蘇 旺 胡祿華 王 艦

(1青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院/青海省農(nóng)林科學(xué)院/青海大學(xué)省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/青海大學(xué)青藏高原生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/青海省馬鈴薯育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016；2 青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院，青海 西寧 810016)

作為青海東部旱區(qū)的特色優(yōu)勢作物[1]，馬鈴薯(Solanum tuberosumL．)以塊大、整齊、淀粉含量高、退化輕等特性享譽(yù)國內(nèi)外[2]。近二十年，壟溝集雨覆蓋栽培可使無效、微效降水形成徑流[3]，疊加到溝內(nèi)，且覆蓋后可抑制土壤水分蒸發(fā)，促進(jìn)水分下滲[4]，逐漸成為青海東部旱區(qū)馬鈴薯生產(chǎn)中的主要栽培技術(shù)。

馬鈴薯壟溝集雨覆蓋栽培的研究主要集中在土壤水分[5-6]、溫度[7]、酶活性[8]、微生物種類和數(shù)量[8]、產(chǎn)量及水分利用效率[9-13]等方面，有關(guān)淀粉合成關(guān)鍵酶活性及其基因表達(dá)的研究尚鮮見。前人多從品種、氮肥的角度分析馬鈴薯淀粉合成關(guān)鍵酶活性及其變化規(guī)律，從淀粉合成相關(guān)基因功能來探討馬鈴薯淀粉生物合成的分子基礎(chǔ)，如呂文河等[14]研究表明，馬鈴薯高淀粉品種克新22 號的可溶性淀粉合成酶(soluble starch synthase，SSS)、顆粒結(jié)合型淀粉合成酶(granule bound starch synthase，GBSS) 及淀粉分支酶(starch branching enzyme，SBE)活性均顯著高于低淀粉品種克新19 號；而楊華等[15]研究認(rèn)為，低淀粉品種CY-117的 ADP-葡萄糖焦磷酸化酶 ( ADP-glucose pyrophosphorylase，AGPP)、SSS 活性顯著高于高淀粉品種QS-2，且氮素主要是通過影響SSS 活性來實(shí)現(xiàn)對馬鈴薯塊莖淀粉含量的調(diào)控。研究表明，抑制表達(dá)異淀粉酶ISA1/2/3 基因[16]以及過表達(dá)超氧化物歧化酶SOD、抗壞血酸過氧化物酶APX基因[17]均顯著調(diào)控了馬鈴薯塊莖淀粉生物合成過程；楊濤等[18]對可溶性淀粉合成酶SSIII基因進(jìn)行了克隆及生物學(xué)分析；Yoo等[19]鑒定了SSIII基因的功能。

鑒于此，本研究以旱作馬鈴薯生產(chǎn)上大規(guī)模應(yīng)用的壟溝集雨覆蓋栽培模式為對象，探討其對馬鈴薯塊莖形成過程中淀粉合成關(guān)鍵酶活性、基因表達(dá)和淀粉累積的影響，分析淀粉合成關(guān)鍵酶活性、基因表達(dá)及淀粉累積間的相關(guān)性，旨在為青海東部旱區(qū)篩選馬鈴薯優(yōu)質(zhì)淀粉生產(chǎn)措施奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試驗(yàn)地概況

供試馬鈴薯品種為青薯9 號，由青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院提供。試驗(yàn)于2018年4月至9月在青海省西寧市城北區(qū)青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院試驗(yàn)基地(36．73°N，101．75°E)進(jìn)行。該基地位于青藏高原東北部，海拔2 339 m，屬大陸性高原半干旱氣候，6—9月降水集中，占全年降水量的70%，年均降水量380 mm，年均日照時(shí)數(shù)1 939．7 h，年均氣溫7．6℃，年均蒸發(fā)量1 363．6 mm，無霜期180 d。試驗(yàn)地耕層土壤含有機(jī)質(zhì)17．2 mg.kg-1，堿解氮147．1 mg.kg-1，速效磷21．0 mg.kg-1，速效鉀158．9 mg.kg-1，pH 值8．1。土壤質(zhì)地為栗鈣土，地力水平中上等。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用大田小區(qū)種植，單因素隨機(jī)區(qū)組排列，重復(fù)3次。設(shè)置2 種壟溝集雨覆蓋栽培模式，分別為地膜壟作(M03)和全膜雙壟(M02)，以露地平播(M01)為對照。其中，M03 為寬窄行種植，壟寬60 cm，溝寬30 cm，壟高15 cm，窄行30 cm，寬行60 cm，選用幅寬90 cm 地膜，小區(qū)面積5．4 m×5 m ＝27 m2，12 行區(qū)；M02 為寬窄行種植，大壟壟寬70 cm，壟高15 cm，小壟壟寬50 cm，壟高10 cm，窄行50 cm，寬行70 cm，選用幅寬120 cm 地膜，小區(qū)面積6 m×5 m ＝30 m2，10 行區(qū)；M01 為等行距種植，小區(qū)面積7 m×5 m ＝35 m2，行距70 cm，10 行區(qū)。各小區(qū)種植密度一致，均為4．28×104株.hm-2。采用0．013 mm 厚地膜。旱作，無灌溉。播前施磷酸二胺300 kg.hm-2、尿素225 kg.hm-2、硫酸鉀150 kg.hm-2，其他田間管理按照國家馬鈴薯品種區(qū)域試驗(yàn)進(jìn)行。2018年4月25日整地，4月26日播種，9月27日統(tǒng)一收獲。

在馬鈴薯匍匐莖頂端開始膨大至成熟收獲期間，按照時(shí)間順序依次取樣，具體取樣時(shí)期如下：塊莖形成期后期(第一花序開始開花，S1)、塊莖增長期前期(盛花期，S2)、塊莖增長期后期(莖葉開始衰老，S3)、淀粉積累期中期(植株基部1/3 左右莖葉枯黃，S4)、淀粉積累期后期(植株基部2/3 左右莖葉枯黃，S5)、成熟期(植物地上部莖葉全部枯黃，S6)。各處理各重復(fù)小區(qū)內(nèi)選擇長勢均勻的2 株進(jìn)行取樣，取樣部位為每株馬鈴薯全部塊莖。

實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，去除塊莖泥土，選取大小一致的薯塊，分別在頂、中、底部各取1 片0．5 cm 厚的薯片，切成0．1～0．2 cm2大小一致的顆粒，混勻，稱量4．00 g，置于-80℃超低溫冰箱中保存，其中，2．00 g 用于測定AGPP、SSS、GBSS、SBE 活性，2．00 g 用于測定ADP-葡萄糖焦磷酸化酶AGPase、可溶性淀粉合成酶SSII、SSIII、顆粒結(jié)合型淀粉合成酶GBSSI、淀粉分支酶SBEI、SBEII基因表達(dá)量。剩余部分用于測定馬鈴薯塊莖總淀粉含量及直鏈淀粉含量。

1.3 測定項(xiàng)目與方法

1．3．1 淀粉合成關(guān)鍵酶活性 AGPP、SSS 和GBSS 粗酶液制備：取1．00 g 馬鈴薯塊莖，碾磨成粉樣，加入800 μL 提取液[終濃度為：50 mmol.L-14-羥乙基哌嗪乙磺酸(4-hydroxyethyl piperazine ethanesulfonic acid，Hepes)(pH 值7．2 ～7．4)、5 mmol.L-1乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)、1 mmol.L-1二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)、2 mmol.L-1KCl、1%聚乙烯吡咯烷酮40(polyvinyl pyrrolidone 40，PVP-40)]，研磨成勻漿后置于離心管中，于4℃條件下10 000 r.min-1離心30 min，收集上清液作為AGPP 與SSS 活性測定的粗酶液。將離心所得沉淀用800 μL提取液洗滌后，懸浮于提取介質(zhì)中，作為GBSS 活性測定的粗酶液。

SBE 粗酶液制備：取1．00 g 馬鈴薯塊莖，加入800 μL提取液[含50 mmol.L-1Hepes-NaOH(pH 值7．5)、5 mmol.L-1EDTA、1 mmol.L-1DTT、2 mmol.L-1KCl、1% PVP-40]，研磨成勻漿后置于離心管中，于4℃條件下15 000 r.min-1離心15 min，收集上清液作為SBE 活性測定的粗酶液。

參照Nakamura 等[20]的方法測定AGPP、SSS、GBSS 活性；參照李太貴等[21]和程方民等[22]的方法測定SBE 活性。

1．3．2 淀粉合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)量 取-80℃超低溫冰箱保存的塊莖顆粒，采用Trizol 法提取RNA[23]，同時(shí)，去除基因組DNA。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 第一鏈，20 μL反應(yīng)體系及程序：RNA+水10．5 μL，OligodT(18) 2 μL，65℃加熱5 min，迅速冰浴2 min，后加入5×RT buffer 4 μL，RT enzyme 1 μL， RNase-free 水0．5 μL，dNTP 2 μL，42℃孵 育80 min，70℃加 熱15 min。根據(jù)NCBI 公布的基因RNA 序列，使用Premier 5．0 軟件設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative ral-time PCR， qRT-PCR)引物(表1)，并在擴(kuò)增反應(yīng)完成后，繪制溶解曲線，以保證引物特異性。以cDNA 為模板，Tublin1 為內(nèi)參基因。使用10 μL PCR 反應(yīng)體系：2×RealStar Green Power Mixture (with ROX Ⅱ) 5 μL，引物各0．4 μL，cDNA 1 μL，水3．2 μL。PCR 反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火60 s，72℃延伸1．5 min，40 個(gè)循環(huán)。各樣品重復(fù)3 次，參照ΔCt法計(jì)算目的基因相對表達(dá)量[24]。

表1 qRT-PCR 目的基因引物Table 1 Target gene and sequence of qRT-PCR primers

1．3．3 淀粉累積

1．3．3．1 總淀粉含量測定 取部分馬鈴薯塊莖切碎、烘干及粉碎，采用碘量法[25]測定馬鈴薯總淀粉含量，每份樣品測定3 次，取平均值。根據(jù)公式計(jì)算淀粉含量：

式中，R值為從標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出的濃度。

1．3．3．2 直鏈淀粉含量測定 取剩余馬鈴薯塊莖采用自然沉降法[26]提取淀粉，稱2 mg 淀粉樣品于燒杯中，加入0．5 mL 35%高氯酸溶液，稍加震蕩，待樣品完全溶解后加入8 mL 蒸餾水，混合均勻后得到混合樣；另取一燒杯加入0．5 mL 35%高氯酸和8 mL 蒸餾水做空白對照。分別取樣品混合樣和空白對照各600 μL于2 個(gè)比色皿中，然后在比色皿中依次加入300 μL 碘液、1 800 μL 蒸餾水?；旌暇鶆颍謩e于550 nm和618 nm 波長處測定其吸光度值，重復(fù)3 次。根據(jù)公式計(jì)算直鏈淀粉含量[27]：

式中，R＝618 nm 波長處吸光度值/550 nm 吸光度值。

1．3．3．3 直/支鏈淀粉比 支鏈淀粉含量＝1-直鏈淀粉含量；直/支鏈淀粉比＝直鏈淀粉含量/支鏈淀粉含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用Microsoft Excel 2007 和SAS V8．0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan 法進(jìn)行樣本之間的多重比較(a＝0．05)，采用Pearson 法進(jìn)行相關(guān)性分析(a＝0．05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 淀粉合成關(guān)鍵酶活性

ADP 葡萄糖焦磷酸化酶(AGPP)、淀粉合成酶(SSS、GBSS)、淀粉分支酶(SBE)、淀粉去分支酶等淀粉合成關(guān)鍵酶相互協(xié)調(diào)、共同作用完成作物淀粉生物合成。由表2 可知，在馬鈴薯塊莖形成過程中，各淀粉合成關(guān)鍵酶活性波動較大；從塊莖發(fā)育全程來看，馬鈴薯塊莖的AGPP、GBSS 活性平均表現(xiàn)為露地平播(M01)＞地膜壟作(M03)＞全膜雙壟(M02)，M02、M03馬鈴薯塊莖的SSS 活性分別較M01 平均提高77．70%和22．63%(P＜0．05)，而M01、M02 和M03 馬鈴薯塊莖的SBE 活性無顯著差異?？梢姡趬K莖形成過程中，壟溝集雨覆蓋栽培顯著降低了旱作馬鈴薯AGPP、GBSS 活性，顯著提高了可溶性SSS 活性，其中，以全膜雙壟最為明顯。

2.2 淀粉合成關(guān)鍵酶基因相對表達(dá)量

各淀粉合成關(guān)鍵酶間存在種間功能異化的亞型，在作物淀粉生物合成中扮演各自獨(dú)特的作用。由表3可知，在馬鈴薯塊莖形成過程中，淀粉合成關(guān)鍵酶基因相對表達(dá)量總體均呈升高趨勢；從塊莖發(fā)育全程來看，馬鈴薯塊莖中AGPase、SSII、GBSSI、SBEI、SBEII基因

平均相對表達(dá)量均表現(xiàn)為M01＞M03＞M02，M03、M02馬鈴薯塊莖中SSIII基因相對表達(dá)量分別較M01 提高119．35%、32．26%(P＜0．05)?？梢姡趬K莖形成過程中，壟溝集雨覆蓋栽培顯著降低了旱作馬鈴薯AGPase、SSII、GBSSI、SBEI、SBEII基因表達(dá)量，以全膜雙壟最為明顯；顯著提高了SSIII基因表達(dá)量，以地膜壟作最為明顯。

表2 壟溝集雨覆蓋栽培模式對旱作馬鈴薯塊莖形成各時(shí)期淀粉合成關(guān)鍵酶活性的影響Table 2 Effects of mulching on ridge-furrow for harvesting rainwater on activity of starch synthesis key enzyme at each period of tuber formation in rainfed potato /(U·g-1·min-1)

表3 壟溝集雨覆蓋栽培模式對旱作馬鈴薯塊莖形成各時(shí)期淀粉合成關(guān)鍵酶基因相對表達(dá)量的影響Table 3 Effects of mulching on ridge-furrow for harvesting rainwater onrelative gene expression of starch synthesis key enzyme at each period of tuber formation in rainfed potato

2.3 淀粉累積

淀粉累積決定著作物淀粉品質(zhì)的優(yōu)劣。由表4 可知，在馬鈴薯塊莖形成過程中，塊莖總淀粉含量、直鏈淀粉含量和直/支鏈淀粉比波動較大；從塊莖發(fā)育全程來看，M02 馬鈴薯塊莖總淀粉含量、直鏈淀粉含量和直/支鏈淀粉比分別較M01 提高5．04%、17．57%、27．81%，而M03 分 別 較M01 降 低5．71%、42．43%、47．68%?？梢姡趬K莖形成過程中，與地膜壟作相比，全膜雙壟覆蓋栽培顯著提高了旱作馬鈴薯總淀粉含量、直鏈淀粉含量及直/直鏈淀粉比。

表4 壟溝集雨覆蓋栽培模式對旱作馬鈴薯塊莖形成各時(shí)期淀粉累積的影響Table 4 Effects of mulching on ridge-furrow for harvesting rainwater on starch accumulation at each period of tuber formation in rainfed potato

2.4 相關(guān)性分析

由表5 可知，SSS 活性與GBSSI基因表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)，與直鏈淀粉含量及直/支鏈淀粉比呈顯著正相關(guān)；AGPase基因表達(dá)量與SSII、GBSSI、SBEI及SBEII基因表達(dá)量呈顯著正相關(guān)；SSII基因表達(dá)量與GBSSI、SBEI及SBEII基因表達(dá)量呈顯著正相關(guān)；GBSSI基因表達(dá)量與SBEI基因表達(dá)量呈顯著正相關(guān)；SBEI基因表達(dá)量與SBEII基因表達(dá)量呈顯著正相關(guān)；直鏈淀粉含量與直/支鏈淀粉比呈顯著正相關(guān)。

3 討論

通過多年發(fā)展，壟溝集雨覆蓋栽培已廣泛應(yīng)用于小麥[28]、玉米[29]、馬鈴薯[30]、谷子[31]、糜子[32]、燕麥[33]、苜蓿[34]等作物上，因其結(jié)合地膜、秸稈、砂石等材料具有活化土壤養(yǎng)分[35]、提高土壤溫度[36]、改良作物光合能力[37]等作用，已成為青海東部旱區(qū)關(guān)注的焦點(diǎn)。本研究表明，在塊莖形成過程中，與地膜壟作相比，全膜雙壟覆蓋栽培模式可顯著改良旱作馬鈴薯淀粉的質(zhì)量。

馬鈴薯可溶性淀粉合成酶主要為SSII 和SSIII 兩種同工型。本研究顯示，在塊莖形成過程中，與露地平播相比，壟溝集雨覆蓋栽培同時(shí)提高了旱作馬鈴薯SSS 活性及SSIII基因表達(dá)量，表明SSIII 是可溶性淀粉合成酶的主要活性成分， 這與Lloyd 等[38]和Edwards 等[39]的研究結(jié)果類似。

在作物淀粉生物合成研究中，淀粉合成關(guān)鍵酶活性與基因表達(dá)量的關(guān)系一直備受關(guān)注。本研究表明，除SSS 活性與GBSSI基因表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)外，AGPP、GBSS、SBE 活性與各關(guān)鍵酶基因表達(dá)量均無顯著相關(guān)性，這可能是馬鈴薯淀粉合成關(guān)鍵酶活性除受到轉(zhuǎn)錄調(diào)控外，還受到轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[40]，與陳江等[41]在玉米上、譚彩霞等[42]在小麥上取得的結(jié)論相似。

本研究顯示，旱作馬鈴薯SSS 活性與直鏈淀粉含量、直/支鏈淀粉比呈顯著正相關(guān)，AGPase基因表達(dá)量與SSII、GBSSI、SBEI及SBEII基因表達(dá)量呈顯著正相關(guān)，說明AGPP 和SSS 是馬鈴薯塊莖淀粉生物合成的重要限制及功能酶。甘曉燕等[43]及Sweetlove 等[44]也證實(shí)了這一點(diǎn)。除SSS 活性外，其他淀粉合成關(guān)鍵酶活性及其相關(guān)基因表達(dá)量均與淀粉累積無顯著相關(guān)，說明馬鈴薯淀粉合成關(guān)鍵酶活性的改變并不會直接造成淀粉累積的變化，應(yīng)有其他因素控制，其具體機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。

表5 旱作馬鈴薯塊莖淀粉合成關(guān)鍵酶活性、基因表達(dá)與淀粉累積的相關(guān)性Table 5 Correlation analysis between amylase activity, key enzyme gene expression and starch accumulation in rainfed potato

4 結(jié)論

本研究初步表明，在塊莖形成過程中，與地膜壟作相比，全膜雙壟覆蓋栽培模式可顯著提高旱作馬鈴薯總淀粉及直鏈淀粉含量，有利于改良淀粉加工品質(zhì)，但需要多年多點(diǎn)試驗(yàn)的進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究結(jié)果對篩選青海東部旱區(qū)馬鈴薯適宜的淀粉優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)措施具有十分重要的意義。今后，應(yīng)結(jié)合土壤理化及植株生理，如水分、溫度、容重、葉片光合及衰老等，研究全膜雙壟覆蓋栽培下其與旱作馬鈴薯淀粉生物合成的關(guān)聯(lián)。