唐曉怡 譚紅保 趙 倩 李玉芳 吳 荻

(湖南省長沙市第四醫(yī)院麻醉科，長沙市 410000，電子郵箱：tdw489@163.com)

腦梗死主要由腦組織局部供血不足引起，腦組織缺血缺氧性壞死、神經功能障礙是其典型的表現(xiàn)[1-2]。中老年人群為腦梗死高發(fā)群體，男性發(fā)病率相對較高，隨著我國人口老齡化現(xiàn)象加重，每年新增腦梗死病例數(shù)不斷上升，引起廣大專家學者的關注[3-4]。鹽酸戊乙奎醚是一種廣譜的抗膽堿藥物，能夠拮抗M1受體，減輕神經元損傷[5-6]，將其應用于腦血管疾病，鮮有研究報告。本研究通過建立腦梗死大鼠模型，使用鹽酸戊乙奎醚進行干預，觀察其治療效果，旨在探究鹽酸戊乙奎醚對腦梗死模型大鼠的神經保護作用及相關機制,現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 30只健康雄性SD大鼠，由吉林大學動物實驗中心提供[使用許可證號：SYXK(吉)2020-0004)]，鼠齡7～9(8.1±0.7)個月，體重227～252(239.6±9.8)g。在相對濕度50%～55%、溫度21℃～25℃的環(huán)境中適應性喂養(yǎng)1周，光照12 h/d。主要試劑：鹽酸戊乙奎醚(成都力思特制藥股份有限公司，批準文號：H20051948)；過氧化氫酶(catalase，CAT)、活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)、8-羥基脫氧鳥苷(8-hydroxy-2′-deoxyguanosine，8-OHdG)、白細胞介素(interleukin，IL)-6、IL-1β酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司(批號：HZ-E14940；SZ-HAS-285；EK-M29386；EK-R36902、EK-R36877)；兔抗大鼠Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)、核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)抗體(HyClone公司，批號：A26388、A25267)；小鼠抗兔Beclin-1、微管相關蛋白1輕鏈3B(microtubule-associated protein 1 light chain 3β，MAP1LC3B)抗體(Dako公司，批號：D7751,D8652)；大鼠抗小鼠磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)抗體(Gibco公司，批號：A1973、A2768)；山羊抗兔IgG(艾美捷科技有限公司，批號：H20190201)； TTC溶液(青島海博生物技術有限公司，批號：20200501)；4%多聚甲醛(上海歌凡生物科技有限公司，批號：20200731)；Western封閉液、Western洗滌液(上海威奧生物科技有限公司，批號：20200331；20200402)；酶標分析儀(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，型號：ML-dr3518)。

1.2 建模及分組干預 將大鼠按照隨機數(shù)字法分為正常組、模型組和鹽酸戊乙奎醚組各10只。給予所有大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉40 mg/kg進行麻醉后固定于實驗臺，消毒頸部，將頸部正中部位皮膚剪開，顯微鏡下將頸總動脈、頸內動脈、頸外動脈分離暴露于術野，正常組隨后縫合傷口，作為假手術對照。于其他大鼠近心端結扎近端頸外動脈，微動脈夾夾住頸內動脈，結扎固定頸總動脈，阻斷大鼠腦組織中動脈，取下微動脈夾，根部固定頸內動脈，再次進行消毒處理后縫合傷口。建模過程中模型組大鼠死亡1只。建模成功24 h后正常組、模型組大鼠腹腔注射1 mL生理鹽水，鹽酸戊乙奎醚組大鼠腹腔注射鹽酸戊乙奎醚，劑量為2 mg/kg，溶于1 mL生理鹽水后腹腔注射。所有大鼠均連續(xù)干預7 d，1次/d。

1.3 指標檢測

1.3.1 學習記憶能力、神經行為學評估：(1)自各組大鼠干預6 h后，對學習記憶能力進行評估。準備高50 cm、直徑150 cm圓形水池，水池中央有一高30 cm、直徑10 cm平臺，水池口標記4個位點作為大鼠入水口(四點相連為正方形)，注入半池水，水溫27℃。分別于已4個位點將大鼠置入水中，記錄大鼠自入水點游至預置平臺時間，將120 s內未游至平臺的大鼠引至平臺，記為120 s。大鼠在平臺上停留30 s之后，測試其他入水口，計算4個入口大鼠游至平臺的時間平均值，即大鼠平均逃避潛伏期時間，每天1次，所有大鼠均連續(xù)測試5 d。逃避潛伏期時間越長，大鼠學習記憶能力越差。(2)對各組大鼠神經行為學指標進行評價[7]。其中0分為行為學正常無障礙；1分為左前肢伸展異常；2分為向一側旋轉；3分為向一側傾倒；4分為喪失自主活動能力，意識障礙。

1.3.2 腦組織含水量和梗死體積檢測、蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色：(1)含水量測定。干預7 d后，各組大鼠分別取5只，腹腔注射戊巴比妥鈉40 mg/kg進行麻醉后頸椎脫臼法處死，取大鼠腦組織，使用濾紙吸取大鼠腦組織表面水分，稱重得到腦組織的濕質量，將腦組織置于95℃烤箱中烤至恒重，稱取干質量，計算含水量，腦含水量=(濕質量-干質量)/濕質量×100%。(2)梗死體積測定。對各組剩余大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉40 mg/kg進行麻醉后頸椎脫臼法處死，取模型組、鹽酸戊乙奎醚組大鼠缺血區(qū)腦組織及正常組大鼠腦組織，-30℃冰箱冷凍保存0.5 h，取出腦組織制作厚約10 μm的連續(xù)切片。每間隔3片取1片，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。取各組腦組織切片,37℃環(huán)境中使用2% TTC溶液染色0.5 h，使用4%多聚甲醛固定6 h，拍照，使用經病理圖像分析系統(tǒng)測定梗死面積，并以此對腦組織梗死體積進行測算。(3)HE染色。取1.3.2(2)中各組大鼠腦組織切片，將切片烤干后進行脫蠟處理，之后順序置入不同濃度的酒精中脫水3 min。使用蘇木精染色15 min后清洗3次，使用鹽酸酒精分化處理30 s，充分清洗之后使用1%伊紅染色，使用酒精進行脫水處理后進行脫蠟處理，封片后使用顯微鏡對各組大鼠腦組織細胞病理狀況進行觀察。

1.3.3 腦組織氧化應激指標、炎癥指標水平檢測：取1.3.2(2)中各組大鼠腦組織切片，采用酶聯(lián)免疫吸附實驗法檢測氧化應激反應指標CAT、ROS、8-OHdG及炎癥因子IL-6、IL-1β水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.3.4 TLR4/NF-κB通路蛋白、自噬和凋亡相關蛋白表達量檢測：免疫印跡法檢測腦組織中TLR4、NF-κB，自噬相關蛋白Beclin-1、MAP1LC3B，以及凋亡相關蛋白PI3K、mTOR的相對表達量，以β-肌動蛋白(β-actin)為內參。提取50 μg蛋白，煮沸5 min使蛋白變性后用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后依據(jù)蛋白分子大小把凝膠切開并轉移至聚偏二氟乙烯膜上,用Western封閉液在室溫下將待測蛋白和內參蛋白封閉90 min,按1 ∶1 000稀釋待測蛋白抗體，內參抗體以1 ∶2 000比例稀釋,孵育過夜4℃，使用Western洗滌液洗滌5次，每10 min 1次。加入稀釋山羊抗兔IgG(1 ∶5 000),孵育60 min，室溫水平搖床,洗滌5次Western洗滌液,每10 min 1次。經過ECL顯色和曝光后，使用Bio-Rad成像系統(tǒng)進行成像，使用Image J圖像分析系統(tǒng)檢測條帶的灰度值,以目標蛋白條帶灰度值與內參條帶灰度值的比值作為目標蛋白的相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料以例數(shù)和百分比表示，比較采用χ2檢驗；正態(tài)分布的計量資料以(x±s)表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠腦組織病理學變化 正常組大鼠腦組織細胞排列整齊，結構完好，細胞核清晰，無病理變化。模型組大鼠腦組織細胞排列無規(guī)則，細胞核破裂，間質水腫，炎性細胞浸潤情況嚴重。鹽酸戊乙奎醚組大鼠腦組織細胞排列較規(guī)則，細胞腫脹、破裂以及炎性細胞浸潤的情況較輕。見圖1。

正常組 模型組 鹽酸戊乙奎醚組

2.2 各組大鼠的學習記憶能力和神經行為學評分 隨著訓練時間的延長，各組大鼠逃避潛伏期逐漸縮短(均P<0.05)。與正常組比較，模型組、鹽酸戊乙奎醚組大鼠各時間點逃避潛伏期較長，神經行為學評分較高(均P<0.05)；與模型組比較，鹽酸戊乙奎醚組大鼠逃避潛伏期較短，神經行為學評分較低(均P<0.05)。見表1。

表1 3組大鼠學習記憶能力和神經行為學評分的比較(x±s)

2.3 各組大鼠的腦組織梗死體積和含水量 鹽酸戊乙奎醚組大鼠腦組織梗死體積小于模型組(P<0.05)。與正常組比較，模型組、鹽酸戊乙奎醚組大鼠腦組織含水量較高(均P<0.05)；與模型組比較，鹽酸戊乙奎醚組大鼠腦組織含水量較低(P<0.05)。見表2。

表2 3組大鼠腦組織梗死體積和含水量的比較(x±s,%)

2.4 各組大鼠腦組織的氧化應激指標水平 與正常組比較，模型組、鹽酸戊乙奎醚組大鼠CAT水平較低，ROS、8-OHdG水平較高(均P<0.05)；與模型組比較，鹽酸戊乙奎醚組大鼠CAT水平較高，ROS、8-OHdG水平較低(均P<0.05)。見表3。

表3 3組大鼠腦組織氧化應激指標水平的比較(x±s)

2.5 各組大鼠腦組織中的TLR4/NF-κB通路蛋白表達量及炎癥因子水平 與正常組比較，模型組、鹽酸戊乙奎醚組大鼠TLR4、NF-κB蛋白相對表達量及IL-6、IL-1β水平較高(均P<0.05)；與模型組比較，鹽酸戊乙奎醚組大鼠TLR4、NF-κB蛋白相對表達量及IL-6、IL-1β水平較低(均P<0.05)。見表4、圖2。

表4 3組大鼠腦組織中TLR4/NF-κB通路蛋白相對表達量及炎癥因子水平的比較(x±s)

圖2 各組TLR4/NF-κB通路蛋白的表達情況

2.6 各組大鼠腦組織中的自噬和凋亡相關蛋白表達 與正常組比較，模型組、鹽酸戊乙奎醚組大鼠Beclin-1、MAP1LC3B、PI3K、mTOR相對表達量較高(均P<0.05)；與模型組比較，鹽酸戊乙奎醚組大鼠Beclin-1、MAP1LC3B、PI3K、mTOR相對表達量較低(均P<0.05)。見表5和圖3。

表5 3組大鼠自噬和凋亡相關蛋白相對表達量的比較(x±s)

A B C

3 討 論

腦梗死是一種臨床常見的腦組織缺血缺氧壞死性疾病，具有病情進展快、致殘致死率高的特點，嚴重威脅患者健康[8-9]。臨床上治療腦梗死的手段主要包括介入治療、溶栓治療等，但是目前尚無治療腦梗死的特效手段，多數(shù)患者會出現(xiàn)一定程度的神經系統(tǒng)后遺癥，因此尋找一種有效的治療方法具有重要意義[10-11]。鹽酸戊乙奎醚作為一種M受體拮抗劑，可選擇性拮抗M1、M3受體，能夠抑制乙酰膽堿毒性，從而減輕神經細胞損傷，具有一定的神經元保護作用。

腦水腫是腦梗死常見的病理改變，可損害神經系統(tǒng)功能。本研究中，模型組大鼠腦組織出現(xiàn)大片梗死病灶，鏡下可見腦組織細胞排列無規(guī)則，細胞核破裂，間質水腫，腦組織含水量增加，符合腦梗死的病理改變。有研究顯示，腦梗死的發(fā)生和發(fā)展不僅可造成機體神經功能的損害，還會對患者的認知功能造成一定的影響[12-13]。本研究結果顯示，與正常大鼠相比，腦梗死大鼠的逃避潛伏期較延長，神經行為學評分升高(P<0.05)，提示腦梗死大鼠出現(xiàn)認知功能障礙和神經功能損害。而使用鹽酸戊乙奎醚干預后，腦梗死大鼠的腦梗死體積減小，腦組織含水量下降，逃避潛伏期縮短，神經行為學評分降低(P<0.05)，說明鹽酸戊乙奎醚具有一定神經保護作用，不僅可縮小腦梗死大鼠的梗死灶、減輕腦水腫，還可改善大鼠的神經功能和認知功能。

大量臨床研究表示，腦梗死的發(fā)生和發(fā)展伴隨著腦組織氧化應激損傷[14-15]。CAT是機體防御系統(tǒng)的重要酶類清除劑，能夠清除過氧化氫，減輕細胞損傷。腦梗死的發(fā)生和發(fā)展過程中有ROS大量生成，致使腦組織神經元損傷，而ROS具有一定氧化性，故氧化產物8-OHdG也隨之大量生成。本研究結果顯示，腦梗死大鼠CAT水平較低，ROS、8-OHdG水平較高，而使用鹽酸戊乙奎醚干預后腦梗死大鼠CAT水平升高，ROS、8-OHdG水平降低，說明鹽酸戊乙奎醚干預能夠減輕腦梗死大鼠腦組織氧化應激反應，從而發(fā)揮腦保護作用。

腦梗死的嚴重程度與炎癥反應水平有著密切聯(lián)系[16-17]。TLR4/NF-κB通路與機體炎癥反應相關[18-19]：TLR4在腦組織血管細胞中表達，當腦組織出現(xiàn)血氧不足時，腦血管通透性增加，TLR4釋放至血液中，從而參與炎癥反應。IL-6、IL-1β為TLR4/NF-κB通路下游炎癥因子，也與機體炎癥反應密切相關。本研究結果顯示，腦梗死大鼠腦組織TLR4、NF-κB蛋白相對表達量及IL-6、IL-1β水平較高，使用鹽酸戊乙奎醚干預后腦梗死大鼠TLR4/NF-κB通路蛋白及下游炎癥因子表達水平下調，說明使用鹽酸戊乙奎醚干預能夠抑制腦梗死大鼠腦組織炎癥反應，從而起到腦保護作用。

此外，腦梗死的發(fā)生和發(fā)展還伴隨著腦組織神經細胞自噬、凋亡[20-21]。Beclin-1、MAP1LC3B是評價細胞自噬情況的常用指標，二者表達變化與細胞自噬密切相關。PI3K、mTOR為PI3K/蛋白激酶B信號通路的相關蛋白，二者表達變化與細胞凋亡能力密切相關[22]。本研究結果顯示，腦梗死大鼠腦組織Beclin-1、MAP1LC3B、PI3K、mTOR蛋白的表達量均較高，而使用鹽酸戊乙奎醚干預的腦梗死大鼠上述蛋白的表達量降低，說明鹽酸戊乙奎醚干預能夠調控細胞自噬相關蛋白Beclin-1、MAP1LC3B及細胞相關凋亡蛋白PI3K、mTOR的表達，從而抑制腦組織神經細胞自噬、凋亡，進而發(fā)揮神經保護作用。

綜上所述，鹽酸戊乙奎醚不僅可縮小腦梗死大鼠的腦梗死體積、減輕腦水腫，還可改善大鼠的神經功能和認知功能。該藥物的神經保護作用可能與其抑制氧化應激反應、調控TLR4/NF-κB通路及下游炎癥因子以減輕腦組織炎癥反應，以及調控相關蛋白以抑制神經細胞自噬和凋亡有關。