劉耀東， 賈榮玲， 王國強

（南陽農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，河南南陽473007）

益生菌能夠改善腸道環(huán)境， 維持其生態(tài)平衡（周莉等，2019）， 還有利于維持腸道菌群平衡（Bailey 等，2017），增強胃腸道黏膜屏障（雷艷琴，2008）， 可作為飼料添加劑來補充腸道微生物，具有免疫調(diào)節(jié)（Jin 等，2011；何國慶等，2004）、促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)吸收 （韓璐瑤，2019；Leslie，2015； 李琴等，2004）等功能。 胃腸道環(huán)境惡劣，尤其是胃酸，會降低益生菌活菌數(shù)量， 大大限制了其益生功能的發(fā)揮（Castrocialaghi 等，2012）。 微膠囊技術(shù)是近年來的一項保護(hù)生物活性物質(zhì)的有效技術(shù)。 其給益生菌創(chuàng)造了一個合適的微環(huán)境， 使菌體與周邊相對惡劣的自然環(huán)境隔離開， 從而達(dá)到益生菌長期保存的目標(biāo)。應(yīng)用微膠囊技術(shù)，經(jīng)過一定的手段將益生菌包埋在微小且封閉的膠囊中 （程玉霞，2013），不僅能在加工或儲藏過程中提高益生菌的有效活菌數(shù)， 還能在通過胃腸道期間對益生菌進(jìn)行保護(hù)， 使其以較少的活性損失到達(dá)腸道靶位點（Yao 等，2017）?？捎行Ъ訌娋w對消化道逆環(huán)境的抵抗力，并將益生菌在適當(dāng)?shù)奈恢冕尫?，發(fā)揮其益生作用（Cook 等，2012；Carvajal 等，2007）。

本研究采取海藻酸鈉和明膠雙層復(fù)合包埋鼠李糖乳桿菌益生菌微膠囊。 該雙層微膠囊能夠保護(hù)益生菌活性（Zou 等，2011），并利用凝膠防止在胃中水解。在菌種培養(yǎng)過程中，加入半乳糖促進(jìn)其生長，提高了包埋效率。并將微膠囊化鼠李糖乳桿菌用于仔豬飼料中， 測定其對仔豬生產(chǎn)性能和免疫功能的影響。 旨在為提供優(yōu)質(zhì)豬用生物制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與耗材 鼠李糖乳桿菌 （ATCC 7469）（北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司）、MRS 肉湯、MRS 培養(yǎng)基、莫匹羅星鋰鹽改良MRS 瓊脂、海藻酸鈉、明膠、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈣、鹽酸、氯化鈉、檸檬酸、氫氧化鈉等（北京索萊寶科技有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備 恒溫水浴鍋（上海一科儀器有限公司）、厭氧培養(yǎng)箱（常州金壇精達(dá)儀器制造有限公司）、電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、磁力攪拌器（上海越眾儀器設(shè)備有限公司）、電子分析天平、立式壓力蒸汽滅菌鍋（江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司）、高速離心機(jī)（德國Hettich公司）、旋渦振蕩器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）、生物安全柜（蘇州安泰二級生物安全柜）。

1.3 菌種的活化及菌懸液制備

1.3.1 菌種活化 將益生菌 （鼠李糖乳桿菌），接種于葡萄糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基（MRS 肉湯）中，37 ℃培育18 ～48 h，并進(jìn)行活化傳代。 離心，生理鹽水洗滌，重懸。

1.3.2 增殖培養(yǎng)基的選擇 選取半乳糖、 蔗糖增殖培養(yǎng)基和葡萄糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基， 各濃度均為：0.125%、0.25%、0.5%、1%、2%和 4%， 接入益生菌（鼠李糖乳桿菌）菌懸液中，厭氧培育，在600 nm下測定吸光度。

1.3.3 半乳糖對益生菌生長過程的影響 選擇增殖效果較好的碳源濃度， 配制基礎(chǔ)培養(yǎng)基和增殖培養(yǎng)基。 取活化后的益生菌（鼠李糖乳桿菌）菌懸液接種，無氧培育。 每隔4 h 在600 nm 下測定吸光度。

1.4 益生菌微膠囊的制備 按照唐仁龍（2018）的方法制作微膠囊，取海藻酸鈉粉末溶于滅菌水中，70 ℃下水浴加熱過夜至粉末充分溶解，制得海藻酸鈉溶液， 并經(jīng)過0.22 μm 濾膜過濾除菌，冷卻備用。稱取一定質(zhì)量的明膠，制得明膠溶液。使用磁力攪拌器，攪拌懸浮1 h 后備用。 將菌液、明膠和海藻酸鈉以1：1：1 比例混合，注射器滴入CaCl2固化劑中，形成微囊，磁力攪拌器攪拌，使微囊充分凝固，用蒸餾水沖洗3 次，除去多余的鈣離子和未被包埋的益生菌，即得濕膠囊（周莉等，2020）。

1.5 計算微膠囊包埋效果 稱取微膠囊1000 mg，加入 9 mL 解囊液中[PBS 緩沖液（pH 7.4）]（王婷婷，2016），振搖10 min 至完全解囊。稀釋后涂板，厭氧培養(yǎng)計數(shù)。 微膠囊的包埋率計算公式如下：

1.6 微膠囊包埋工藝單因素試驗 在其他條件不變的情況下，以包埋率為指標(biāo)，測定海藻酸鈉添加量（1%、2%、3%、5%和 8%），明膠濃度（0.1%、0.15%、0.2%、0.25%和 0.3%）， 菌膠比例（1：2、1：4、1：8、1：10、1：20）、氯化鈣濃度（1%、2%、3%、5%和 8%） 和攪拌速度 （200、400、600、800 r/min 和1000 r/min）對鼠李糖乳桿菌微膠囊包埋效果的影響，確定其最佳條件。

1.7 微膠囊包埋工藝優(yōu)化 以單因素試驗為基礎(chǔ)進(jìn)行正交試驗， 并測定該條件下的益生菌微膠囊包埋率。

1.8 飼喂益生菌微膠囊對仔豬的影響 選取體重相近的22 日齡斷奶三元雜交健康仔豬36 頭（母本為長大，父本為杜洛克）隨機(jī)分為4 組，每組9 頭。 對照組飼喂基礎(chǔ)日糧（表1），其他組分別飼喂添加0.1%、0.2%、0.3%益生菌微膠囊的日糧。預(yù)飼期10 d，正飼期30 d。 試驗在封閉式豬舍內(nèi)進(jìn)行，自由采食，水泥地面圈養(yǎng)，以鴨嘴式飲水器提供充足清潔飲水。舍溫23～27 ℃，隨時觀察并記錄豬的狀態(tài)。試驗期間，按仔豬的常規(guī)免疫程序進(jìn)行免疫、驅(qū)蟲，并采用多種方式進(jìn)行消毒。

表1 仔豬基礎(chǔ)日糧組成及主要營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

2 結(jié)果與分析

2.1 鼠李糖乳桿菌菌種培養(yǎng)結(jié)果

2.1.1 增殖培養(yǎng)基對鼠李糖乳桿菌增殖作用的影響 由圖1 可知，在葡萄糖、半乳糖、蔗糖培養(yǎng)基濃度相同時， 半乳糖培養(yǎng)基中的鼠李糖乳桿菌OD600nm值最高，達(dá)到1.98，由此可看出，半乳糖對鼠李糖乳桿菌的增殖培養(yǎng)效果較好。

2.1.2 半乳糖對鼠李糖乳桿菌生長過程的影響由圖2 可知， 半乳糖培養(yǎng)基培養(yǎng)8 h 后進(jìn)入快速生長期，在葡萄糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h 進(jìn)入快速生長期，半乳糖培養(yǎng)基縮短了菌體延滯期，在12 h后半乳糖OD600nm值顯著高于葡萄糖，說明半乳糖可提高鼠李糖乳桿菌的生長速率。

圖1 培養(yǎng)基濃度對鼠李糖乳桿菌菌體數(shù)量的影響

圖2 半乳糖對鼠李糖乳桿菌生長過程的影響

2.2 各因素對鼠李糖乳桿菌益生菌微膠囊的影響

2.2.1 海藻酸鈉添加量對益生菌微膠囊的影響由圖3 可知，在一定范圍內(nèi)，包埋率隨海藻酸鈉濃度的加大而增大，添加3%海藻酸鈉時，包埋率為76.5%。 繼續(xù)增大濃度，包埋率降低。 因此，將3%作為海藻酸鈉最佳濃度。

圖3 海藻酸鈉對微膠囊包埋效果的影響

2.2.2 明膠濃度對益生菌微膠囊的影響 由圖4可知，明膠濃度為0.2%時，微膠囊所包埋的菌落數(shù)最多，包埋的效果最好；明膠濃度大于0.2%時，包埋率反而降低。

圖4 明膠濃度對微膠囊包埋率的影響

2.2.3 菌膠比例對益生菌微膠囊的影響 由圖5可知，隨著菌膠比例增大，包埋率無顯著變化，在菌膠比例為1：10 時包埋率稍高；且形成的微膠囊膜逐漸變厚，成型效果變好。 所以，菌膠比例選擇1：10。

圖5 菌膠比例對微膠囊包埋率的影響

2.2.4 氯化鈣添加量對益生菌微膠囊的影響 由圖6 可知， 氯化鈣添加量為2%時， 包埋率為76%，達(dá)到最高。氯化鈣添加量大于2%時，包埋率降低，故最終選擇氯化鈣添加量為2%。

圖6 氯化鈣添加量對微膠囊包埋率的影響

2.2.5 攪拌速度對益生菌微膠囊的影響 由圖7可知，隨著攪拌速度的上升，包埋率呈上升趨勢，到800 r/min 后包埋率下降。故最佳攪拌速度選用800 r/min。

圖7 攪拌速度對微膠囊包埋率的影響

2.3 微膠囊包埋工藝優(yōu)化 單因素試驗為基礎(chǔ)，選擇海藻酸鈉、明膠濃度、氯化鈣濃度和攪拌速度設(shè)計正交試驗。 正交試驗設(shè)計和結(jié)果分別如表2、表3 所示。

表2 正交試驗設(shè)計

表3 正交試驗結(jié)果

單因素分析規(guī)律是試驗因素對指標(biāo)的影響呈正相關(guān)，極差順序比較依次為：海藻酸鈉濃度（A）＞明膠濃度（B）＞氯化鈣濃度（C）＞攪拌速度（D）。所以對鼠李糖乳桿菌益生菌微膠囊包埋效果影響顯著的是海藻酸鈉，其次是明膠，然后是氯化鈣，最后是攪拌速度。通過比較每個因素k 值大小，發(fā)現(xiàn)因素 A 為 A2，B 為 B2，C 為 C1，D 為 D2時，所對應(yīng)的k 值均為每組中最大的， 因此最終制備條件為海藻酸鈉3%，明膠0.2%，氯化鈣2%，攪拌速度800 r/min。

2.4 試驗驗證 將試驗進(jìn)行三次重復(fù)，結(jié)果分別為75.6%、76.0%、76.4%，平均值為76.0%，與預(yù)測值較為相似， 說明試驗?zāi)茌^好地反映微膠囊制備過程中4 個因素對于包埋率的影響， 從而證明此試驗優(yōu)化后的工藝條件是可靠的 （Kantas 等，2015）。

2.5 微膠囊對仔豬生長性能的影響

2.5.1 微膠囊的安全性評價 將制備的鼠李糖乳桿菌微膠囊喂食仔豬進(jìn)行試驗，喂養(yǎng)6 周，在此期間，仔豬的體重增長、精神狀態(tài)、體毛、飲食、排便狀況均無異常，各組期間生活狀態(tài)較好。表明制備的微膠囊不存在安全隱患，使用安全。

2.5.2 對仔豬生產(chǎn)性能的影響 由表4 可見，隨著益生菌添加劑量的提高，仔豬的末重、日增重及日采食量也不斷提高， 當(dāng)益生菌微膠囊飼喂添加量為0.3%時，仔豬的末重、日增重及日采食量均顯著高于對照組， 料重比較對照組降低了3.7%；腹瀉率較對照組降低了56.7%；試驗結(jié)果表明，益生菌微膠囊添加劑量為0.3%時不僅能顯著提高仔豬的生長速度，并且能夠降低仔豬的腹瀉率。

表4 益生菌微膠囊飼喂劑量對斷奶仔豬生產(chǎn)性能的影響

2.5.3 對仔豬免疫功能的影響 由表5 可知，隨著益生菌微膠囊飼喂劑量的增加，IgA、IgG 和IgM含量不斷提升，其中，0.3%組的 IgA、IgG 和 IgM 均顯著高于（P ＜0.05）對照組，表明將益生菌微膠囊添加到日糧中能夠提高仔豬的免疫能力，以0.3%添加劑量最佳。

表5 益生菌微膠囊飼喂劑量對仔豬免疫功能的影響 g/L

3 討論及結(jié)論

本試驗制備的鼠李糖乳桿菌微膠囊， 包埋率較為理想，隨著海藻酸鈉濃度的升高，形成良好的機(jī)械強度， 能有效包埋鼠李糖乳桿菌。 當(dāng)海藻酸鈉添加量為3%時，包埋的效果最好。 當(dāng)海藻酸鈉的濃度繼續(xù)變大時，包埋效果不是太理想。

鼠李糖乳桿菌微膠囊的包埋率隨明膠濃度的增大而升高，當(dāng)明膠濃度為0.2%時，包埋率最為理想。 而明膠的濃度繼續(xù)增高，形成強度大，在實際應(yīng)用中包埋在微膠囊里面的菌種不能被釋放出來，因此同樣也會導(dǎo)致包埋率降低，包埋效果不理想。

通過微膠囊技術(shù)， 利用海藻酸鈉和明膠進(jìn)行復(fù)合包埋， 能夠高效地包埋鼠李糖乳桿菌。 在本試驗條件下包埋率達(dá)到（76.0±2.0）%。最后將制備的鼠李糖乳桿菌微膠囊應(yīng)用于仔豬飼糧中， 研究其飼養(yǎng)效果。 相比未包被益生菌， 仔豬飼糧中添加包被益生菌（微囊化益生菌日糧）具有提高仔豬生長性能的趨勢， 在一定程度上能提高仔豬的免疫性能。 通過給仔豬飼喂添加有益生菌制劑的日糧，導(dǎo)致仔豬的采食量增加，進(jìn)而對其起到了促生長的作用。 這與Kantas 等（2015）研究結(jié)果一致。該復(fù)合益生菌制劑飼喂仔豬不但能提高其生長性能，還能提高其抗腹瀉能力和其免疫能力，且飼喂添加量均以0.3%為最佳。

本試驗研究的微膠囊， 不僅可以提高益生菌在動物飼料應(yīng)用過程中的菌體存活率， 用以制備具有補充腸道益生菌的復(fù)合微膠囊，而且為益生菌微膠囊的工藝優(yōu)化提供理論和實踐依據(jù)， 具有極強的現(xiàn)實意義。