進行高效液相色譜測定。

色譜條件：色譜柱：Cosmosil sugar-D column(4.5 mm×250 mm，5 μm)；檢測器：示差檢測器；柱溫：30 ℃；流速：1 mL/min；流動相：ACN∶水為75∶25；進樣量：20 μL，時間：45 min。

1.2.6 感官評價

按 GB/T 15038-2005對釀造完成的樣品酒進行感官評價，評價標準見表1。

表1 感官評價表Table 1 The sensory evaluation criteria table

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗

采用1.2.1的方法對大豆糖蜜進行預處理后，調(diào)配糖度至20 °Brix，采用1.2.4和1.2.5的測定方法，測得總糖為189.94 g/L，其中蔗糖為104.83 g/L，棉子糖為11.55 g/L，水蘇糖為62.48 g/L。參考前人研究的結(jié)果，本文選擇發(fā)酵液初始糖度為20 °Brix，菌種采用葡萄酒釀酒干酵母，發(fā)酵時間為72 h，在此前提下，考察酵母添加量、營養(yǎng)鹽添加量、發(fā)酵pH和溫度對發(fā)酵后酒精度的影響。

2.1.1 酵母添加量對酒精度的影響

配制糖度為20 °Brix的發(fā)酵液，調(diào)節(jié)pH至4.5，加入0.3%的磷酸二氫銨，發(fā)酵溫度為26 ℃，分別加入2%、3%、4%、5%、6%的酵母，發(fā)酵72 h后測定酒度值，結(jié)果見圖1。

圖1 酵母添加量對酒精度的影響Fig.1 Effect of yeast additive amount on alcohol content

由圖1可知，酒精度隨著酵母添加量的增加急劇上升，當酵母添加量達到4%以后，增速放緩，這是由于酵母添加量達到一定程度后，發(fā)酵速度加快，酵母的生長也消耗了部分還原糖，酒精度的上升速度變緩，故4%是比較合適的酵母添加量。

2.1.2 營養(yǎng)鹽添加量對酒精度的影響

配制糖度為20 °Brix的發(fā)酵液，酵母添加量4%，調(diào)節(jié)pH至4.5，發(fā)酵溫度為26 ℃，分別加入0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的營養(yǎng)鹽，發(fā)酵72 h后測定酒度值，結(jié)果見圖2。

圖2 營養(yǎng)鹽添加量對酒精度的影響Fig.2 Effect of nutritive salt additive amount on alcohol content

添加適量營養(yǎng)鹽可以改善酵母菌的生長環(huán)境，為酵母的生長提供氮源，從而提高酵母的繁殖速度，增強酵母的活性，這對提高發(fā)酵產(chǎn)物的酒精濃度有明顯的作用，當添加量超過0.3%時，增加幅度變小，故0.3%是比較適合的營養(yǎng)鹽添加量。

2.1.3 發(fā)酵溫度對酒精度的影響

配制糖度為20 °Brix的發(fā)酵液，酵母添加量4%，調(diào)節(jié)pH至4.5，營養(yǎng)鹽添加量0.3%，發(fā)酵溫度分別為22，24，26，28，30 ℃，發(fā)酵72 h后測定酒度值，結(jié)果見圖3。

圖3 發(fā)酵溫度對酒精度的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on alcohol content

由圖3可知，酵母受溫度的影響非常明顯，當溫度處在較低水平時，酵母生長受到制約，酒精轉(zhuǎn)化率低，溫度過高使得酵母繁殖過快，菌種過快老化，后期酶活不足，影響酒精轉(zhuǎn)化率，在26 ℃時酒精度最高。

2.1.4 pH對酒精度的影響

配制糖度為20 °Brix的發(fā)酵液，酵母添加量4%，營養(yǎng)鹽添加量0.3%，發(fā)酵溫度26 ℃，發(fā)酵液pH分別調(diào)至3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，發(fā)酵72 h后測定酒度值，結(jié)果見圖4。

圖4 pH對酒精度的影響Fig.4 Effect of pH on alcohol content

由圖4可知，pH對酵母活性影響非常大，該酵母最適pH為4.5左右，此時酒精度最高。

2.2 正交實驗

單因素實驗能夠反映各因素對發(fā)酵的影響規(guī)律，這些規(guī)律可以幫助確定正交實驗的零水平，本實驗不考慮交互作用，故可設(shè)計 L9(34)正交實驗來確定大豆糖蜜制備果酒的最佳工藝條件，考察指標為發(fā)酵完成后酒精度和感官評價分數(shù)，因素水平編碼表見表2，正交實驗結(jié)果見表3。

表2 正交實驗因素水平編碼表Table 2 The factors and levels of orthogonal experiment

表3 正交實驗安排和結(jié)果Table 3 The experimental arrangement and results

由表2和表3可知，對于酒精度，4個因素對酒精度的影響次序是酵母添加量>發(fā)酵溫度>營養(yǎng)鹽添加量>pH，最優(yōu)組合為A2B3C2D2(酵母添加量4%，營養(yǎng)鹽添加量0.4%，發(fā)酵溫度26 ℃，pH 4.5)；對于感官評價而言，4個因素對感官評價的影響次序是酵母添加量>營養(yǎng)鹽添加量>發(fā)酵溫度>pH，最優(yōu)組合為A2B3C2D2(酵母添加量4%，營養(yǎng)鹽添加量0.4%，發(fā)酵溫度26 ℃，pH 4.5)。兩個目標值的最優(yōu)組合是相同的，所有大豆糖蜜的發(fā)酵工藝條件可以確定為酵母添加量4%，營養(yǎng)鹽添加量0.4%，發(fā)酵溫度26 ℃，pH 4.5。

2.3 驗證實驗

按正交實驗獲得的最優(yōu)組合，在酵母添加量4%，營養(yǎng)鹽添加量0.4%，發(fā)酵溫度26 ℃，pH 4.5的條件下進行發(fā)酵實驗，并檢測發(fā)酵品的酒精度和糖度，進行感官評價，結(jié)果見表4。

表4 驗證實驗結(jié)果Table 4 The results of verification experiment

由表4可知，正交實驗獲得的最優(yōu)組合是可信的，其發(fā)酵產(chǎn)物的酒精度達6.3%，感官評價分值為79，均是較優(yōu)水平。發(fā)酵后，蔗糖含量為9.37 g/L，說明發(fā)酵過程利用了91.1%的蔗糖，發(fā)酵效果較好，水蘇糖和棉子糖并未參與到發(fā)酵過程中，含量變化不大，略有損耗，水蘇糖的保留率為88.3%，棉子糖的保留率為92.7%。

3 結(jié)論

本文采用單因素實驗和正交實驗對大豆糖蜜發(fā)酵生產(chǎn)調(diào)味液基料的工藝條件進行了優(yōu)化，得到最佳工藝參數(shù)：酵母添加量為4%，營養(yǎng)鹽添加量為0.4%，發(fā)酵溫度為26 ℃，pH為4.5。在此條件下獲得的調(diào)味液基料酒精度為6.3%，感官評價分值為79分，功能性低聚糖保留率高，水蘇糖的保留率為88.3%，棉子糖的保留率為92.7%。