婁 慧，趙曾強(qiáng)，朱金成，張 薇

（1石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆石河子 832000；2新疆農(nóng)墾科學(xué)院生物技術(shù)研究所，新疆石河子 832000）

0 引言

棉花是世界上重要的經(jīng)濟(jì)作物，在中國經(jīng)濟(jì)發(fā)展中占據(jù)著重要地位。新疆由于光熱資源豐富，已成為中國最大的棉花種植區(qū)。棉花是喜溫作物，新疆4—5月是棉花播種期，由于獨特的地理條件，經(jīng)常會發(fā)生低溫和冷害情況，影響種子的萌發(fā)及生長發(fā)育[1]。作物生長發(fā)育包含著多種環(huán)節(jié)，種子萌發(fā)是作物生長全過程最為重要的環(huán)節(jié)，許多生理和生化反應(yīng)均發(fā)生于種子吸脹之后，以便為幼苗的后期生長提供了充足養(yǎng)分儲備，并且種子萌發(fā)還決定了作物后期的生長狀況，最終影響了作物的產(chǎn)量以及經(jīng)濟(jì)效益[2]。當(dāng)作物在萌發(fā)初期受到低溫冷害，植物體細(xì)胞內(nèi)活性氧平衡會被打亂，將導(dǎo)致種子不能夠正常地發(fā)芽出苗，降低種子的萌發(fā)指數(shù)[3]。過低的溫度將會使植物體內(nèi)的正常代謝系統(tǒng)紊亂，使作物不能順利進(jìn)入萌發(fā)階段，細(xì)胞膜上的膜系統(tǒng)無法正常發(fā)揮其功能，導(dǎo)致活性氧自由基的數(shù)量大幅減少，植物體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)中的SOD、POD、CAT的活性快速下降，MDA和H2O2的含量有所增加[4]。在低于植株萌發(fā)所需的正常溫度時，植物通過增加滲透調(diào)節(jié)來減少低溫脅迫造成的傷害，從而為新陳代謝的發(fā)育提供必要的營養(yǎng)。因此，研究棉花種子在低溫脅迫下的萌發(fā)特性及調(diào)控作用具有重要意義。褪黑素（Melatonin）是一種外源激素，適量施用有利于作物生長發(fā)育[5-7]。褪黑素的預(yù)處理可改善低溫脅迫下玉米種子的萌發(fā)特性，并進(jìn)一步提高其抗逆性[8]。研究表明，褪黑激素可以增強(qiáng)種子抵抗不良環(huán)境的生存能力。當(dāng)噴施一定濃度的褪黑素于大豆的葉片，發(fā)現(xiàn)大豆的長勢相比較于對照組，有著很明顯的改善，主要表現(xiàn)在植株葉片數(shù)目和每莢豆粒數(shù)目的增加[9]。在低于菘藍(lán)種子正常生長的溫度條件下，對其施加一定濃度的褪黑素，可減少膜脂過氧化所帶來的損傷，有利于植物生長發(fā)育[10]。通過試驗證明，在化學(xué)物質(zhì)的脅迫下，黑麥草種子浸泡于褪黑素中一段時間，其萌發(fā)指標(biāo)均有所改善，生長發(fā)育狀況得到了改善，干鮮重有所增加[11]。同時，已經(jīng)證實，在低溫的生長環(huán)境下，通過使用外源褪黑素可以幫助水稻種子進(jìn)行正常的生長發(fā)育，以便順利進(jìn)行到萌發(fā)階段，可提高水稻的萌發(fā)指數(shù)。在鹽脅迫下，水稻種子細(xì)胞內(nèi)將會發(fā)生劇烈的化學(xué)反應(yīng)，會產(chǎn)生許多有毒物質(zhì)，而不利于作物生長，導(dǎo)致植物體細(xì)胞中一系列的抗氧化酶活性顯著降低，外源施加65 μmol/L褪黑素可減輕對抗氧化酶的抑制作用[12-13]。近年來，國內(nèi)外眾多學(xué)者研究了低溫脅迫對棉花種子萌發(fā)特性的影響。但關(guān)于外源褪黑素對棉花種子萌發(fā)性狀的調(diào)節(jié)作用報道較少。本研究以海島棉品種“新海41號”為材料，探求低溫環(huán)境下棉花種子萌發(fā)特性、抗氧化酶活性影響。明確在低溫脅迫條件下，不同濃度褪黑素對棉花種子萌發(fā)的調(diào)控作用，為利用褪黑素提高棉花種子耐冷性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

材料為海島棉品種‘新海41號’，由石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院棉花分子育種實驗室提供。

褪黑素購于Sigma-Aldrich公司。丙二醛（MDA）、超氧化歧化酶（SOD）、過氧化氫（H2O2）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）檢測試劑盒購于蘇州科銘生物公司，其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。試驗在石河子大學(xué)北苑新區(qū)農(nóng)科樓實驗室，于2020年2月—5月進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 試驗設(shè)計 選取大小相同，籽粒飽滿的棉花種子，用NaClO3充分浸泡1 min，用75%乙醇浸泡3 min，蒸餾水沖洗4次。將消毒后的棉花種子，晾干于超凈工作臺上，恢復(fù)至種皮表面無水分，用不同濃度褪黑素浸種24 h后，將種子放在帶有2層發(fā)芽紙的發(fā)芽盒中，在光照培養(yǎng)箱進(jìn)行種子萌發(fā)實驗（相對濕度設(shè)定為50%、16 h光照/8 h黑暗、光照強(qiáng)度為284 μmol/（m2·s）。對于不同的處理，進(jìn)行3次重復(fù)，選取棉花種子50粒，在培養(yǎng)箱中低溫15℃下分別用濃度為0（CK2）、10（MT10）、20（MT20）、50（MT50）、100（MT100）μmol/L的褪黑素浸種發(fā)芽7天，以常溫25℃下用蒸餾水處理為對照（CK1），胚芽長度大于棉花種子長度的1/2視為發(fā)芽。

1.2.2 萌發(fā)指標(biāo)測定 棉花種子萌發(fā)的周期為7天，以放人培養(yǎng)箱當(dāng)天為標(biāo)準(zhǔn)，每天于早上10:00，記錄種子相關(guān)萌發(fā)數(shù)據(jù)。

其中，Gt是對應(yīng)天數(shù)發(fā)芽率，Dt是相對發(fā)芽天數(shù)。

1.2.3 胚根長度測定 當(dāng)棉花種子萌發(fā)7天時，從各處理中分別取出20粒種子，用游標(biāo)卡尺進(jìn)行胚根長度的測量，每個處理重復(fù)3次。

1.2.4 抗氧化酶活性的測定 取對照及褪黑素處理后3、6、12、24、48 h的棉籽，每份3～5 g，去除種皮后液氮速凍，保存于-80℃超低溫冰箱備用。每處理重復(fù)3次。MDA含量測定采用硫代巴比妥酸比色法；SOD活性的檢測采用氮藍(lán)四唑光化還原法；POD活性采用愈創(chuàng)木酚法；CAT活性采用紫外分光光度計法；H2O2測定采用紫外分光光度計法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Excel軟件處理數(shù)據(jù)和作圖，SPSS軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 褪黑素對低溫脅迫下棉花種子萌發(fā)的影響

由表1可知，15℃低溫處理（CK2）后，其發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)分別為75.26%、72.44%和5.36，與常溫對照（CK1）相比均顯著降低，分別降低了17.41%、15.73%、74.96%；發(fā)芽時間與常溫對照相比延長大概5天，說明低溫脅迫可顯著抑制種子萌發(fā)。不同濃度的褪黑素對低溫脅迫下棉花種子萌發(fā)的影響不同。隨著褪黑素濃度增多，MT20處理下種子發(fā)芽率最高，為88.59%，比CK2增加了9.11%。但隨著褪黑素濃度持續(xù)增加，MT50、MT100處理下棉花種子發(fā)芽率與CK2差異并不明顯，MT100處理下種子發(fā)芽率最低，為74.64%，比CK2降低了2.38%。當(dāng)施加不同濃度褪黑素時，棉花種子發(fā)芽勢變化趨勢與發(fā)芽率相似，均呈現(xiàn)出先上升后下降的變化趨勢。與CK2相比，MT10、MT20、MT50、MT100，種子發(fā)芽勢分別增加了3.72%、4.75%、0.09%、-1.09%。平均發(fā)芽時間與CK2相比較，MT10、MT20、MT50、MT100 分別縮短了 0.8、1.9、0.1、-0.12天。棉花種子的發(fā)芽指數(shù)在褪黑素作用下呈現(xiàn)出上升狀態(tài)，后隨著萌發(fā)時間的延長有所降低，此變化趨勢類似于發(fā)芽勢和發(fā)芽率。上述結(jié)果表明MT10和MT20低濃度褪黑素能有效促進(jìn)種子萌發(fā)，MT50和MT100高濃度褪黑素則不利于其萌發(fā)。

表1 褪黑素對低溫下種子萌發(fā)特性的影響處理

由圖1可知，15℃低溫處理（CK2）后，胚根長度為1.65 cm，與常溫對照（CK1）相比均顯著降低了40.35%，說明低溫脅迫不利于其胚根生長發(fā)育。在低溫脅迫下，褪黑素處理會影響棉花種子胚根的生長，MT10、MT20和MT50處理下，胚根長度均高于低溫對照（CK2）處理，分別為2.33 cm、2.73 cm和1.74 cm，其中MT20處理胚根生長最好，其長度較CK2增加66.06%，而MT100處理下，胚根長度為1.50cm，顯著低于低溫對照。說明MT10、MT20濃度褪黑素處理具有促進(jìn)胚根伸長的作用，MT100濃度褪黑素則不利于胚根伸長。

圖1 褪黑素處理對低溫下胚根長度的影響

2.2 褪黑素對低溫脅迫下棉花種子萌發(fā)期抗氧化酶活性的影響

酶對作物生長發(fā)育非常重要，其中包括很多能夠清除活性氧的酶如SOD，POD，CAT等，它們可以減少逆境脅迫引起的氧化損傷[21]。如圖2可知，SOD活性在各處理下均表現(xiàn)出相同的變化趨勢，呈現(xiàn)出先降低后升高再降低的變化，在種子萌發(fā)3 h時，SOD活性最高，12 h時，酶活性降至最低。在15℃低溫脅迫下，SOD活性與常溫對照（CK1）相比顯著增加，在萌發(fā)3 h時差異最明顯，CK2處理SOD活性為415.36 U/g，比CK1提高了5.52%。隨著褪黑素濃度的持續(xù)增加，各處理的SOD活性變化趨勢并不完全一致，與CK2相比較，MT10、MT20處理SOD活性明顯增加，其中MT20處理時，SOD活性在各個時間點均最高，在萌發(fā)3h時可達(dá)423.16 U/g，比CK2增加了2.65%，MT100處理SOD活性則顯著降低。

圖2 褪黑素對低溫下種子萌發(fā)期SOD活性的影響

由圖3可知，隨著萌發(fā)時間的延長，POD活性在各處理下均表現(xiàn)出逐漸下降趨勢。在種子萌發(fā)3 h時，POD活性最高，48 h時，酶活性降至最低。在15℃低溫脅迫下，POD活性與常溫對照（CK1）相比顯著增加，在萌發(fā)24h時差異最為顯著，CK2處理POD活性為98g/min，比CK1提高了42.31%。當(dāng)施用不同濃度褪黑素時，各處理的POD活性變化趨勢并不同，與CK2相比較，MT10、MT20處理POD活性顯著增加，其中MT20處理時，POD活性在各個時間點均最高，在萌發(fā)3 h時可達(dá)198.23 g/min，比CK2增加了6.41%，MT50、MT100處理POD活性與CK2差異不顯著。

圖3 褪黑素對低溫下種子萌發(fā)期POD活性的影

由圖4可知，在48 h萌發(fā)時間內(nèi)，不同處理下CAT活性呈現(xiàn)出先上升后下降，再上升再下降的變化趨勢。低溫脅迫（CK2）處理的CAT活性顯著高于常溫對照（CK1），表明低溫會降低種子的CAT活性。施加不同濃度褪黑素后，MT10和MT20處理下CAT活性顯著高于CK2，其中MT20處理CAT活性最高，在萌發(fā)3、6、12、24、48 h，其活性與 CK2 相比分別增加了9.43%、23.33%、9.26%、21.65%和27.66%，MT50處理與CK2相比無顯著差異，而MT100處理下CAT活性與CK2相比則顯著降低。上述結(jié)果表明，低濃度褪黑素處理能有效增強(qiáng)低溫脅迫下棉花種子的SOD、POD和CAT活性，其中MT20處理增加最為顯著。

圖4 褪黑素對低溫下種子萌發(fā)期CAT活性的影響

2.3 褪黑素對低溫脅迫下棉花種子萌發(fā)期H2O2和MDA含量的影響

發(fā)生逆境脅迫時，植物體內(nèi)活性氧的代謝將會紊亂，H2O2積累量不斷增加[22]。由圖5可知，隨著萌發(fā)時間延長，H2O2含量逐漸降低，但CK2處理中H2O2含量顯著高于CK1，表明低溫脅迫導(dǎo)致H2O2在棉花種子中不斷積累。施加不同濃度褪黑素后，MT10和MT20處理H2O2含量顯著低于CK2，其中MT20處理時，H2O2含量在各個時間點降低均最多，在萌發(fā)3 h時差異最為明顯，比CK2降低了10.81%。MT50和MT100處理H2O2含量與CK2無顯著差異，結(jié)果表明，MT20處理能顯著抑制棉花種子萌發(fā)期H2O2的積累。

圖5 褪黑素對低溫下種子萌發(fā)期H2O2含量的影響

導(dǎo)致植物膜脂過氧化傷害的物質(zhì)有很多，其中MDA是過氧化損傷植物膜脂的主要物質(zhì)[23]。由圖6可知，MDA含量的變化趨勢與H2O2相似，并且隨著種子萌發(fā)時間的延長，其含量逐漸降低。與CK1相比，CK2處理下MDA含量顯著增加，在萌發(fā)3 h時，MDA含量達(dá)到最高0.091 mol/L，比CK1增加了47.17%。施加不同濃度褪黑素后，MT10和MT20處理的MDA含量均顯著低于CK2，其中MT20處理時，棉花種子MDA含量分別為0.085、0.072、0.062、0.060、0.059mol/L，與CK2相比分別降低了10.95%、13.93%、17.63%、18.78%、15.14%。隨著褪黑素濃度的升高，MT50和MT100處理的MDA含量與CK2相比均有所增加，表明MT20濃度褪黑素可以有效減少膜脂氧化損傷，保持植物體細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，高濃度則加重膜脂氧化損傷。

圖6 褪黑素對低溫下種子萌發(fā)期MDA含量的影響

3 討論

3.1 褪黑素對種子萌發(fā)的調(diào)節(jié)作用

溫度低于正常生長溫度將會影響棉花種子萌發(fā)，這將成為作物生長的主要限制因素。棉花在耐低溫方面表現(xiàn)出較其他作物較好的萌發(fā)特性。研究表明，在低濃度外源激素和低溫條件處理下，棉花根部生長狀況較好，并且在同等條件下也有利于地上部生長，有助于棉花植株的出苗，但如果溫度過低，則會不利于棉花的生長[14]。褪黑素，也稱為褪黑激素，是一種胺類激素，在調(diào)節(jié)植物抗性和種子萌發(fā)中起重要作用。利用施加1 μmol/L外源褪黑激素可以減緩鹽脅迫所帶來的損傷，可以改善小麥種子發(fā)芽的情況，有利于其生長[15-16]。水稻在硝基苯酚脅迫情況下，利用低濃度（10 μmol/L）褪黑素處理可有效促進(jìn)水稻種子的萌發(fā)，減輕對水稻種子的傷害，提高了在低溫條件下的生長能力[17]。本試驗結(jié)果表明，施加10 μmol/L和20 μmol/L濃度的褪黑素有助于棉花在15℃低溫處理下種子的順利萌發(fā)，減輕因低溫帶來的植株傷害，有利于棉花后期生長發(fā)育。其中，20 μmol/L褪黑素濃度處理對棉花種子的萌發(fā)效果最佳。

3.2 褪黑素對種子萌發(fā)期胚根的調(diào)節(jié)作用

當(dāng)棉花種子萌發(fā)時所處溫度低于正常發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，將會導(dǎo)致胚根長度無法達(dá)到正常標(biāo)準(zhǔn)。研究發(fā)現(xiàn)，在砷脅迫的非生物脅迫生長環(huán)境下，水稻的生長發(fā)育狀況較差，尤其表現(xiàn)在其根部長度和芽長，而通過施加外源褪黑素，可以減輕砷對作物的毒性作用，并增加水稻的根部長度和莖長[18]；通過對油菜花進(jìn)行噴施適宜濃度的褪黑激素，發(fā)現(xiàn)其長勢好于未噴施的對照組處理，這主要表現(xiàn)在低溫下依舊生長發(fā)育狀況良好，花芽數(shù)目的增多，根部干鮮重的增加[19-20]。本試驗研究表明，在15℃低溫脅迫下，通過施加10 μmol/L和20 μmol/L低濃度褪黑素，可增加低溫脅迫下棉花種子萌發(fā)后胚根的長度。其中，20 μmol/L褪黑素濃度處理下，棉花種子萌發(fā)后胚根生長發(fā)育狀況最好，接近正常萌發(fā)水平，而高濃度褪黑素則會抑制胚根的發(fā)育，其結(jié)果與萌發(fā)試驗所得結(jié)論相一致。

3.3 褪黑素對種子抗氧化酶活性的調(diào)節(jié)作用

活性氧（ROS）的產(chǎn)生是因植物受到了低溫脅迫，抑制了正常生長，使得MDA和H2O2含量大量增加，同時還會導(dǎo)致膜脂脫脂情況發(fā)生。通過對棉花進(jìn)行一定濃度的外源抗壞血酸處理，發(fā)現(xiàn)棉花種子萌發(fā)期間抗氧化酶活性有所提升，棉花耐冷性增強(qiáng)[21]；在低溫脅迫下，通過對番茄幼苗噴施外源褪黑素，發(fā)現(xiàn)SOD、POD、CAT活性增強(qiáng)，生長狀況好于對照組[22-23]，各種抗氧化酶的活性在一定范圍上發(fā)生變化，以維持作物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，同時保證其功能的完備性。褪黑素因其具備高親脂性、部分親水性的獨特性質(zhì)和去除活性氧的必需基團(tuán)，因此可減輕ROS所帶來的傷害[24-25]。本試驗研究表明，在15℃低溫條件下，棉花種子的SOD、POD、CAT活性，因施加不同濃度褪黑素處理有所升高，同時減輕了植物體細(xì)胞膜脂過氧化的損傷，種子耐低溫能力在褪黑素的作用下也有所提升。其中20 μmol/L褪黑素濃度處理下，棉花種子抗氧化酶活性較好，抑制膜脂過氧化現(xiàn)象的產(chǎn)生，降低MDA和H2O2的含量，以此來減少低溫條件下對棉花種子所帶來的傷害，提高了棉花種子萌發(fā)期的耐低溫特性。

4 結(jié)論

低于正常萌發(fā)溫度將不利于棉花種子的發(fā)芽，10 μmol/L和20 μmol/L濃度的褪黑素有助于種子萌發(fā)和胚根伸長，提高抗氧化酶活性，減少MDA和H2O2的積累，緩解對細(xì)胞膜脂過氧化的傷害，增強(qiáng)對低溫環(huán)境的抵抗能力；其中MT20褪黑素對低溫脅迫下棉花種子萌發(fā)的調(diào)控效果最好。