黃 湲，吳遠(yuǎn)華，蔡 靜，張東蘭，丁 維，劉時(shí)喜，董紅彥

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550001；2.河北中醫(yī)學(xué)院,河北 石家莊 050200)

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是將藥理學(xué)和生物信息學(xué)結(jié)合，構(gòu)建“疾病-基因-靶點(diǎn)-藥物”網(wǎng)絡(luò)模型分析闡述藥物對(duì)疾病網(wǎng)絡(luò)作用機(jī)制。中藥復(fù)方具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)，可通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)整體性、系統(tǒng)性的研究方法，從生物分子層面多角度地對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行探討。

苗藥定痛湯由大血藤(那嘎青)、川芎(銳猛擺)、白芷(加丟呦)、苕葉細(xì)辛(龔稅苕)、炙甘草、全蝎、蜈蚣(崗叩)7味藥組成，是我科邵勇主任基于苗醫(yī)理論創(chuàng)立的治療偏頭痛的方劑，臨床應(yīng)用多年、療效確切。前期研究發(fā)現(xiàn)該方具有抑炎、抗氧化功效，但是對(duì)于苗藥定痛湯主要的活性成分及其作用機(jī)制仍不明確。因此，本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度，對(duì)苗藥定痛湯治療偏頭痛的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制進(jìn)行探索及研究，以期為后續(xù)研究和臨床應(yīng)用提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 苗藥定痛湯活性成分收集 分別以大血藤、川芎、白芷、苕葉細(xì)辛、炙甘草、全蝎、蜈蚣為檢索詞，從中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis，TCMSP)對(duì)上述藥物所有成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行篩選和構(gòu)建。篩選條件：OB (%)≥30，DL≥0.18；搜索TCMIP數(shù)據(jù)庫(kù)獲得并整合藥物潛在活性成分和相應(yīng)靶標(biāo)信息，獲得苗藥定痛湯活性成分-靶點(diǎn)數(shù)據(jù)。

1.2 偏頭痛相關(guān)靶點(diǎn) 利用疾病在線數(shù)據(jù)庫(kù)TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)、OMIM(https://omim.org/)、Genecards(https://www.genecards.org/)，以關(guān)鍵詞“migraine”進(jìn)行檢索，獲取偏頭痛相關(guān)的基因。將TCMSP和以上3個(gè)疾病數(shù)據(jù)庫(kù)中所檢索到的靶點(diǎn)名與Uniprot在線資源數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/)進(jìn)行聯(lián)合，采用R語(yǔ)言檢索分析，矯正靶點(diǎn)名稱，獲取優(yōu)選匹配度高者的相應(yīng)的基因。將矯正后苗藥定痛湯和偏頭痛基因進(jìn)行整合，選取交集基因，即苗藥定痛湯潛在的治療靶點(diǎn)。

1.3 可視化藥材-活性成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) 將得到的苗藥定痛湯活性成分-作用靶點(diǎn)-偏頭痛治療靶點(diǎn)整合，導(dǎo)入Cytoscape_v3.8.0 中對(duì)干預(yù)網(wǎng)絡(luò)可視化，并且應(yīng)用Analyzer工具對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 利用在線數(shù)據(jù)庫(kù)STRING(https://string-db.org/)，以人為物種限定，篩選條件：相互作用閾值>0.9，導(dǎo)入苗藥定痛湯治療偏頭痛的交集基因，建立“苗藥定痛湯-migraine”靶標(biāo)間的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)，保存PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)tsv文件并將其導(dǎo)入Cytoscape_v3.8.0 中，運(yùn)用Analyzer工具進(jìn)行優(yōu)化。

1.5 基因富集分析 運(yùn)用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/)對(duì)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能分析。以P≤0.01為限定條件，運(yùn)用Cytoscape_v3.8.0軟件中ClueGO插件進(jìn)行KEGG通路富集分析，從基因生物功能和信號(hào)通路的角度進(jìn)一步明確苗藥定痛湯對(duì)偏頭痛的作用機(jī)制，并為后續(xù)藥理學(xué)驗(yàn)證提供參考。

2 結(jié) 果

2.1 苗藥定痛湯組方活性成分篩選 通過(guò)TCMSP檢索苗藥定痛湯5味藥物(大血藤、白芷、細(xì)辛、川芎、甘草)所有化學(xué)成分，大血藤5個(gè)，白芷22個(gè)，川芎7個(gè)，細(xì)辛8個(gè)，甘草92個(gè)。根據(jù)限定閾值OB≥30%、 DL≥0.18進(jìn)行篩選，剔除重復(fù)后共得到107個(gè)活性成分，大血藤3個(gè)，白芷13個(gè)，川芎3個(gè)，甘草88個(gè)。

2.2 苗藥定痛湯治療偏頭痛直接作用靶點(diǎn)的篩選 將篩選的苗藥定痛湯活性成分作用靶點(diǎn)和3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中得到的2712個(gè)偏頭痛靶點(diǎn)進(jìn)行交集分析，選取交集基因共69個(gè)，即表示為直接作用于偏頭痛的靶點(diǎn)。

2.3 苗藥定痛湯活性成分-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò) 整合苗藥定痛湯藥材、活性成分、疾病靶點(diǎn)，于Cytoscape_v3.8.0 中構(gòu)建相互作用網(wǎng)絡(luò)，共有176個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中活性成分節(jié)點(diǎn)107個(gè)，靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)69個(gè)，綠色節(jié)點(diǎn)表示藥物活性成分，紅色節(jié)點(diǎn)代表藥物作用靶點(diǎn)。利用Cytoscape_v3.8.0中Network Analyzer插件計(jì)算網(wǎng)絡(luò)度值，根據(jù)Degree值排名最高的前五位中，以槲皮素(Quercetin)具有最多的潛在靶標(biāo)，其次是柚皮素(Naringenin)，山奈酚(Kaempferol)，異鼠李素(Isorhamnetin)，β-谷甾醇(Beta-sitosterol)，度值較高的藥物活性成分可能是苗藥定痛湯干預(yù)偏頭痛的活性組分，提示苗藥定痛湯多成分、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)(圖1)。

圖1 苗藥定痛湯活性成分-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.4 構(gòu)建和分析苗藥定痛湯與偏頭痛的PPI 為進(jìn)一步探索定痛湯干預(yù)偏頭痛的潛在藥理機(jī)制，將69個(gè)定痛湯作用靶點(diǎn)和偏頭痛疾病相關(guān)靶點(diǎn)的交集基因?qū)朐诰€數(shù)據(jù)庫(kù)STRING中分析，以閾值>0.9為篩選條件，隱藏游離基因，得到一張包含56個(gè)節(jié)點(diǎn)，118條邊的PPI圖及相應(yīng)tsv文件。將得到的文件導(dǎo)入Cytoscape_v3.8.0 中對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示，其中SIRT1與FOXO3、NFKB、IL-6均存在相關(guān)性。統(tǒng)計(jì)顯示關(guān)聯(lián)度最高的前30個(gè)靶點(diǎn)(EGFR、RELA、ESR1、FOS、CCND1、IL6、NR3C1、MYC、CASP8、NOS3、PRKCA、SIRT1、APOB、AR、VEGFA、CYP1A1、ERBB2、GSK3B、IKBKB、CHRM2、FOXO3、HIF1A、ICAM1、IRF1、NFKBIA、PGR、RASA1、BCL2、CAV1、ESR2)。

2.5 GO功能富集分析 運(yùn)用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)差異基因進(jìn)行功能富集，分別富集到生物學(xué)過(guò)程582個(gè)條目、分子功能60個(gè)條目，細(xì)胞組分64個(gè)條目。以FDR值為依據(jù)，分別篩選整合富集度排名前20條目進(jìn)行分析。以1～10個(gè)為組1，11～20個(gè)為組2，運(yùn)用在線工具imageGP(http://www.ehbio.com/ImageGP/index.php/Home/Index/GOenrichmentplot.html)對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化，其中X軸表示富集因子，Y軸為富集到的GO條目，氣泡顏色表示FDR值顯著性，顏色越紅值越小，氣泡大小表示富集在該條目中的差異基因數(shù)目。

生物學(xué)過(guò)程主要涉及有機(jī)物反應(yīng)、細(xì)胞凋亡調(diào)控，細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)、類固醇激素刺激、防御反應(yīng)、內(nèi)源性刺激反應(yīng)、對(duì)抗應(yīng)激反應(yīng)、分子功能的正調(diào)控、細(xì)胞因子刺激反應(yīng)等(圖2)。分子功能主要涉及類固醇結(jié)合、酶結(jié)合、蛋白二聚化、特定DNA序列結(jié)合、雌激素受體活性、NF-κB結(jié)合、神經(jīng)遞質(zhì)結(jié)合、表皮生長(zhǎng)因子受體活性、蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)合、乙酰膽堿結(jié)合等(圖3)；細(xì)胞組分主要涉及細(xì)胞分子、內(nèi)膜系統(tǒng)、細(xì)胞外空間等 (圖4)。

圖2 GO功能分析(BP)氣泡圖

圖3 GO功能分析(MF)氣泡圖

圖4 GO功能分析(CC)氣泡圖

2.6 KEGG通路富集分析 利用Cytoscape_v3.8.0軟件中的ClueGO插件對(duì)苗藥定痛湯干預(yù)偏頭痛差異基因進(jìn)行功能富集，以P<0.01為閾值，共富集到73條通路，其中相互作用關(guān)系有316個(gè)通路。選取P值最小的20個(gè)通路，運(yùn)用imageGP對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化(圖5)，其中X軸表示富集因子，Y軸為富集到的通路，氣泡顏色表示P值顯著性，顏色越紅值越小，氣泡大小表示富集在該通路中的差異基因數(shù)目。提示可能通過(guò)干預(yù)這些信號(hào)通路起到治療偏頭痛的作用。

3 討 論

本研究以篩選苗藥定痛湯潛在藥效成分為切入點(diǎn)，構(gòu)建“苗藥定痛湯-作用靶點(diǎn)-偏頭痛治療靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，共獲得69個(gè)苗藥定痛湯治療偏頭痛的潛在藥物靶點(diǎn)，73條樞紐信號(hào)通路，不僅顯示出苗藥定痛湯多成分、多靶點(diǎn)的作用特征，還反映出該方對(duì)偏頭痛多途徑的藥理作用。

苗藥定痛湯中大血藤入血分，養(yǎng)血活血、祛風(fēng)止痛，輔以辛香之川芎、白芷、全蝎、蜈蚣、細(xì)辛助脈氣通行，甘草緩急止痛，共奏通氣散血止痛之功，可用于治療瘀血阻絡(luò)型偏頭痛。本研究構(gòu)建的多維網(wǎng)絡(luò)中，其中槲皮素有最多的相互作用關(guān)系。研究表明，槲皮素可能通過(guò)抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路，抑制雙轉(zhuǎn)基因小鼠海馬組織中Toll樣受體4和NF-κB p65蛋白表達(dá)及腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis factor，TNF-a)、IL-1β、IL-6、環(huán)氧合酶2(Cyclooxygenase 2,COX2)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase，iNOS)mRNA表達(dá)，從而改善小鼠學(xué)習(xí)記憶能力和炎癥損傷[1]。槲皮素還能通過(guò)激活PI3K/Akt通路并抑制ERK1/2信號(hào)通路從而減弱神經(jīng)元細(xì)胞的自噬和凋亡，達(dá)到改善神經(jīng)功能缺損和認(rèn)知功能的作用[2]。柚皮素具有顯著的抗炎、抗氧化作用[3]。在體外糖氧剝奪(OGD)離體腦缺血模型和大腦中動(dòng)脈栓塞(MCAO)模型中，柚皮素干預(yù)后核因子E2相關(guān)因2(Nuclear factor erythroid-2 related factor 2，NRF2)基因的表達(dá)及抗氧化酶(SOD、NQO1)等水平上調(diào)，阻止線粒體去極化，凋亡相關(guān)蛋白(Caspase3/9)及丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、活性氧自由基(Reactive oxygen species，ROS)水平下降，具有保護(hù)線粒體功能，能有效對(duì)抗缺血缺氧病理過(guò)程中神經(jīng)元的氧化應(yīng)激損傷[4]。柚皮素可能通過(guò)激活PI3K/Akt/SIRT1信號(hào)通路有關(guān)，對(duì)心臟驟停-心肺復(fù)蘇大鼠心功能具有良好保護(hù)作用[5]。異鼠李素可通過(guò)激活Sirt1/PGC-1α信號(hào)途徑，減輕氧化應(yīng)激損傷，抑制細(xì)胞凋亡，發(fā)揮神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用[6]。山奈酚可通過(guò)抑制神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)起到減輕大鼠腦缺血再灌注損傷，起到腦保護(hù)作用，其抗炎機(jī)制可能與抑制NF-κB通路的激活有關(guān)[7]。β-谷甾醇因具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化等廣泛的藥理活性[8-10]。這些成分在網(wǎng)絡(luò)中Degree值較高，可知苗藥定痛湯中化合物可以從多方面發(fā)揮治療作用。

在通路富集分析中發(fā)現(xiàn)20條關(guān)鍵通路，其中Pathways in cancer是極為復(fù)雜的代謝通路，內(nèi)含環(huán)磷酸腺苷(Cyclic adenosine monophosphate,cAMP)、絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)、P13K/Akt、NF-κB、IL-6等多條通路，其中，P13K/Akt通路同樣位于富集分析排名中的前20。在交集基因中有29個(gè)富集在該通路中，且P值排在前20中也多參與這些通路。NF-κB和MAPK是偏頭痛進(jìn)程中的重要通路，與上調(diào)下游炎性介質(zhì)的釋放、介導(dǎo)神經(jīng)源性炎癥相關(guān)[11-12]。PPI網(wǎng)絡(luò)核心基因中的SIRT1不僅對(duì)血管性癡呆大鼠炎性通路NF-κB通路具有明顯的負(fù)向調(diào)控作用[13]，還可通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路降低高糖刺激心肌 H9c2 細(xì)胞的凋亡率和氧化應(yīng)激反應(yīng)[14]，調(diào)控 MAPK 信號(hào)通路改善脂毒性誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷[15]。另外，SIRT1可通過(guò)去乙?；诵幕蛑械腇OXO3a對(duì)抗氧化應(yīng)激損傷[16]。這提示苗藥定痛湯可能通過(guò)干預(yù)上述通路和靶點(diǎn)發(fā)揮治療偏頭痛的作用。

通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，對(duì)苗藥定痛湯治療偏頭痛可能的分子機(jī)制進(jìn)行探索分析。共篩選出苗藥定痛湯129個(gè)潛在活性成分和69個(gè)潛在治療靶點(diǎn)；GO分析包含生物學(xué)過(guò)程582個(gè)條目、分子功能60個(gè)條目，細(xì)胞組分64個(gè)條目。KEGG通路富集篩選出73條樞紐通路，發(fā)現(xiàn)其作用機(jī)制可能與P13K/Akt、MAPK、NF-κB、SIRT1等多條信號(hào)通路相關(guān)。提示苗藥定痛湯治療偏頭痛可能通過(guò)干預(yù)上述通路發(fā)揮作用，其中SIRT1與以上通路均存在密切聯(lián)系，我們將在后續(xù)研究中以SIRT1通路作為切入點(diǎn)，對(duì)苗藥定痛湯干預(yù)偏頭痛的藥效作用機(jī)制進(jìn)行探索研究。