李秀娟，肖亞平，周 鈺

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院針灸推拿科，新疆 烏魯木齊 830000)

研究顯示，嚴(yán)重的創(chuàng)傷可引起一定程度的膿毒癥，同時(shí)可并發(fā)多器官功能障礙綜合征(Multiple organ dysfunction syndrome，MODS)和全身炎性反應(yīng)綜合征(Systemic inflammatory response syndrome，SIRS)[1]。在膿毒癥后期，MODS以及SIRS常常可引發(fā)不同程度的彌散性腦損傷，即為ICU常見(jiàn)的一種膿毒癥腦病(Sepsis associated encephalopathy,SAE)[2]。另外，其主要是一種彌散性腦功能障礙疾病，是由外周感染，而非明顯中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染引發(fā)[3]。相關(guān)研究顯示，膿毒癥伴有腦功能障礙時(shí)的死亡率相對(duì)較高[4]。此外有70%左右的患者伴有不同程度的認(rèn)知功能障礙，包括有記憶力、學(xué)習(xí)能力的降低以及注意力的改變等[5]。但目前臨床上對(duì)于其發(fā)病機(jī)制尚未有權(quán)威性說(shuō)明，且尚無(wú)相對(duì)有效的治療方法。本研究通過(guò)探討電針是否可以改變模型小鼠術(shù)后認(rèn)知功能損傷，為針灸對(duì)膿毒癥的臨床治療提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材 料 動(dòng)物和飼料均由湖南紫光古漢制藥股份有限公司提供，異氟烷和吸入麻醉機(jī)(武漢興起點(diǎn)生物科技有限公司)，小鼠白介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)檢測(cè)試劑盒購(gòu)于北京熱景生物技術(shù)有限公司；韓氏電針儀(M153934型)購(gòu)于無(wú)錫市裕龍電子科技有限公司，多功能酶標(biāo)儀(SpectraMax M3型；上海道尚生物科技有限公司)，對(duì)小鼠的處理過(guò)程均符合2006年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》[6]。

1.2 模型制備 盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(CLP)法制備膿毒癥小鼠，對(duì)小鼠進(jìn)行腹部備皮消毒、2%異氟烷吸入性麻醉后，沿著腹部正中線(xiàn)位置，在其下腹部切2.5 cm切口，將盲腸暴露出來(lái)，并對(duì)其根部進(jìn)行結(jié)扎處理，為形成腸瘺，采用16號(hào)針對(duì)小鼠盲腸進(jìn)行3次的貫穿性穿刺，留置橡皮條引流，避免針孔的閉合，最后將盲腸復(fù)位到腹腔位置，逐層縫合。術(shù)后按照50 ml/kg的比例，進(jìn)行0.9%氯化鈉溶液皮下注射以避免小鼠休克，自由飲水[7]。

1.3 分 組 按照處理方式的不同將模型組隨機(jī)分為膿毒癥組(A組)、膿毒癥+電針組(B組)、膿毒癥+電針?lè)墙?jīng)非穴組(C組)三組，各10只。其中B組術(shù)后給予雙側(cè)“足三里”穴位(腓骨小頭、膝關(guān)節(jié)后外側(cè)下約5 mm)7 mm針刺，之后連接電針儀進(jìn)行30 min的持續(xù)性刺激，刺激強(qiáng)度為2～100 Hz，2～3 mA；C組采用相同的強(qiáng)度和頻率對(duì)“非經(jīng)非穴”(穴位外側(cè)0.5 cm處)進(jìn)行刺激，而A組不進(jìn)行處理。另取10只同批次健康小鼠作為對(duì)照組(D組)。

1.4 觀察項(xiàng)目及測(cè)定方法

1.4.1 血清神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)濃度及炎癥因子水平：術(shù)后6 h，2%異氟烷吸入性麻醉，開(kāi)腹，腹部主動(dòng)脈取血，置于普通血漿管中，離心處理后，取上清液，采用酶標(biāo)儀，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附法對(duì)血清NSE、IL-6、TNF-α值進(jìn)行測(cè)定，試劑盒購(gòu)于美國(guó)R&D公司，操作方法嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)執(zhí)行。

1.4.2 海馬組織中丙二醛 (MDA)、過(guò)氧化氫酶(CAT)及超氧化物歧化酶 (SOD)水平：術(shù)后取出各組小鼠海馬組織，勻漿離心后，取上清液。采用可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)海馬組織中CAT、SOD的活性以及MDA質(zhì)量濃度進(jìn)行測(cè)定。試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所，操作方法嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)執(zhí)行。

1.4.3 海馬組織腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)水平：取海馬組織上清液，蛋白濃度采用BCA法進(jìn)行測(cè)定，加緩沖液進(jìn)行5 min煮沸變性處理，SDS凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，在采用5%的脫脂乳進(jìn)行1 h的封閉處理，加入一抗，4 ℃條件下孵育過(guò)夜，洗膜，再加入二抗，室溫條件下，進(jìn)行1 h的孵育。最后顯影采用電化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行，灰度值采用Image J軟件進(jìn)行分析處理，對(duì)海馬BDNF含量進(jìn)行測(cè)定。

1.4.4 行為學(xué)測(cè)試：小鼠建模完成后22 d，進(jìn)行相應(yīng)的曠場(chǎng)試驗(yàn)，將其放置于試驗(yàn)箱中，進(jìn)行5 min的探索，對(duì)中央格停留時(shí)間和運(yùn)動(dòng)總距離進(jìn)行記錄。28 d時(shí)進(jìn)行相應(yīng)的條件恐懼實(shí)驗(yàn)，訓(xùn)練階段將小鼠放入測(cè)試箱中進(jìn)行3 min的探索，之后進(jìn)行0.5 min的聲音刺激，最后進(jìn)行2 s的電刺激(0.75 mA)，在對(duì)30 s時(shí)間的僵直行為進(jìn)行記錄。在訓(xùn)練后24 h后，進(jìn)行真正的場(chǎng)景性恐懼測(cè)試，將小鼠置于訓(xùn)練試驗(yàn)箱中，進(jìn)行3 min的僵直行為監(jiān)測(cè)。2 h以后，進(jìn)行相應(yīng)的聲音條件性測(cè)試，先適應(yīng)3 min，之后給予相同聲音刺激條件下，監(jiān)測(cè)3 min的僵直行為，記錄各組大鼠的條件性僵直時(shí)間和場(chǎng)景性僵直時(shí)間[8]。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠術(shù)后血清TNF-α、IL-6和NSE水平變化比較 見(jiàn)表1。與D組相比，A組小鼠血清TNF-α、IL-6和NSE水平均升高(均P<0.05)；B組小鼠上述指標(biāo)明顯均低于A組(均P<0.05)；且C組和A組兩組小鼠上述指標(biāo)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

表1 各組小鼠術(shù)后血清TNF-α、IL-6和NSE水平變化比較

2.2 各組小鼠術(shù)后海馬組織SOD、MDA和CAT水平變化比較 見(jiàn)表2。與D組相比，A組小鼠海馬組織SOD、CAT水平均顯著降低，海馬組織MDA水平均升高(均P<0.05)；與A組相比，B組小鼠上述指標(biāo)均改善(均P<0.05)；且C組和A組兩組小鼠上述指標(biāo)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

表2 各組小鼠術(shù)后海馬組織SOD、MDA和CAT水平變化比較

2.3 各組小鼠術(shù)后海馬組織BDNF相對(duì)含量比較 見(jiàn)表3。與D組相比，A組小鼠海馬組織BDNF含量降低(P<0.05)；B組小鼠海馬組織BDNF含量明顯高于A組(P<0.05)；且C組和A組兩組小鼠上述指標(biāo)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 各組小鼠術(shù)后海馬組織BDNF相對(duì)含量比較(%)

2.4 各組小鼠術(shù)后行為學(xué)指標(biāo)變化比較 見(jiàn)表4。與D組相比，A組小鼠運(yùn)動(dòng)總距離顯著降低，中央格停留時(shí)間和場(chǎng)景性僵直時(shí)間升高(均P<0.05)；與A組相比，B組小鼠上述指標(biāo)改善(均P<0.05)；且C組和A組兩組小鼠上述指標(biāo)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

表4 各組小鼠術(shù)后行為學(xué)指標(biāo)變化比較

3 討 論

目前臨床上對(duì)于膿毒癥尚無(wú)特殊治療方法，出現(xiàn)相關(guān)并發(fā)癥時(shí)，給予相應(yīng)的對(duì)癥處理[9]。相關(guān)研究顯示，電針“足三里”治療膿毒癥患者，可以保護(hù)其肝腎、心臟以及腸道等外周器官，減輕其損傷[10]。而目前臨床上對(duì)于針刺治療膿毒癥術(shù)后腦損傷影響的報(bào)道相對(duì)較少，故本文制備小鼠膿毒癥模型，分析電針對(duì)膿毒癥后認(rèn)知功能障礙的影響。而相關(guān)研究顯示，對(duì)于膿毒癥患者，常常出現(xiàn)較為嚴(yán)重的炎性反應(yīng)[11]。IL-6和TNF-α是腦損傷的重要炎性指標(biāo)，其可傳遞外周炎性信號(hào)至大腦中，對(duì)腦部相應(yīng)炎性細(xì)胞進(jìn)行激活[12]。同時(shí)，IL-6和TNF-α還可影響腦血管細(xì)胞膜滲透性，破壞血腦屏障，腦部炎性反應(yīng)進(jìn)一步加劇[13]。而NSE是一種可以對(duì)膿毒性休克和膿毒癥患者腦功能損傷進(jìn)行有效反映的血漿標(biāo)志物，其表達(dá)和釋放與腦組織炎性反應(yīng)關(guān)系密切，對(duì)患者認(rèn)知功能障礙產(chǎn)生一定程度的影響[14]。文中炎性因子結(jié)果提示，電針“足三里”穴位，可以降低血清NSE水平，有效抑制腦組織炎性反應(yīng)，減輕腦功能損傷。盡管本文研究顯示，電針“足三里”可以有效的保護(hù)膿毒癥小鼠腦組織，避免其發(fā)生損傷，但其內(nèi)在作用機(jī)制尚不明確[15]。相關(guān)研究顯示，電針“足三里”主要是通過(guò)興奮膽堿能抗炎通路對(duì)臟器功能進(jìn)行保護(hù)[16]。另外，也有研究顯示，電針“足三里”可對(duì)迷走神經(jīng)傳出纖維放電和迷走中樞核團(tuán)進(jìn)行增強(qiáng)[17]。此外，電刺激迷走神經(jīng)可以降低腦損傷后神經(jīng)損傷、腦水腫以及血腦屏障通透性[18]。

大量研究顯示，氧化應(yīng)激反應(yīng)也是膿毒癥后腦功能損傷的重要因素。膿毒癥產(chǎn)生的內(nèi)毒素可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生大量活性氧簇，增加脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，降低機(jī)體抗氧化防御，致使機(jī)體抗氧化還原失衡[19]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有抗氧化防御弱、高代謝、高氧耗等特點(diǎn)，容易發(fā)生損傷，大量的活性氧簇可對(duì)細(xì)胞膜以及線(xiàn)粒體酶復(fù)合物進(jìn)行損傷，從而致使ATP合成障礙以及細(xì)胞氧供不足，最終引發(fā)細(xì)胞損傷甚至壞死[20]。在膿毒癥動(dòng)物模型中，給予外源性抗氧化劑可有效減輕腦損傷，尤其是與記憶和學(xué)習(xí)相關(guān)的海馬組織損傷[21]。CAT和SOD是一種內(nèi)源性抗氧化酶，可以對(duì)機(jī)體清除活性氧能力進(jìn)行有效反映。MDA可以反映活性氧破壞機(jī)體細(xì)胞的嚴(yán)重程度[22]。而文中氧化應(yīng)激結(jié)果顯示，電針“足三里”可以一定程度減少膿毒癥小鼠氧化產(chǎn)物、提高氧化酶活性。提示電針“足三里”可以有效保護(hù)小鼠腦部與記憶和學(xué)習(xí)相關(guān)的海馬組織，減輕腦部損傷。BDNF是保持突觸可塑性、維持神經(jīng)元存活的重要神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族成員[23]。相關(guān)研究顯示，伴有記憶力和學(xué)習(xí)力下降的膿毒癥患者，其海馬組織BDNF水平也呈現(xiàn)一定程度的降低[24]。而文中電針“足三里”可以一定程度增加BDNF的表達(dá)，提高小鼠認(rèn)知功能和突觸可塑性。文中小鼠行為學(xué)變化，提示電針“足三里”可以減少海馬炎性因子和應(yīng)激指標(biāo)的釋放，改善膿毒癥小鼠的認(rèn)知功能。

綜上所述，電針“足三里”可以有效的降低膿毒癥小鼠術(shù)后炎癥因子、應(yīng)激反應(yīng)指標(biāo)的釋放量，減輕腦部損傷，改善其認(rèn)知功能，對(duì)膿毒癥的臨床治療具有一定的指導(dǎo)意義。