顧熙東，陳建棟，章曉鷹

克羅恩?。–rohn's disease，CD）是一種以非干酪樣肉芽腫為病理特征的腸道慢性炎性肉芽腫性疾病，是臨床上常見的炎癥性腸病。該病從口腔至肛門各段消化道均可受累，病程較長，病情反復(fù)，給患者的健康和生活帶來嚴(yán)重影響［1］。CD病因和發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前仍未完全明確，研究表明，環(huán)境、遺傳、腸道菌群失調(diào)、機(jī)體免疫狀態(tài)等均與CD的發(fā)生有密切關(guān)系［2，3］。輔助性T細(xì)胞（T helper cells，Th17）和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（T regulatory cells，Treg）是機(jī)體兩種重要的免疫細(xì)胞，正常情況下保持平衡狀態(tài)［4］。當(dāng)Th17／Treg比例失衡時可引起自身免疫疾病和炎癥性疾病的發(fā)生。已有研究表明，Th17／Treg比例失衡參與CD 的發(fā)生和發(fā)展［5］。中期因子（midkine，MK）是一種堿性肝素結(jié)合生長因子，研究表明MK可以誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生，起到加重炎癥級聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移的作用［6］。正五聚蛋白3（pentamerin 3，PTX3）是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種多聚體炎癥介質(zhì)，主要在機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)的部位產(chǎn)生，具有調(diào)節(jié)免疫防御和維持組織部位免疫平衡的作用，也是機(jī)體重要的炎癥調(diào)節(jié)器和炎癥識別分子［7］。本研究探討CD患者血清MK、PTX3水平與活動度指標(biāo)和Th17／Treg比值的關(guān)系，旨在為CD的臨床診斷及病情評估提供參考和依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

將2019年4月至2020年3月我院收治并確診為CD患者92例納入為研究組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者符合《炎癥性腸病診斷與治療的共識意見（2018年，北京）》［8］中CD的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②患者年齡≥18歲，具有完整的病歷資料；③患者自愿參加本研究，對本研究知情同意并簽署知情通知書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他自身免疫性疾病及炎癥性疾病者；②近6個月內(nèi)有感染、創(chuàng)傷及手術(shù)史者；③近6個月內(nèi)服用免疫制劑、抗炎藥物者；④妊娠哺乳期女性。其中男性52例，女性40例，年齡［31.32±6.67（18～42）］歲。根據(jù)簡化CD疾病活動指數(shù)（CD activity index，CDAI）［8］將患者分為緩解期組、輕度活動組、中重度活動組。緩解期組24例，男性14例，女性10例，年齡（30.88±4.97）歲；輕度活動組36例，男性20例，女性16例，年齡（31.24±4.76）歲；中重度活動組32例，男性18例，女性14例，年齡（31.76±4.81）歲。將同期本院體檢中心體檢的健康志愿者90例納入為對照組。其中男性50例，女性40例，年齡［32.05±6.43（18～43）］歲。四組受試對象性別、年齡比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)我院倫理委員會審批。

1.2 方法

1.2.1 CD疾病活動情況評價［8］于患者入院后1周內(nèi)應(yīng)用簡化CD疾病活動指數(shù)（CD activity index，CDAI）對疾病活動情況進(jìn)行評價，并分組，簡化CDAI包括5個維度：①一般情況（0分：良好；1分：稍差；3分：不良；4分：極差）；②腹痛（0分：無；1分：輕度；2分：中度；3分：重度）；③腹瀉：（每日稀便1次記1分）；④腹塊（0分：無；1分：可疑腹塊；2分：確定腹塊；3分：腹塊伴有觸痛）；⑤并發(fā)癥：每合并一種并發(fā)癥記1分，將以上5個維度的得分合計，計算總分，總分＜4分為緩解期組，總分5～8分為輕度活動組，總分≥9分為中重度活動組。

1.2.2 血清MK、PTX3、CRP、ESR的檢測 研究組患者入院時采集外周靜脈血4 mL，對照組體檢時采集外周靜脈血4 mL，各分裝2支試管，其中1支試管應(yīng)用魏式法測定ESR，靜置10 min后進(jìn)行離心，離心速度3 500 r／min，離心半徑6 cm，離心10 min分離血清，應(yīng)用免疫比濁法測定血清CRP水平，試劑盒購自深圳市國賽生物技術(shù)有限公司；另1支試管應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法測定血清MK、PTX3水平，試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司，所有操作嚴(yán)格按照操作說明進(jìn)行。

1.2.3 外周血Th17、Treg細(xì)胞的檢測 研究組患者于入院時采集外周靜脈血2 mL，立即加入肝素鈉250μL抗凝。Th17細(xì)胞的檢測：取100μL的全血標(biāo)記抗人CD8a-FITC、抗人CD3-APC 4℃避光孵育30 min，再加入MEDIUM A液100 μL，室溫條件下孵育15 min，緩沖液洗滌，加入MEDIUM B液和抗人IL-17A-PE 100μL 4℃下避光孵育30 min，緩沖液洗滌。Treg細(xì)胞的檢測：取100μL的全血標(biāo)記抗人CD4-FITC、抗人CD25-APC 4℃避光孵育30 min，加入紅細(xì)胞裂解液1 mL，室溫下孵育10 min，緩沖液洗滌，加入固定破膜液4℃避光孵育60 min，緩沖液沖洗后加入抗人FOXP3-PE4℃避光孵育30 min，沖液洗滌，應(yīng)用FACS Calibur流式細(xì)胞儀取細(xì)胞30 000個，進(jìn)行流式細(xì)胞計數(shù)，并應(yīng)用Flovjo 7.5軟件分析結(jié)果。

1.2.4 Th17、Treg相關(guān)細(xì)胞因子的檢測 研究組患者入院次日采集外周靜脈血2 mL，對照組體檢時采集外周靜脈血2 mL，靜置10 min后進(jìn)行離心，離心速度3 500 r／min，離心半徑6 cm，離心10 min分離血清，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法測定血清白細(xì)胞介素（Interleukin，IL）-10、IL-17、IL-23水平，試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司，嚴(yán)格按照操作說明進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理。計數(shù)資料用n（%）表示，采用χ2檢驗。計量資料用表示，多組數(shù)據(jù)比較應(yīng)用單因素方差分析，兩組數(shù)據(jù)比較應(yīng)用t檢驗。應(yīng)用Pearson相關(guān)性分析CD患者血清MK、PTX3水平與疾病活動度指標(biāo)和Th17／Treg比值的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究組與對照組血清MK、PTX3、CRP、ESR水平比較

研究組血清MK、PTX3、CRP、ESR顯著高于對照組（P＜0.05），見表1。

表1 研究組與對照組血清MK、PTX3、CRP、ESR水平比較（）

表1 研究組與對照組血清MK、PTX3、CRP、ESR水平比較（）

2.2 研究組與對照組Th17、Treg細(xì)胞比例及其相關(guān)細(xì)胞因子比較

研究組Th17、Th17／Treg及血清IL-10、IL-17、IL-23顯著高于對照組，Treg顯著低于對照組（P＜0.05），見表2。

表2 研究組與對照組Th17、Treg細(xì)胞比例及其相關(guān)細(xì)胞因子比較（）

表2 研究組與對照組Th17、Treg細(xì)胞比例及其相關(guān)細(xì)胞因子比較（）

2.3 不同活動度CD患者血清MK、PTX3、CRP、ESR水平比較

中重度活動組血清MK、PTX3、CRP、ESR顯著高于輕度活動組、緩解期組，輕度活動組血清MK、PTX3、CRP、ESR顯著高于緩解期組（P＜0.05），見表3。

表3 不同活動度CD患者血清MK、PTX3、CRP、ESR水平比較（）

表3 不同活動度CD患者血清MK、PTX3、CRP、ESR水平比較（）

注：*與緩解期組比較P＜0.05；＃與輕度活動組比較P＜0.05

2.4 不同活動度CD患者Th17、Treg細(xì)胞比例及其相關(guān)細(xì)胞因子比較

中重度活動組Th17、Th17／Treg及血清IL-10、IL-17、IL-23顯著高于輕度活動組、緩解期組，Treg顯著低于輕度活動組、緩解期組，輕度活動組Th17、Th17／Treg及血清IL-17、IL-23、IL-10顯著高于緩解期組，Treg顯著低于緩解期組（P均＜0.05），見表4。

表4 不同活動度CD患者Th17、Treg細(xì)胞比例及其相關(guān)細(xì)胞因子比較（）

表4 不同活動度CD患者Th17、Treg細(xì)胞比例及其相關(guān)細(xì)胞因子比較（）

注：*與緩解期組比較P＜0.05，＃與輕度活動組比較P＜0.05

2.5 CD患者血清MK、PTX3水平與疾病活動度指標(biāo)和Th17／Treg比值的相關(guān)性

Pearson相關(guān)分析顯示，CD患者血清MK與PTX3、CRP、ESR、CDAI、Th17／Treg呈正相關(guān)，PTX3與MK、CRP、ESR、CDAI、Th17／Treg呈正相關(guān)（P＜0.05），見表5。

表5 CD患者血清MK、PTX3水平與疾病活動度指標(biāo)和Th17／Treg比值的相關(guān)性

3 討論

近年來，炎癥性腸病在我國有明顯增多趨勢，其中CD是常見的炎癥性腸病［9］，炎癥和免疫因素均是公認(rèn)的CD發(fā)病重要機(jī)制［10］。已有研究表明，T細(xì)胞功能紊亂在CD發(fā)生、發(fā)展中起到重要的作用［11］。其中Th17細(xì)胞是一種近年來新發(fā)現(xiàn)的輔助性T細(xì)胞亞型，當(dāng)Th17細(xì)胞被激活后可以分泌IL-17，IL-17是T細(xì)胞誘導(dǎo)炎癥的啟動因子，可以促進(jìn)T細(xì)胞激活并刺激內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等產(chǎn)生IL-8、粒細(xì)胞-巨細(xì)胞刺激因子等，引起炎癥級聯(lián)反應(yīng)［12］。Treg細(xì)胞是一種調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，當(dāng)機(jī)體Treg細(xì)胞被激活后可以分泌IL-10，主要發(fā)揮抑制機(jī)體免疫反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫功能、維持自身免疫耐受等作用［13］。目前已有研究表明，當(dāng)Th17、Treg細(xì)胞比例失衡時可以導(dǎo)致腸道炎性反應(yīng)及腸道壁纖維化改變，最終引起CD［14］。目前臨床上對于CD活動度的診斷主要依靠CDAI或簡化CDAI對患者進(jìn)行評價，這種評價方法主要通過對患者一般情況、腹痛、腹瀉、腹塊、并發(fā)癥等進(jìn)行綜合評分，存在一定的主觀性。尋找評價CD患者疾病活動度的血清學(xué)指標(biāo)對于改進(jìn)CD病情評估方式具有重要意義。

本研究分析了CD患者與健康人血清MK、PTX3、CRP、ESR及Th17、Treg細(xì)胞失衡情況，結(jié)果顯示與健康人比較，CD患者存在Th17／Treg異常升高，與吳萬桂等［15］報道相符，證實Th17、Treg細(xì)胞比例失衡在CD發(fā)病中起到重要作用，即Th17／Treg異常升高時可以導(dǎo)致腸道發(fā)生炎性反應(yīng)，最終引起CD。除此之外，本研究結(jié)果顯示，CD患者存在血清MK、PTX3、CRP、ESR的異常升高。其中，MK是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種堿性肝素結(jié)合生長因子，最初在人體胚胎發(fā)于中發(fā)現(xiàn)［16］。研究表明，MK可以作為非小細(xì)胞肺癌檢測和預(yù)后評估的無創(chuàng)生物標(biāo)志物［17］，可以上調(diào)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的表達(dá)，是腎素-血管緊張素系統(tǒng)的一種新型調(diào)節(jié)因子［18］。最新研究表明，自身炎癥性疾病患者血清MK水平異常升高，其水平與疾病發(fā)生及發(fā)展有密切關(guān)系［19］。PTX3是一種由381個氨基酸組成的五聚體炎癥介質(zhì)，當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)炎癥反應(yīng)時，白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子等可由脂肪細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞分泌PTX3，起到調(diào)節(jié)免疫防御和維持組織部位免疫平衡的作用［20］。如文獻(xiàn)報道，CD患者存在Th17、Treg細(xì)胞比例失衡，可以進(jìn)一步引起IL-17、IL-10相關(guān)細(xì)胞因子異常升高，進(jìn)而刺激單核巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞分泌PTX3，導(dǎo)致血清中PTX3水平升高［21］。而IL-23主要由活化的巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和樹突細(xì)胞產(chǎn)生，可以作用于Th17細(xì)胞，并刺激其產(chǎn)生IL-17［22］。本研究結(jié)果表明血清MK水平升高可能與CD發(fā)生及發(fā)展有關(guān)。CRP、ESR均可以反映機(jī)體炎癥反應(yīng)情況［23］，由于CD患者存在腸道的炎癥反應(yīng)，因此患者CRP、ESR可以異常升高，同時本結(jié)果也支持MK、PTX3的異常升高可能與腸道炎癥反應(yīng)有關(guān)。

本研究結(jié)果還顯示，血清MK、PTX3、CRP、ESR與Th17、Treg細(xì)胞失衡情況和CD患者疾病活動度有密切關(guān)系。研究表明，CRP、ESR與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病腎病、急性心肌梗死等多種疾病有關(guān)，可以很好的反映機(jī)體炎癥活動情況［24-26］，而Th17／Treg是反映機(jī)體免疫狀態(tài)的重要指標(biāo)［27］。本研究結(jié)果表明，MK、PTX3、CRP、ESR、Th17／Treg均與CD活動度相關(guān)，其水平升高可以增加CD患者疾病活動度，因此臨床上對于CD患者可以通過檢測上述指標(biāo)，對CD活動度的評估提供幫助。筆者分析，MK可能通過激活免疫細(xì)胞，并上調(diào)細(xì)胞因子起到促進(jìn)中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的趨化性和組織浸潤的作用，影響CD活動度；而PTX3可能引起免疫失衡，影響CD活動度。

目前對于CD患者血清MK、PTX3與Th17、Treg細(xì)胞失衡相關(guān)的原因仍不清楚。筆者推測：一方面Th17、Treg細(xì)胞失衡可以引發(fā)IL、腫瘤壞死因子等異常升高，進(jìn)而導(dǎo)致PTX3、MK水平升高；另一方面在機(jī)體微炎癥狀態(tài)的作用下，腸道局部組織細(xì)胞也可以產(chǎn)生PTX3、MK，并引發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)，從而加重Th17、Treg細(xì)胞失衡，其具體機(jī)制有待于今后研究證實。

綜上所述，CD患者血清PTX3、MK水平異常升高，其水平與CD疾病活動度及Th17、Treg細(xì)胞失衡有關(guān)，通過對CD患者PTX3、MK的檢測可能為CD活動度的評估提供幫助。