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        CO2和乙酸鈉對雨生紅球藻生長及其蝦青素積累的影響

        2021-02-22 08:48:12虞新磊胡朝陽徐年軍
        核農(nóng)學(xué)報(bào) 2021年3期
        關(guān)鍵詞:雨生紅球藻乙酸鈉

        葉 鑫 虞新磊 胡朝陽 徐年軍 孫 雪

        (寧波大學(xué)海洋學(xué)院/浙江省海洋生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江寧波 315211)

        強(qiáng)抗氧化劑蝦青素(3, 3′-二羥基-4, 4′-二酮基-β, β′-胡蘿卜素)主要存在于甲殼動(dòng)物、藻類和微生物中,具有抵御紫外線傷害、提高免疫力、抑制腫瘤生長等作用[1]。雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)是蝦青素的優(yōu)質(zhì)天然來源,其積累蝦青素量最高可達(dá)細(xì)胞干重的 4.6%[2]。雨生紅球藻是綠藻綱(Chlorophyceae)紅球藻科(Haematococcaceae)的一種單細(xì)胞微藻,在低光、營養(yǎng)充足的環(huán)境中藻細(xì)胞呈綠色游動(dòng)狀態(tài),生長分裂迅速;在高光、高鹽、低氮等不利環(huán)境下藻細(xì)胞鞭毛消失、細(xì)胞壁增厚并靜止不動(dòng)開始積累蝦青素[3-4]。因此,目前利用雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素一般分兩個(gè)階段:首先在適宜的培養(yǎng)條件下促進(jìn)綠色營養(yǎng)階段藻的生物量積累,然后利用高光強(qiáng)等因素誘導(dǎo)厚壁孢子階段藻細(xì)胞的蝦青素積累。在這兩個(gè)階段碳源對藻的生長和蝦青素積累都起著重要的作用。

        CO2和碳酸氫鹽是雨生紅球藻培養(yǎng)中常用的無機(jī)碳源。與有機(jī)碳源相比,無機(jī)碳源可顯著降低培養(yǎng)基被微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)。研究表明,適當(dāng)提高CO2濃度不僅可以促進(jìn)雨生紅球藻的生長[5],還可刺激藻細(xì)胞脂質(zhì)積累和蝦青素的合成[6-7]。與乙酸鹽相比較,碳酸氫鹽可誘導(dǎo)雨生紅球藻細(xì)胞產(chǎn)生更多的蝦青素,且持續(xù)補(bǔ)充5% CO2后雨生紅球藻蝦青素合成速率與含量更高,最大分別可達(dá)6.25 mg.L-1.d-1和175.7 mg.L-1[8]。除無機(jī)碳源外,雨生紅球藻也可以利用乙醇、乙酸鹽、甘油、葡萄糖等常見有機(jī)碳源進(jìn)行兼養(yǎng)生長[9-12]。其中,乙酸鹽是雨生紅球藻培養(yǎng)中常用的廉價(jià)有機(jī)碳源。乙酸鹽可增強(qiáng)雨生紅球藻的呼吸作用,減少蝦青素積累時(shí)期高光脅迫對藻細(xì)胞的損傷,促進(jìn)藻的生長和蝦青素的積累[13],但乙酸鹽培養(yǎng)雨生紅球藻存在容易污染微生物、藻細(xì)胞活力低等問題[14]。研究表明,在雨生紅球藻培養(yǎng)過程中補(bǔ)充C5 有機(jī)碳可以極大地提高藻的生物量,改善藻細(xì)胞活力,且能減少污染[15]。

        綜上,無機(jī)碳源和有機(jī)碳源在促進(jìn)雨生紅球藻生長和蝦青素積累方面發(fā)揮了重要的作用。本研究選用4 倍空氣CO2濃度(0.16% CO2)和響應(yīng)面法優(yōu)化所得的乙酸鈉濃度(0.023 mol.L-1),比較了這2 種碳源對雨生紅球藻生長、蝦青素含量、酶活性和基因表達(dá)等參數(shù)的影響,以期為高效培養(yǎng)雨生紅球藻、提高蝦青素產(chǎn)量提供一定參考。

        1 材料與方法

        1.1 試驗(yàn)材料與分組試驗(yàn)

        雨生紅球藻藻株489,由寧波大學(xué)海洋生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室藻種庫提供,基礎(chǔ)培養(yǎng)基為NBM3#培養(yǎng)基[16]。綠色營養(yǎng)階段培養(yǎng)條件:溫度為25±0.5℃,光通量為40 μmol.m-2.s-1,光暗周期比為12 h ∶12 h,初始接種密度約為4×104個(gè).mL-1。厚壁孢子培養(yǎng):將生長到平臺(tái)期的綠色營養(yǎng)階段藻4 000 r.min-1離心5 min,收集藻細(xì)胞接入到等體積新鮮培養(yǎng)基中進(jìn)行高光脅迫(光通量150 μmol.m-2.s-1)以誘導(dǎo)蝦青素合成,培養(yǎng)溫度和光周期與綠色營養(yǎng)階段相同。

        試驗(yàn)共設(shè)置3 組處理:對照組(正常空氣,0.04%CO2)、高CO2組(0.16% CO2)、乙酸鈉組(正常空氣+0.023 mol.L-1乙酸鈉)。除碳源不同外,其他培養(yǎng)條件均相同。以上及后續(xù)試驗(yàn)每組均設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

        1.2 試驗(yàn)方法

        1.2.1 細(xì)胞形態(tài)觀察 分別在綠色營養(yǎng)階段培養(yǎng)1、5、8 d 時(shí)和厚壁孢子階段培養(yǎng)1、3、5、8 d 時(shí)取3 mL 藻液4 000 r.min-1離心5 min,將藻體沉淀重懸于300 μL新鮮培養(yǎng)基中(后期藻液密度高時(shí)進(jìn)行稀釋),制片后在CX21FS1 顯微鏡(OLYMPUS,日本)下放大400 倍觀察藻細(xì)胞形態(tài)和游動(dòng)性并拍照記錄。

        1.2.2 細(xì)胞生長曲線測定 在綠色營養(yǎng)階段培養(yǎng)過程中,每天定時(shí)取樣,使用UV-5200 紫外可見分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)測定680 nm 波長處的吸光度值(OD680),根據(jù)OD680(x)與細(xì)胞密度(y)關(guān)系曲線y=8.326 2x+0.072 7(R2=0.993 4)計(jì)算藻細(xì)胞密度。

        1.2.3 干重測定 在兩個(gè)階段雨生紅球藻培養(yǎng)的第8 天,分別于6 500 r.min-1離心(4℃)10 min 收集藻體,將藻體沉淀冷凍干燥48 h 后準(zhǔn)確稱重,然后將干藻粉保存在-80℃并用于后續(xù)試驗(yàn)。

        1.2.4 可溶性蛋白、總脂、總糖含量測定 分別稱取培養(yǎng)第8 天兩個(gè)階段的干藻粉各0.1 g(干重,DW),在液氮中充分研磨后,加入4 mL pH 值7.4 的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS),渦旋混合均勻后于6 500 r.min-1(4℃) 離心10 min,保留上清液。利用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量法測定可溶性蛋白含量[17];利用香草醛法測定總脂含量[18];使用總糖含量測試盒(蘇州科銘生物技術(shù)有限公司)測定總糖含量。

        1.2.5 蝦青素含量測定 參考崔丹丹等[19]的方法。準(zhǔn)確稱取0.01 g 厚壁孢子階段(第8 天)的干藻粉,加入10 mL 5% KOH+30%甲醇,室溫靜置5 min;6 000 r.min-1離心(4℃)3 min 后取藻體沉淀研磨5 min,然后加入10 mL 二甲基亞砜在30℃水浴中抽提蝦青素。反復(fù)抽提至藻體變白后,用UV-5200 紫外可見分光光度計(jì)測定OD490。蝦青素含量計(jì)算公式為:

        式中,C 為蝦青素含量,mg.g-1DW;OD490為樣品在490 nm 處的吸光度值;m 為樣品干重。

        1.2.6 基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析 在雨生紅球藻綠色營養(yǎng)階段的第4 ~第6 天和厚壁孢子階段的第1 ~第3 天,每天分別離心收集藻體,使用Trizol 試劑(Invitrogen,美國) 提取藻的總RNA。分別使用iScript cDNA Synthesis kit 和iTaq Universal SYBR Green Supermix 試劑盒(Bio-Rad,美國)進(jìn)行RNA 反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR。采用2-ΔΔCT法[20]計(jì)算基因的相對表達(dá)量。熒光定量PCR 引物采用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì),所用基因序列來自寧波大學(xué)藻類生物資源利用團(tuán)隊(duì)的雨生紅球藻轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果(表1)。

        1.2.7 酶活力測定 取綠色營養(yǎng)階段培養(yǎng)4、5、6 d和厚壁孢子階段培養(yǎng)1、2、3 d 時(shí)的藻液,6 500 r.min-1(4℃)離心10 min,每組取0.5 g 藻體(濕重,F(xiàn)W),經(jīng)液氮研磨后,2 000 r.min-1(4℃)離心10 min,上清液即為粗酶液。核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)活力測定方法參考李合生[21]的分光光度法,磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPC) 和蘋果酸脫氫酶( malate dehydrogenase,MDH)活力測定均使用蘇州科銘生物有限公司的試劑盒。

        表1 熒光定量PCR 的引物信息Table 1 Primer information for real-time quantitative PCR

        1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

        所有數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD,n=3)表示。數(shù)據(jù)分析和作圖使用Microsoft Office Excel 2017,并采用軟件SPSS 22.0 的單因素方差(one-way ANOVA)分析數(shù)據(jù)之間差異顯著性,P<0.05 表示差異顯著。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 碳源對綠色營養(yǎng)階段雨生紅球藻細(xì)胞狀態(tài)和生長的影響

        在綠色營養(yǎng)階段,不同碳源對雨生紅球藻細(xì)胞狀態(tài)的影響較明顯(圖1)。培養(yǎng)前4 天時(shí),3 組藻細(xì)胞都呈游動(dòng)狀態(tài),細(xì)胞活力較好。對照組雨生紅球藻從培養(yǎng)第7 天開始細(xì)胞活力減弱,少數(shù)藻的細(xì)胞壁開始變厚;高CO2組在培養(yǎng)第8 天時(shí)雨生紅球藻細(xì)胞活力仍然較好,呈游動(dòng)細(xì)胞狀態(tài);乙酸鈉組在培養(yǎng)第5 天時(shí)大約有10%~20%的藻細(xì)胞壁增厚變成厚壁孢子,培養(yǎng)第8 天時(shí)約有70%~80%的細(xì)胞靜止不動(dòng),約30%~40%藻細(xì)胞開始積累蝦青素。

        由圖2 可知,補(bǔ)充CO2和乙酸鈉對雨生紅球藻生長的促進(jìn)作用明顯。培養(yǎng)1 d 時(shí),藻細(xì)胞處于延滯期,細(xì)胞分裂緩慢;培養(yǎng)2 ~6 d 時(shí),高CO2和乙酸鈉組藻細(xì)胞生長速度超過了對照組,但兩組之間無顯著差異;培養(yǎng)7~8 d 時(shí),高CO2組藻細(xì)胞密度顯著高于乙酸鈉組。培養(yǎng)第8 天時(shí),高CO2、乙酸鈉組藻細(xì)胞密度分別為對照組的2.55、2.23 倍(圖2),干重分別為對照組的1.81、1.56 倍(表2)。綜上,提高CO2濃度或補(bǔ)充乙酸鈉都可顯著促進(jìn)雨生紅球藻的快速生長,且在培養(yǎng)后期CO2的促進(jìn)作用大于乙酸鈉。

        2.2 碳源對綠色營養(yǎng)階段雨生紅球藻生理生化參數(shù)的影響

        雨生紅球藻的生理生化參數(shù)受CO2濃度和乙酸鈉的影響(表2)。高CO2組和乙酸鈉組藻的可溶性蛋白含量顯著高于對照組,分別為對照組的1.89 和1.23 倍(P<0.05);高CO2組和乙酸鈉組藻的總糖含量分別是對 照 組的0.77(P<0.05)、1.09 倍(P>0.05);高CO2組和乙酸鈉組藻的總脂含量分別為對照組的0.65 和1.26 倍(P<0.05)。以上結(jié)果表明,CO2促進(jìn)了綠色營養(yǎng)階段雨生紅球藻蛋白質(zhì)的合成,抑制了其碳水化合物和脂類合成,而乙酸鈉則促進(jìn)了藻細(xì)胞蛋白質(zhì)和脂類的積累。

        2.3 碳源對綠色營養(yǎng)階段雨生紅球藻生長相關(guān)基因表達(dá)及酶活力的影響

        雨生紅球藻中Rubisco 大亞基、PEPC 和MDH 的編碼基因——rbcL、pepc2、mdh的轉(zhuǎn)錄表達(dá)對外源添加碳源的響應(yīng)不同(圖3)。培養(yǎng)4 ~6 d,高CO2組中rbcL轉(zhuǎn)錄表達(dá)較穩(wěn)定且與對照組無顯著差異,而乙酸鈉組藻rbcL 表達(dá)量在培養(yǎng)第5 和第6 d 時(shí)分別下降至對照組的57%和39%。在培養(yǎng)4~6 d 時(shí),pepc2 和mdh表達(dá)量在2 種碳源添加組中均較對照組升高,但兩組間基本無顯著差異(pepc2 在培養(yǎng)第6 天時(shí)除外)。

        CO2或乙酸鈉均顯著影響雨生紅球藻中Rubisco、PEPC 和MDH 活力(圖4)。培養(yǎng)過程中高CO2組藻細(xì)胞Rubisco 活力較為穩(wěn)定,且在培養(yǎng)第5 和第6 天時(shí)顯著高于其他兩組,表明適當(dāng)提高CO2濃度可以增強(qiáng)Rubisco 活力;乙酸鈉組中Rubisco 活力在培養(yǎng)前期與對照組無顯著差異,在培養(yǎng)第6 天時(shí)較對照組顯著下降。PEPC 和MDH 對高CO2和乙酸鈉的響應(yīng)相似,培養(yǎng)4~6 d 時(shí)較對照組均升高,在第6 天時(shí),高CO2和乙酸鈉組藻的PEPC 活力分別升高至對照組的1.98和1.45 倍,MDH 活力則分別升高至對照組的2.38 和2.01 倍。培養(yǎng)第6 天時(shí),乙酸鈉組的2 種酶活力均低于高CO2組。以上結(jié)果表明,2 種碳源都可通過顯著提高PEPC、MDH 的活力來加速檸檬酸循環(huán),為藻細(xì)胞生長提供充足能量。

        2.4 碳源對厚壁孢子階段雨生紅球藻細(xì)胞形態(tài)的影響

        由圖5 可知,2 種碳源對厚壁孢子階段藻細(xì)胞的影響不同。對照組在高光脅迫第1 天,細(xì)胞活力降低并少量積累蝦青素,但大部分細(xì)胞仍呈游動(dòng)狀態(tài);從脅迫第3 天開始部分細(xì)胞轉(zhuǎn)為厚壁孢子,并有少量細(xì)胞溶解;脅迫第8 天時(shí),大部分藻細(xì)胞積累蝦青素變紅,但仍有部分藻細(xì)胞為綠色。高CO2組中,高光脅迫第1 天,藻細(xì)胞活力好,游動(dòng)速度快;脅迫第3 天時(shí),少量藻細(xì)胞開始積累蝦青素;脅迫第5 天時(shí)大量細(xì)胞轉(zhuǎn)化為厚壁孢子同時(shí)細(xì)胞顏色變紅;脅迫第8 天時(shí),藻細(xì)胞中已積累較多蝦青素,但藻細(xì)胞狀態(tài)較好,基本無細(xì)胞溶解。乙酸鈉組中,高光脅迫后蝦青素快速積累,在脅迫第1 天時(shí)90%以上的藻細(xì)胞已變成厚壁孢子;脅迫3~8 d 時(shí),細(xì)胞內(nèi)紅色區(qū)域不斷擴(kuò)大,表明蝦青素持續(xù)積累,但從脅迫第5 天開始有少數(shù)藻細(xì)胞開始溶解,且溶解細(xì)胞數(shù)隨著脅迫時(shí)間延長而增多。

        圖2 綠色營養(yǎng)階段雨生紅球藻的生長曲線Fig.2 The growth curve of H. pluvialis at green vegetative stage

        表2 綠色營養(yǎng)階段雨生紅球藻生理生化參數(shù)Table 2 Physiological and biochemical parameter of H. pluvialis at green vegetative stage

        圖3 綠色營養(yǎng)階段雨生紅球藻生長相關(guān)酶的轉(zhuǎn)錄水平變化Fig.3 Expression levels of the growth-related enzymes of H. pluvialis at green vegetative stage

        2.5 碳源對厚壁孢子階段雨生紅球藻生理生化參數(shù)的影響

        在厚壁孢子階段,高CO2組和乙酸鈉組雨生紅球藻的生理生化參數(shù)與對照組差異顯著(除總脂含量外)(表3)。在脅迫第8 天時(shí),3 個(gè)試驗(yàn)組藻細(xì)胞干重分別為0.24、0.47、0.37 g.L-1。以單位體積藻液來計(jì)算,高CO2組和乙酸鈉組中蝦青素含量分別為2.76和2.13 mg.L-1,分別是對照組的2.40 和1.85 倍??梢娧a(bǔ)充CO2或乙酸鈉后藻細(xì)胞中蝦青素濃度顯著提高,且高CO2組大于乙酸鈉組。

        厚壁孢子階段雨生紅球藻的可溶性蛋白含量由高到低表現(xiàn)為高CO2組>乙酸鈉組>對照組。兩個(gè)處理組中藻的總糖含量均顯著低于對照組,但兩組間無顯著差異;碳源種類對厚壁孢子階段藻總脂含量無顯著影響。

        2.6 碳源對厚壁孢子階段雨生紅球藻基因表達(dá)和酶活力的影響

        在厚壁孢子階段雨生紅球藻中,蝦青素代謝相關(guān)酶八氫番茄紅素脫氫酶(phytoene desaturase,PDS)、β-胡蘿卜素羥化酶(β-carotene hydroxylase,CHY)和β-胡蘿卜素酮化酶(β-carotene ketolase,BKT)的編碼基因——pds、chy和bkt2 的轉(zhuǎn)錄表達(dá)對2 種碳源的響應(yīng)類似(圖6)。在脅迫1 ~2 d 時(shí),高濃度CO2總體抑制3 個(gè)蝦青素合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá),而在脅迫第3天時(shí),高CO2組中3 個(gè)蝦青素合成相關(guān)基因表達(dá)量上調(diào),與乙酸鈉組無顯著差異。與高CO2組不同,乙酸鈉組顯著促進(jìn)了3 個(gè)蝦青素合成相關(guān)基因的表達(dá)。脅迫第1 天時(shí),高CO2組pds、chy、bkt2 基因表達(dá)水平約為對照組的31%、41%和42%,而乙酸鈉組3 個(gè)基因表達(dá)量分別為對照組的3.11、2.94 和4.18 倍。

        圖5 厚壁孢子階段雨生紅球藻細(xì)胞形態(tài)Fig.5 Cell morphology of H. pluvialis at red cyst stage

        在厚壁孢子階段,雨生紅球藻Rubisco 活力對CO2或乙酸鈉的響應(yīng)不同(圖7)。在對照組與高CO2組中,Rubisco 活力隨著高光脅迫時(shí)間延長逐漸上升,而乙酸鈉組Rubisco 活力在脅迫1 ~3 d 內(nèi)無明顯變化。脅迫1~3 d 時(shí),與對照組相比,高CO2組促進(jìn)了雨生紅球藻Rubisco 活力的升高,而乙酸鈉則主要抑制了Rubisco 活力。在高光脅迫第3 天時(shí),高CO2組和乙酸鈉組Rubisco 活力分別為對照組的1.41 和0.50 倍(P<0.05)。雨生紅球藻中PEPC、MDH 活力在兩個(gè)處理組中的變化類似,活力均較對照組提高。

        表3 厚壁孢子階段雨生紅球藻生理生化參數(shù)和蝦青素含量Table 3 Physiological and biochemical parameter and astaxanthin content of H. pluvialis at red cyst stage

        3 討論

        3.1 CO2 和乙酸鈉對雨生紅球藻生長的影響

        CO2是藻類生長的重要碳源,因此在微藻培養(yǎng)過程中適當(dāng)提高環(huán)境CO2濃度,可以促進(jìn)藻細(xì)胞的光合作用,加速藻類生長。轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果表明,用15%CO2培養(yǎng)雨生紅球藻后,其光合作用、糖酵解、碳固定途徑等相關(guān)基因的表達(dá)均上調(diào)[22]。本研究結(jié)果顯示,CO2濃度從0.04%提高至0.16%后,藻生長加快,其細(xì)胞密度和干重都增加,這可能與藻的光合作用、能量代謝增強(qiáng)有關(guān)。同時(shí),較高的CO2濃度可以延緩藻細(xì)胞衰老,提高細(xì)胞的活力,因此在培養(yǎng)第8 天時(shí)藻細(xì)胞活力仍較好,細(xì)胞壁也未變厚。

        乙酸鹽是微藻培養(yǎng)中常用的有機(jī)碳源,可以使藻進(jìn)行異養(yǎng)生長。乙酸鹽進(jìn)入藻細(xì)胞后在乙酰CoA 合成酶(acetyl-CoA synthetase,ACS)的催化作用下直接生成乙酰CoA,后者又可以參與到檸檬酸循環(huán)和脂質(zhì)合成等代謝過程中。乙酸鈉可以促進(jìn)聚球藻(Synechococcus leopoliensis)生長,其主要原因是由于乙酸鈉增加了檸檬酸循環(huán)中的碳代謝流量[23]。本研究添加乙酸鈉后雨生紅球藻生長加快,但在培養(yǎng)后期,藻的生長速度和生物量均低于高CO2組,這可能與后期乙酸鈉組游動(dòng)藻細(xì)胞數(shù)量減少,部分藻細(xì)胞壁逐漸變厚并開始積累蝦青素有關(guān)。Pang 等[15]發(fā)現(xiàn)添加乙酸鈉會(huì)導(dǎo)致雨生紅球藻游動(dòng)性變差,培養(yǎng)至第7 天時(shí)游動(dòng)細(xì)胞數(shù)量只占總細(xì)胞數(shù)的7%,本研究結(jié)果與之相似。

        圖7 厚壁孢子階段雨生紅球藻生長相關(guān)酶活力Fig.7 Activities of growth-related enzymes of H. pluvialis at red cyst stage

        Rubisco 作為光合作用的關(guān)鍵酶之一,在植物細(xì)胞中主要起固定CO2的作用。加富1 000 ~1 500 μmol.L-1CO2可提高Rubisco 和Rubisco 活化酶的活力,從而提高黃瓜葉片凈光合速率[24]。CO2濃度升高可促進(jìn)擬柱胞藻(Cylindrospermopsis raciborskii)光捕獲效率和光合作用能量轉(zhuǎn)換效率,使Rubisco 活力增強(qiáng)[25]。本研究中高濃度CO2促進(jìn)了雨生紅球藻Rubisco 活力升高,提高了細(xì)胞固碳和光合效率,從而加速了藻的生長。乙酸鈉會(huì)抑制雨生紅球藻Rubisco活力和Rubisco 編碼基因的表達(dá)[26],本研究中乙酸鈉組藻細(xì)胞Rubisco 活力及rbcL表達(dá)水平在培養(yǎng)后期均下降,該結(jié)果與以上報(bào)道一致。PEPC、MDH 在植物細(xì)胞內(nèi)均可以催化草酰乙酸的生成,而草酰乙酸是檸檬酸循環(huán)中的一個(gè)重要中間產(chǎn)物。本研究中,CO2或乙酸鈉均提高了雨生紅球藻中PEPC、MDH 活力及其相關(guān)編碼基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá),CO2比乙酸鈉提高效果更明顯??梢?, CO2濃度升高可以促進(jìn)雨生紅球藻Rubisco、PEPC 和MDH 活力增強(qiáng),加快光合作用和檸檬酸循環(huán),從而促進(jìn)藻生物量的積累;而乙酸鈉則主要通過加速檸檬酸循環(huán)為細(xì)胞代謝提供更多能量,從而促進(jìn)藻的生長。

        無論在高光還是低光培養(yǎng)條件下,2 種碳源處理組雨生紅球藻Rubisco 活力變化趨勢基本一致,即高CO2濃度增強(qiáng)Rubisco 活力,乙酸鈉則抑制其活力。曾曉鵬等[27]發(fā)現(xiàn)160 μmol.m-2.s-1光強(qiáng)培養(yǎng)下,高CO2濃度可顯著增強(qiáng)三角褐指藻Rubisco 活力,使得藻細(xì)胞的凈光合效率得到提高。Zhang 等[13]發(fā)現(xiàn)添加乙酸鈉后,雨生紅球藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)和光合速率下降,光合作用減弱,該結(jié)果與本研究中乙酸鈉對Rubisco 活力的影響類似。在綠色營養(yǎng)和厚壁孢子階段,雨生紅球藻中PEPC 和MDH 活力均受高濃度CO2或乙酸鈉的誘導(dǎo),但誘導(dǎo)程度不同。

        3.2 CO2 和乙酸鈉對雨生紅球藻蝦青素積累的影響

        本研究中,乙酸鈉的添加對雨生紅球藻蝦青素合成有較大的影響。在綠色營養(yǎng)階段后期,乙酸鈉組中約30%~40%的雨生紅球藻細(xì)胞開始合成蝦青素;高光脅迫開始后藻細(xì)胞中蝦青素合成更加快速,在脅迫第1 天藻細(xì)胞即快速變紅。在高光脅迫條件下,乙酸鈉促進(jìn)雨生紅球藻合成蝦青素可能與乙酸鈉可增強(qiáng)細(xì)胞呼吸速率,為蝦青素合成提供充足碳骨架、提高藻細(xì)胞自身光保護(hù)作用有關(guān)[13]。

        PDS、CHY、BKT 是參與蝦青素合成的關(guān)鍵酶。本研究高CO2組中,這3 種酶的編碼基因表達(dá)量在脅迫1~2 d 時(shí)降低或無明顯差異,在脅迫第3 天時(shí)上升;而乙酸鈉組中,3 個(gè)相關(guān)基因在脅迫第1 天就開始快速大量表達(dá),說明乙酸鈉促進(jìn)蝦青素積累的速度比高CO2要快,而且這3 個(gè)蝦青素代謝相關(guān)酶的轉(zhuǎn)錄水平變化與高CO2組藻細(xì)胞變紅速度慢于乙酸鈉組的現(xiàn)象一致。Cheng 等[9]利用2%~10%CO2誘導(dǎo)雨生紅球藻積累蝦青素,0 ~5 d 時(shí)所有試驗(yàn)組蝦青素積累量均較低,而從第5 天開始蝦青素快速合成,這一現(xiàn)象與本研究類似。另外,Gao 等[28]研究表明,乙酸鈉在第0.5或第2 天能快速促進(jìn)雨生紅球藻蝦青素合成相關(guān)酶編碼基因的表達(dá),如八氫番茄紅素合酶基因(phytoene synthase,psy)、番茄紅素β-環(huán)化酶基因(lycopene beta cyclase,lyc)以及bkt基因。

        4 結(jié)論

        在綠色營養(yǎng)階段,2 種碳源均可以加快藻的生長、可溶性蛋白的合成,增強(qiáng)PEPC、MDH 活力及其基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。在厚壁孢子階段,2 種碳源均可以提高藻的生物量、蝦青素產(chǎn)量、3 個(gè)蝦青素合成相關(guān)酶的轉(zhuǎn)錄水平以及PEPC 和MDH 活力。綜上,適當(dāng)補(bǔ)充CO2或乙酸鈉均可促進(jìn)雨生紅球藻生物量和蝦青素的積累,但高CO2濃度培養(yǎng)的藻細(xì)胞狀態(tài)好,乙酸鈉則在促進(jìn)蝦青素的快速積累方面表現(xiàn)出一定優(yōu)勢。本研究在一定程度上闡明了這2 種碳源促進(jìn)雨生紅球藻生長和蝦青素積累的機(jī)理,為開展雨生紅球藻蝦青素的高效生產(chǎn)提供了參考。

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