吳建平，鄭煌洪，曾菠，程利鵬

自身免疫性肝?。╝utoimmune liver disease，AILD）是由于機體免疫系統(tǒng)對自身抗原失去免疫耐受而導致的一類慢性肝病，包括原發(fā)性膽汁性膽管炎（primary biliary cholangitis，PBC）、自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH）等［1-3］。由于肝臟細胞分泌的膽汁是脂代謝的重要媒介，當AILD發(fā)生時肝細胞受到損傷，肝臟分泌膽汁的能力被抑制，脂肪無法有效分解，從而造成脂代謝障礙，故AILD患者多存在脂代謝紊亂現(xiàn)象［4］。近年有研究認為除病毒感染（如乙型肝炎病毒、EB病毒、丙型肝炎病毒等）、藥物、遺傳易感性、酒精等因素外，腸道菌群移位至肝臟可能是AILD發(fā)病的關鍵環(huán)節(jié)之一［5-6］?，F(xiàn)階段國內(nèi)對AILD患者肝臟菌群的研究十分少見，因此本研究分析了AILD患者肝臟菌群多樣性和特異性，并探討AILD患者肝臟菌群多樣性、特異性菌群與脂代謝關系，以期明確肝臟菌群在AILD發(fā)病中的作用，為防治AILD提供新的方向，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

經(jīng)上海市靜安區(qū)閘北中心醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，前瞻性選擇2018年10月至2019年10月上海市靜安區(qū)閘北中心醫(yī)院收治的102例AILD患者，其中49例PBC患者納入PBC組，53例AIH患者納入AIH組；另選同期我院收治的50例肝囊腫患者為對照組。PBC組：男25例，女24例；年齡30～75歲，平均年齡（45.56±5.12）歲；體質(zhì)量指數(shù)（21.49±2.33）kg／m2；吸煙史25例；飲酒史30例。AIH組：男26例，女27例；年齡30～78歲，平均年齡（45.63±5.09）歲；體質(zhì)量指數(shù)（21.17±2.38）kg／m2；吸煙史26例；飲酒史32例。對照組：男25例，女25例；年齡30～76歲，平均年齡（46.23±5.52）歲；體質(zhì)量指數(shù)（21.24±2.29）kg／m2；吸煙史24例；飲酒史29例。各組年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)、吸煙史、飲酒史等一般資料無顯著差異（P＞0.05）。納入標準：①AILD患者依據(jù)《自身免疫性肝炎診斷和治療共識2015版》中相關診斷標準確診［7］；②入院前未接受任何與AILD有關的治療；③心、肝、腎、肺等重要臟器功能正常；④所有研究對象對本研究內(nèi)容知情了解，并簽訂知情同意書。排除標準：①哺乳期或妊娠期女性；②依從性差，無法配合完成本研究；③病歷資料不詳細；④合并其他肝病、其他自身免疫性疾病、惡性腫瘤、感染性疾病、精神系統(tǒng)疾病、傳染性疾病、心腦血管疾病、過敏性疾病、血液系統(tǒng)疾病；⑤入院前2個月內(nèi)口服抗菌藥物；⑥有肝活組織穿刺禁忌；⑦重度AILD。

1.2 研究方法

所有研究對象入院后記錄其年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)、吸煙史、飲酒史等一般資料，采集其晨起外周靜脈血3 mL，采用中國通用實驗科技有限公司的Pro-Sep S血液離心機，3 000 r／min離心15 min，分離血清，采用北京華興瑞達生物科技發(fā)展有限公司的DXC800全自動生化分析儀檢測血清低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（High density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、總膽固醇（total cholesterol，TC）水平，試劑盒由上海欽誠生物科技有限公司提供。所有研究對象行肝活組織穿刺檢查（圖1），在穿刺的整個過程中，嚴格無菌操作，常規(guī)消毒穿刺局部皮膚，術(shù)者戴無菌手套，鋪無菌孔巾，避免外源細菌污染。收集各組肝活檢組織20 mg，采用青島捷世康生物科技有限公司的基因組DNA提取試劑盒提取各組肝活檢組織中DNA，采用中國賽默飛世爾科技有限公司的NanoDrop 2000c分光光度計檢測DNA濃度及純度，對細菌16srRNA基因目標片段進行PCR擴增（引物序列：V3-V4：上游：GTGCCAGCMGCCGCGGTAA，下游：GGACTACHV GGGTWTCTAAT），PCR產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳，采用杭州仟諾生物科技有限公司的凝膠回收試劑盒對目標片段切膠回收，應用美國Promega公司的QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統(tǒng)對PCR擴增回收產(chǎn)物定量，應用武漢華大基因公司的Illumina Miseq平臺進行高通量測序，應用北京奧維森基因科技有限公司的COPE軟件統(tǒng)計樣品序列數(shù)目，應用北京環(huán)中睿馳科技有限公司的QIIME序列分析軟件，將序列聚類為用于物種分類的OTUs，結(jié)合物種組成信息結(jié)果，分析各組患者肝臟菌群多樣性及豐度，參數(shù)為Simpson多樣性指數(shù)、Shannon多樣性指數(shù)及瓊氏不動桿菌、橙色短波單胞菌、土壤短芽孢桿菌、嗜熱厭氧芽孢桿菌、萊比托游動球菌豐度。

圖1 肝穿刺活檢病理圖（HE染色×400）A：AIH組；B：PBC組；C：對照組

1.3 統(tǒng)計學方法

本研究數(shù)據(jù)的統(tǒng)計處理在SPSS 22.0軟件上進行。計量資料符合正態(tài)分布以表示，多組間計量資料比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗；計數(shù)資料用n（%）表示，組間計數(shù)資料比較采用χ2檢驗；采用Spearman相關性分析AILD患者肝臟菌群多樣性、特異性菌群與脂代謝的相關性。檢驗水準α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組患者肝臟菌群多樣性分析

PBC組和AIH組Simpson多樣性指數(shù)及Shannon多樣性指數(shù)顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；AIH組Simpson多樣性指數(shù)及Shannon多樣性指數(shù)與PBC組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組患者肝臟菌群多樣性分析（）

表1 各組患者肝臟菌群多樣性分析（）

注：與對照組比較，*P＜0.05

2.2 各組患者脂代謝指標檢測

PBC組和AIH組血清TC、TG水平顯著高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；AIH組血清TC、TG水平較PBC組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；各組血清LDL-C、HDL-C水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組患者脂代謝指標檢測（，mmoL／L）

表2 各組患者脂代謝指標檢測（，mmoL／L）

注：與對照組比較，*P＜0.05

2.3 各組患者肝臟菌群特異性分析

各組瓊氏不動桿菌、橙色短波單胞菌、土壤短芽孢桿菌豐度差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；PBC組嗜熱厭氧芽孢桿菌豐度顯著高于AIH組和對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；AIH組嗜熱厭氧芽孢桿菌豐度較對照組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；AIH組萊比托游動球菌豐度顯著高于PBC組和對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；PBC組萊比托游動球菌豐度較對照組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。PBC組患者肝臟特異性細菌為嗜熱厭氧芽孢桿菌，AIH組患者肝臟特異性細菌為萊比托游動球菌。見表3。

表3 各組患者肝臟菌群特異性分析（，%）

表3 各組患者肝臟菌群特異性分析（，%）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與PBC組比較，＃P＜0.05

2.4 Spearman相關性分析

AILD患者Simpson多樣性指數(shù)、Shannon多樣性指數(shù)、嗜熱厭氧芽孢桿菌豐度、萊比托游動球菌豐度與TC、TG均呈正相關（P＜0.05），見表4。

表4 AILD患者肝臟菌群多樣性、特異性菌群豐度與脂代謝的相關性

3 討論

3.1 AILD研究現(xiàn)狀

AILD是一組免疫介導的肝臟損傷，具有較高的發(fā)病率，多發(fā)于中年女性，臨床表現(xiàn)為食欲減退、乏力、肝區(qū)不適、腹脹、皮膚鞏膜黃染等，隨著病情進一步發(fā)展，可累及皮膚、關節(jié)等，引發(fā)肝纖維化、肝硬化、肝功能衰竭等，目前已成為西方國家進行原位肝移植的主要肝病之一，給患者健康水平及生活質(zhì)量帶來極大的負面影響［8-10］。因此早發(fā)現(xiàn)和早治療成為AILD診治工作的重點。

3.2 AILD患者肝臟菌群多樣性和特異性分析及其與脂代謝的相關性

近幾年腸道菌群成為臨床熱門的研究領域，受到各學者和臨床工作者的廣泛關注。由于腸道菌群與肝臟膽管系統(tǒng)的解剖結(jié)構(gòu)及生理功能存在密切聯(lián)系，使腸道菌群在肝臟疾病發(fā)病過程中的作用頗受關注［11-13］。腸道菌群是人體腸道內(nèi)種類繁多且數(shù)量龐大的正常微生物，正常狀態(tài)下，腸道菌群保持動態(tài)平衡，可與宿主免疫系統(tǒng)協(xié)同進化，互利共生，促進腸黏膜免疫系統(tǒng)發(fā)育，調(diào)控腸黏膜屏障功能，提高腸黏膜免疫功能，維持腸黏膜內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡，維持宿主健康，當腸道菌群動態(tài)平衡被打破，可出現(xiàn)宿主腸黏膜免疫代謝紊亂，腸黏膜屏障功能異常，腸道通透性增加，從而導致腸道菌群遷移至肝臟，引起肝臟病變［14-16］。既往研究顯示［17］非酒精性脂肪肝（Nonalcoholic fatty liver，NAFL）、肝硬化、慢性乙型重型肝炎等肝病發(fā)生及病情進展與腸道菌群存在緊密聯(lián)系，因此腸道茵群可能為某些肝病的治療靶點。另有研究顯示［18］格氏乳桿菌能夠刺激肝臟γδTCR 細胞分泌白細胞介素17（interleukin 17，IL-17）而引起AIH小鼠肝臟組織炎癥加重和肝纖維化。本研究顯示PBC組和AIH組Simpson多樣性指數(shù)及Shannon多樣性指數(shù)顯著高于對照組，AILD患者肝臟菌群多樣性明顯增加，可能是腸道菌群遷移至肝臟，肝臟內(nèi)特異性細菌增加所致。本研究顯示PBC組和AIH組血清TC、TG水平顯著高于對照組，血清LDL-C、HDL-C水平較對照組無顯著差異，這與既往研究一致［19］，提示AILD患者脂代謝明顯減弱。脂代謝減弱可導致腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白細胞介素6（interleukin 6，IL-6）、瘦素（leptin，LEP）等因子入血，促進肝臟組織炎癥反應，使肝臟長時間處于慢性炎癥的亞臨床狀態(tài)，且脂代謝減弱的AILD患者更容易發(fā)展為肝硬化［20-22］。本研究顯示PBC組嗜熱厭氧芽孢桿菌豐度顯著高于AIH組和對照組，AIH組萊比托游動球菌豐度顯著高于PBC組和對照組，提示AILD患者肝臟組織中可能存在疾病特異性細菌，PBC患者肝臟特異性細菌為嗜熱厭氧芽孢桿菌，AIH患者肝臟特異性細菌為萊比托游動球菌，提示肝內(nèi)特異性細菌可能參與了AILD發(fā)病過程。本研究相關性分析顯示AILD患者Simpson多樣性指數(shù)、Shannon多樣性指數(shù)、嗜熱厭氧芽孢桿菌、萊比托游動球菌與TC、TG呈正相關，提示AILD患者肝臟菌群多樣性越高，肝內(nèi)特異性細菌豐度越高，脂代謝減弱越明顯，這表明特異性細菌功能通路的異常改變可能參與AILD發(fā)病［23-25］，靶向調(diào)控腸道菌群結(jié)構(gòu)可能有助于AILD治療，臨床應該密切關注AILD患者腸道菌群，制定個性化治療方案，對患者預后進行改善。

綜上所述，AILD患者脂代謝明顯減弱，肝臟菌群多樣性明顯增加，肝臟存在特異性細菌，AILD患者肝臟菌群多樣性、特異性菌群與脂代謝具有顯著相關性，這可能是一種潛在的診斷和治療AILD的新靶點。