郭然，代熙，黃厚鈺，韋智江，翟玉生，陳耀，李衛(wèi)東*（. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 0488；. 通渭縣清涼沅金銀花產(chǎn)業(yè)扶貧開發(fā)有限公司，甘肅 定西 743300）

隨著新型冠狀病毒肺炎疫情在全球蔓延并加重，抗疫成為全人類面臨的重要問題。越來越多的臨床證明，以“三藥三方”為代表的中藥在這場(chǎng)抗疫中發(fā)揮了重要作用，尤其是連花清瘟膠囊、金花清感顆粒[1-2]，金銀花是這兩種藥物的主要成分藥材。金銀花質(zhì)量嚴(yán)重影響藥物的臨床療效，其質(zhì)量控制對(duì)人類大健康需求以及金銀花產(chǎn)業(yè)發(fā)展至關(guān)重要[3]。研究表明，金銀花花蕾的發(fā)育程度不同其顏色不同，對(duì)應(yīng)藥材的藥效成分含量會(huì)有差異，兩者呈一定相關(guān)性[4]，這為金銀花的色選分級(jí)提供了理論依據(jù)。色選分級(jí)技術(shù)已在茶葉、蔬菜等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，物料進(jìn)入色選機(jī)的第一層分選室后，從傳感器和背景板間穿過，在光源的作用下，傳感器接收顏色信號(hào)，經(jīng)處理后產(chǎn)生輸出信號(hào)，驅(qū)動(dòng)噴閥工作，將枝葉等異物吹至背部接料斗內(nèi)流走，其余物料繼續(xù)下落，經(jīng)過第二層分選室再次分選后至出料口流走，達(dá)到對(duì)物料精選和分級(jí)的目的[5]。能否通過顏色差異應(yīng)用色選分級(jí)技術(shù)進(jìn)行金銀花質(zhì)量等級(jí)劃分，是本研究關(guān)注的主要問題。自2013年以來，北京中醫(yī)藥大學(xué)金銀花研究團(tuán)隊(duì)在通渭縣的11 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)，完成了從金銀花北花一號(hào)新品種[6-7]的試種、中試，到2000畝示范和大面積推廣過程。至2020年，已累計(jì)推廣種植金銀花10 萬畝，金銀花產(chǎn)業(yè)成為了當(dāng)?shù)氐慕?jīng)濟(jì)支柱產(chǎn)業(yè)。

本研究以經(jīng)色選機(jī)分級(jí)后的通渭金銀花為材料，運(yùn)用現(xiàn)代質(zhì)量評(píng)價(jià)手段和多元統(tǒng)計(jì)分析方法，驗(yàn)證通渭金銀花色選分級(jí)技術(shù)的科學(xué)性，為色選分級(jí)技術(shù)在金銀花產(chǎn)業(yè)中的推廣和應(yīng)用提供理論依據(jù)。同時(shí)，制訂通渭金銀花質(zhì)量等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，為其產(chǎn)業(yè)發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品收集

樣品分別采自甘肅省定西市通渭縣11 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)李衛(wèi)東研究員鑒定為忍冬科植物忍冬（Lonicera japonicaThunb.）的干燥花蕾或帶初開的花。色選機(jī)分級(jí)為特級(jí)、一級(jí)、二級(jí)和三級(jí)，產(chǎn)地加工方式為烘干。樣品共計(jì)44份，詳細(xì)信息見表1。

表1 金銀花樣品信息Tab 1 Information of Lonicerae Japonicae Flos

1.2 試藥與儀器

綠原酸（批號(hào)：MUST-17030620）、異綠原酸C（批號(hào)：MUST-15081414）、木犀草苷（批號(hào)：MUST-17030405）（成都曼斯特生物科技有限公司，純度均≥98%），異綠原酸A（批號(hào)：Z05M10X87215）（上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%），乙腈[色譜純，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司]，甲醇、乙醇（分析純），水為娃哈哈礦泉水。

6CSX-300IIIA（TD3）型人工智能色選機(jī)（合肥美亞光電技術(shù)股份有限公司），CBM-20A型島津高效液相色譜儀（日本島津公司），KQ-400KDE 型高功率數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），1/10 萬電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]，粉碎機(jī)、馬弗爐、電熱套、HH-S4A 型電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）。

1.3 金銀花外觀性狀檢測(cè)

以色澤、黃條、開放花、黑頭、黑條、枝葉含量等指標(biāo)對(duì)金銀花的外觀性狀進(jìn)行量化表征[8]。從每份樣品中隨機(jī)稱取10 g 金銀花，分離出黃條、開放花、黑頭、黑條、枝葉等部分，稱定質(zhì)量（精確至0.01 g）。由于開放花、黑條數(shù)量極少，故分別與黃條、黑頭指標(biāo)合并表征。分別計(jì)算以上各部分質(zhì)量分?jǐn)?shù)，可得到黃條（含開放花）率、黑頭（含黑條）率和枝葉率。色澤用連續(xù)排列正整數(shù) 1，2，3……進(jìn)行編碼，對(duì)純青花不含黃條者賦值“1”；花淺綠含極少黃條者賦值“2”；花淺綠含較多黃條者賦值“3”；花黃或色難辨者賦值“4”[9]。

1.4 金銀花主要活性成分含量測(cè)定

按2020年版《中國(guó)藥典》金銀花【含量測(cè)定】項(xiàng)下方法檢測(cè)樣品中酚酸類和木犀草苷成分含量，其中酚酸類成分包括綠原酸、3，5-二-O-咖啡酰奎寧酸（異綠原酸A）和4，5-二-O-咖啡?？鼘幩幔ó惥G原酸C）[10]。

1.5 金銀花常規(guī)理化指標(biāo)測(cè)定

按 2020年版《中國(guó)藥典》金銀花【檢查】項(xiàng)下規(guī)定方法檢測(cè)樣品中的水分、總灰分和酸不溶性灰分[10]。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

采用IBM SPSS Statistics 26 統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)金銀花樣品外觀性狀、主要活性成分含量和常規(guī)理化指標(biāo)進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)分析和相關(guān)性分析，篩選出與等級(jí)和活性成分顯著相關(guān)的指標(biāo)，進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析以驗(yàn)證色選機(jī)分級(jí)的合理性；最后對(duì)所有指標(biāo)進(jìn)行K-均值聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 金銀花外觀性狀、主要成分及理化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

圖1 為產(chǎn)自通渭縣李店鄉(xiāng)的金銀花色選等級(jí)圖，對(duì)應(yīng)表1 的樣品編號(hào)為“5 ～8”。44 份金銀花外觀性狀、酚酸類、木犀草苷含量及水分、總灰分和酸不溶性灰分含量測(cè)定結(jié)果，見表2。

表2 金銀花外觀性狀、主要成分及常規(guī)理化指標(biāo)測(cè)定(%)Tab 2 Determination of appearances，main components and physical and chemical indexes of Lonicera japonica Flos (%)

圖1 通渭李店鄉(xiāng)金銀花色選等級(jí)圖Fig 1 Color grading picture of Lonicera japonica Flos

2.2 金銀花各項(xiàng)指標(biāo)描述性統(tǒng)計(jì)

對(duì)44 份金銀花樣品的上述各指標(biāo)進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)分析，并計(jì)算變異系數(shù)，結(jié)果見表3。各項(xiàng)指標(biāo)的變異系數(shù)在4.58%～104.87%，除總灰分變異系數(shù)為4.58%外，其余各項(xiàng)指標(biāo)的變異系數(shù)均＞10%，表明除總灰分外，其余各項(xiàng)指標(biāo)在44 份金銀花樣品間存在較大差異。

表3 金銀花各項(xiàng)指標(biāo)描述性統(tǒng)計(jì)分析Tab 3 Descriptive statistics for various indexes of Lonicera japonica Flos

2.3 相關(guān)性分析

對(duì)44 份金銀花樣品的色選等級(jí)與除總灰分外的11 項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行皮爾遜相關(guān)性檢驗(yàn)，結(jié)果見表4。除酸不溶性灰分外，其余指標(biāo)與色選等級(jí)的相關(guān)性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中外觀性狀指標(biāo)、水分和木犀草苷與色選等級(jí)成極顯著正相關(guān)，酚酸類指標(biāo)含量與色選等級(jí)成極顯著負(fù)相關(guān)。因此將上述4 項(xiàng)外觀性狀指標(biāo)和5 項(xiàng)成分含量指標(biāo)及水分作為系統(tǒng)聚類分析的變量，以驗(yàn)證色選機(jī)分級(jí)結(jié)果的科學(xué)性。

表4 金銀花有效指標(biāo)與商品等級(jí)的相關(guān)性分析Tab 4 Correlation analysis of effective index and commodity grade of Lonicera japonica Flos

進(jìn)一步對(duì)4 項(xiàng)外觀性狀指標(biāo)和5 項(xiàng)成分含量指標(biāo)進(jìn)行皮爾遜相關(guān)性檢驗(yàn)，結(jié)果見表5。色澤、黃條（含開放花）率和黑頭（含黑條）率與酚酸類成分含量成極顯著負(fù)相關(guān)，與木犀草苷成極顯著正相關(guān)。即隨著色澤變黃，黃條（含開放花）率和黑頭（含黑條）率升高，酚酸類成分含量降低，木犀草苷含量則會(huì)升高。枝葉率與4 種成分含量均沒有顯著性相關(guān)關(guān)系。分析造成木犀草苷與外觀性狀成負(fù)相關(guān)的原因，可能與金銀花中黃酮類成分隨著金銀花的發(fā)育呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)有關(guān)[11]。而枝葉率與成分含量沒有顯著相關(guān)關(guān)系，主要是因?yàn)樗悠分兄θ~含量極低，表明色選機(jī)能較好地將枝葉從金銀花藥材中分離出來。上述結(jié)果表明，金銀花的外觀性狀在一定程度上可以反映其內(nèi)在質(zhì)量，故色選機(jī)通過判定金銀花外觀性狀從而對(duì)其進(jìn)行分級(jí)，具有科學(xué)性。

表5 金銀花有效成分含量與外觀性狀指標(biāo)的相關(guān)性分析Tab 5 Correlation between the content of effective components and appearance of Lonicera japonica Flos

2.4 系統(tǒng)聚類分析

以上述4 項(xiàng)外觀性狀和5 項(xiàng)成分含量及水分指標(biāo)為變量，以44 份樣品標(biāo)準(zhǔn)化處理后的數(shù)據(jù)為個(gè)案，采用質(zhì)心聚類法，余弦度量標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，得樣品聚類譜系圖，見圖2。將44 份樣品歸為4 類，Ⅰ類樣品11 份（編號(hào)：32、40、16、8、28、4、20、12、44、24、36）， 參考表1 對(duì)照編號(hào)可知11 份樣品均為三級(jí)；Ⅱ類樣品8 份（編號(hào)：7、23、19、31、11、43、35、39），均為二級(jí)；Ⅲ類樣品11 份（編號(hào)：1、5、25、29、21、33、9、17、37、13、41），均為特級(jí)；Ⅳ類樣品14 份（編號(hào)：22、26、2、6、30、34、10、42、14、27、18、38、3、15），其中一級(jí)11份，二級(jí)3 份，一級(jí)占比78.57%。一級(jí)和二級(jí)存在部分交叉現(xiàn)象，但相同等級(jí)歸為同一類別的樣品數(shù)占總樣品數(shù)的93.18%。由此可見，用色選機(jī)對(duì)金銀花進(jìn)行等級(jí)劃分具有高度可行性。

圖2 44 份金銀花樣品的系統(tǒng)聚類分析樹狀圖Fig 2 Tree view by hierarchical cluster analysis with 44 samples of Lonicera japonica Flos

2.5 通渭金銀花質(zhì)量等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)劃分

本研究對(duì)通渭金銀花的色澤、黃條（含開放花）率、黑頭（含黑條）率、枝葉率、綠原酸、木犀草苷、總酚酸、水分、總灰分和酸不溶性灰分10 項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)劃分。并以除色澤外的其余9 項(xiàng)指標(biāo)為變量，44 份樣品標(biāo)準(zhǔn)化處理后的數(shù)據(jù)為觀測(cè)值，進(jìn)行K-均值聚類分析。目前市場(chǎng)上通常將金銀花劃分為3 個(gè)等級(jí)或4 個(gè)等級(jí)[12]，由上述分析發(fā)現(xiàn)，若將金銀花分為4 個(gè)等級(jí)，部分相鄰兩個(gè)等級(jí)的指標(biāo)觀測(cè)值較為接近，不易區(qū)分，并且用色選機(jī)進(jìn)行色選時(shí)分4 級(jí)比分3 級(jí)費(fèi)時(shí)費(fèi)工。故為節(jié)約成本和更好地實(shí)現(xiàn)“優(yōu)質(zhì)優(yōu)價(jià)”，本標(biāo)準(zhǔn)將金銀花質(zhì)量等級(jí)劃分為3 個(gè)級(jí)，即將K-均值聚類結(jié)果規(guī)定為3 類。方差分析和聚類結(jié)果見表6 及表7。由方差分析可知枝葉率和酸不溶性灰分等級(jí)間差異未達(dá)到顯著性水平，故僅作為參考指標(biāo)列出。根據(jù)K-均值聚類分析所得最終聚類中心，對(duì)通渭金銀花制訂質(zhì)量等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果見表8。

表6 金銀花等級(jí)相關(guān)主要指標(biāo)K-均值聚類方差分析Tab 6 Variance on K-means clustering of main indexes related to Lonicera japonica Flos grade

表7 金銀花等級(jí)相關(guān)主要指標(biāo)最終聚類中心Tab 7 Final cluster center of main indexes related to Lonicera japonica Flos grade

表8 通渭金銀花質(zhì)量等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)劃分建議表Tab 8 Suggestion for classification of grade quality standard of Lonicera japonica Flos in Tongwei

3 討論

金銀花作為傳統(tǒng)大宗中藥材，在市場(chǎng)上一直遵循“按質(zhì)論價(jià)、優(yōu)質(zhì)優(yōu)價(jià)”的原則。因此，采用科學(xué)合理的分級(jí)方法對(duì)金銀花產(chǎn)業(yè)的發(fā)展尤為重要。目前常用的金銀花分級(jí)方法為傳統(tǒng)人工分級(jí)法。傳統(tǒng)的辨狀論質(zhì)，從感官上對(duì)金銀花進(jìn)行等級(jí)劃分的方式，不僅要求分辨者具有極強(qiáng)的專業(yè)能力，而且效率較低，這嚴(yán)重阻礙了金銀花產(chǎn)業(yè)的發(fā)展進(jìn)程。色選機(jī)的出現(xiàn)，較好地解決了這一問題。研究發(fā)現(xiàn)，色選機(jī)在茶葉、種子、水果和蔬菜的分級(jí)或清選中廣泛應(yīng)用，且清選和分級(jí)作用非常明顯，且色選機(jī)根據(jù)茶葉和茶梗之間的色差即可對(duì)茶進(jìn)行較好的分級(jí)[5，13]。綜上，色選機(jī)是一種根據(jù)顏色來對(duì)物料進(jìn)行分選的設(shè)備。

金銀花外觀顏色性狀與其質(zhì)量之間存在相關(guān)性。熊吟等[14]通過研究金銀花有效成分含量與顏色值L*之間的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，L*在 43.1% 的程度上受綠原酸、木犀草苷、總黃酮 3 個(gè)有效成分影響。王玲娜等[11]通過探索不同發(fā)育時(shí)期金銀花顏色和每個(gè)花蕾活性成分量的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，金銀花的顏色與活性成分量密切相關(guān)，且酚酸類、黃酮類化合物量在二白期（花蕾綠色）、大白期（花蕾綠白色）最高。楊曉蕓[4]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，綠原酸、木犀草苷、多酚類、葉綠素含量高低關(guān)系為：綠色＞黃綠色＞綠白色＞黃白色＞黃色。這均揭示了傳統(tǒng)認(rèn)為金銀花為綠色的質(zhì)量較好、黃色的質(zhì)量較差的科學(xué)內(nèi)涵。本研究認(rèn)為，以金銀花外觀顏色性狀為依據(jù)進(jìn)行色選分級(jí)具有科學(xué)性。

質(zhì)量等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的制訂是金銀花色選分級(jí)的基礎(chǔ)。周潔等[15]以39 份全國(guó)不同產(chǎn)區(qū)的金銀花為樣品進(jìn)行質(zhì)量等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)研究，并將金銀花劃分為4 個(gè)等級(jí)，規(guī)定綠原酸含量一等≥2.04%、二等≥2.06%、三等≥2.49%、四等≥1.50%；木犀草苷含量一等≥0.07%、二等≥0.05%、三等≥0.05%、四等≥0.07%。張歡等[16]以采自封丘、平邑、巨鹿三大主產(chǎn)區(qū)的34 份金銀花為研究對(duì)象，進(jìn)行等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)劃分，規(guī)定綠原酸含量一等≥2.89%、二等≥2.53%、三等≥1.98%、四等≥1.51%；木犀草苷含量一等≥0.078%、二等≥0.072%、三等≥0.068%、四等≥0.052%。馮峰等[12]以2020年版《中國(guó)藥典》為依據(jù)，并結(jié)合采自21 個(gè)不同產(chǎn)區(qū)的金銀花樣品檢測(cè)結(jié)果，建議將金銀花質(zhì)量等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)劃分為3 個(gè)等級(jí)，其中綠原酸含量一等≥2.30%、二等≥1.80%、三等≥1.50%；3 種酚酸總含量一等≥4.20%、二等≥4.00%、三等≥3.80%。本研究發(fā)現(xiàn)，通渭縣栽植的金銀花主要藥用成分綠原酸和木犀草苷含量高出藥典規(guī)定的2 ～3 倍。究其原因，可能與當(dāng)?shù)赝寥朗杷蛇m宜，日照充足，晝夜溫差大，土壤、空氣、水資源污染程度低等優(yōu)勢(shì)地理?xiàng)l件有關(guān)[17]。

4 結(jié)論

通過對(duì)采自通渭11 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的44 份金銀花樣品進(jìn)行測(cè)定與分析，結(jié)果證明用色選機(jī)對(duì)金銀花進(jìn)行等級(jí)劃分具有可行性。同時(shí)，制訂通渭金銀花質(zhì)量等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，所制訂的通渭金銀花等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)要求較高。這將推動(dòng)通渭金銀花走向行業(yè)前端，并促進(jìn)其國(guó)際化貿(mào)易發(fā)展進(jìn)程。