柴保國，陳佩格，韓 露，高貴超，崔俊亞，李登云

（1.河南牧翔動物藥業(yè)有限公司，河南 鄭州 450000；2.河南省畜牧總站）

黃芪、防風(fēng)和白術(shù)是常用的中醫(yī)藥材，這三味藥組成又稱玉屏風(fēng)散，是治療氣虛感冒的代表方劑。黃芪能夠調(diào)節(jié)血壓、增強免疫功能，白術(shù)能夠健脾胃，降血糖，而防風(fēng)有消炎鎮(zhèn)痛等作用，防風(fēng)配合著黃芪、白術(shù)，能夠健脾去濕，對于疾病有防范作用，同時還能夠治療感冒。絞股藍又名七葉膽，五葉參，具有降血脂，調(diào)血壓，防治血栓，防治心血管疾患，調(diào)節(jié)血糖，促睡眠，緩衰老，抗癌，提高免疫力等特點。

中藥發(fā)酵是指在微生態(tài)學(xué)理論指導(dǎo)下，將中藥研究與微生物發(fā)酵技術(shù)相結(jié)合，利用微生物強大的代謝和繁殖能力，以中草藥物或提取物（液）為基質(zhì)使有機物分解的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)過程。在中藥發(fā)酵過程中，菌種的選育是中藥發(fā)酵的關(guān)鍵。目前在多數(shù)實驗研究中，多采用枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、植物乳桿菌等，但枯草芽孢桿菌對不同的中藥發(fā)酵效果也有所不同。根據(jù)李國紅等的實驗結(jié)果，在經(jīng)枯草芽孢桿菌發(fā)酵后，部分中藥的發(fā)酵產(chǎn)物抗菌活性增加，而部分中藥的發(fā)酵產(chǎn)物抗菌活性卻有所降低。凝結(jié)芽孢桿菌是兼性厭氧菌，具備高抗逆性、強黏附性、分泌消化酶、產(chǎn)抑菌物質(zhì)、易于培養(yǎng)與貯存穩(wěn)定等獨特優(yōu)勢，現(xiàn)已被農(nóng)業(yè)農(nóng)村部列為可直接飼用于畜禽生產(chǎn)的新型飼料添加劑。因此，凝結(jié)芽孢桿菌是目前畜牧業(yè)研究和應(yīng)用的熱點。

1 材料與方法

1.1 藥材和菌種

黃芪、白術(shù)、防風(fēng)、絞股藍購自河北省安國市永益中藥材有限公司，經(jīng)河南省牧翔動物藥業(yè)有限公司質(zhì)管部檢驗為正品。凝結(jié)芽孢桿菌（含量為20 億cfu/g），購自山東康地恩生物科技有限公司。

1.2 主要試劑

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、蛋白胨、葡萄糖、酵母浸出物，均購自北京奧博星生物科技有限公司；人參皂苷Rb1，購自中國藥品生物制品檢定所；淀粉和玉米粉購自農(nóng)貿(mào)市場；硫酸銨，購自上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.3 凝結(jié)芽孢桿菌的復(fù)蘇與培養(yǎng)

將保存的凝結(jié)芽孢桿菌菌種接種到種子斜面培養(yǎng)基，活化培養(yǎng)。取活化的菌種接種到50 mL（250 mL 三角瓶）營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃，180r／min，培養(yǎng)24 h后備用。

1.4 復(fù)方中藥發(fā)酵條件優(yōu)化

采用單向透氣閥袋固體發(fā)酵方法對復(fù)方中藥黃芪、白術(shù)、防風(fēng)、絞股藍進行發(fā)酵，發(fā)酵室溫度控制在30 ℃，濕度≤50%，考察不同碳源、氮源及發(fā)酵時間對發(fā)酵進程的影響。

1.4.1 最佳發(fā)酵碳源篩選

凝結(jié)芽孢桿菌可以分解淀粉，因此選擇以葡萄糖、淀粉和玉米粉作為備選碳源，考察不同碳源在不同發(fā)酵時間對發(fā)酵進程的影響。通過測定發(fā)酵后凝結(jié)芽孢桿菌數(shù)量，選擇最佳發(fā)酵碳源及發(fā)酵時間。

1.4.2 最佳發(fā)酵氮源篩選

選擇以硫酸銨、酵母浸出物及蛋白胨分別作為氮源，考察不同氮源在不同發(fā)酵時間對發(fā)酵進程的影響。通過測定發(fā)酵后凝結(jié)芽孢桿菌數(shù)量，選擇最佳發(fā)酵氮源及發(fā)酵時間。

1.5 發(fā)酵前后有效成分檢測

按比例分別稱取復(fù)方中藥和最優(yōu)發(fā)酵體系發(fā)酵的復(fù)方中藥樣品100 g，各加10倍量水煎煮40 min，離心取上清液濃縮定容至400 mL，分別進行高效液相色譜法檢測絞股藍皂苷含量變化和紫外分光光度計法檢測總多糖含量變化。

早期中立評估(Early Neutral Evaluation，簡稱ENE)作為一種非訴訟糾紛解決方式，是近年來國際上興起的一種司法ADR制度。與民間ADR不同，司法ADR又稱法院附設(shè)ADR，是指以法院為主持機構(gòu)或者受法院指導(dǎo)，但與訴訟程序截然不同的具有準(zhǔn)司法性質(zhì)的訴訟外糾紛解決程序?！?〕

分別取適量的發(fā)酵前后提取液，加乙醇靜置24 h后離心，收集沉淀加適量蒸餾水溶解稀釋，然后進行二次醇沉，最后收集沉淀且烘干至恒重后使用蒸餾水溶解稀釋，制成樣品溶液。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用苯酚-硫酸法，取2 mL樣品溶液在490 nm處測定吸收度，計算。

1.6 絞股藍皂苷含量變化檢測

絞股藍中含有50多種皂苷，其中Ⅲ、Ⅳ、Ⅶ、Ⅻ分別與人參皂苷Rb1、Rb2、Rd、F2 為同一物質(zhì)，該研究以人參皂苷Rb1為對照品，采用高效液相色譜法檢測發(fā)酵前后提取液中絞股藍皂苷的含量變化。

高效液相色譜條件為，色譜柱：C18反相色譜柱（粒徑5 m，250 mmx4.6 mm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液（32∶68）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：203 nm；柱溫：40 ℃；進樣量：10 uL。樣品中人參皂苷Rb1 的含量（X1）以質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）表示，計算方式為：X1=（P1×m2×n1）/（P2×m1×n2）×100%。其中P1 為樣品溶液峰面積值；m2 為標(biāo)準(zhǔn)品稱樣質(zhì)量（g）；n1為樣品稀釋倍數(shù)；P2為標(biāo)準(zhǔn)品溶液峰面積值；m1為樣品稱樣質(zhì)量（g）；n2為標(biāo)準(zhǔn)品稀釋倍數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵時間優(yōu)化

不同碳源在不同發(fā)酵時間對凝結(jié)芽孢桿菌數(shù)量的影響結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，葡萄糖、淀粉及玉米粉作為碳源時，凝結(jié)芽孢桿菌的數(shù)量隨著發(fā)酵時間的增加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，其中凝結(jié)芽孢桿菌的數(shù)量在發(fā)酵48 h時達到高峰。在發(fā)酵48 h時，用玉米粉發(fā)酵的凝結(jié)芽孢桿菌數(shù)量明顯比用葡萄糖和淀粉發(fā)酵的數(shù)量高，呈差異性顯著，所以在發(fā)酵時間為48 h時，最佳發(fā)酵碳源為玉米粉。

圖1 不同碳源在不同發(fā)酵時間對凝結(jié)芽孢桿菌數(shù)量的影響

不同氮源在不同發(fā)酵時間對凝結(jié)芽孢桿菌數(shù)量的影響結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，硫酸銨、酵母浸出物及蛋白胨作為氮源時，凝結(jié)芽孢桿菌的數(shù)量隨著發(fā)酵時間的增加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，其中凝結(jié)芽孢桿菌的數(shù)量在發(fā)酵48 h時達到高峰。在發(fā)酵48 h時，用蛋白胨發(fā)酵的凝結(jié)芽孢桿菌數(shù)量明顯比用酵母浸出物和硫酸銨發(fā)酵的數(shù)量高，呈差異性顯著，所以在發(fā)酵時間為48 h時，最佳發(fā)酵氮源為蛋白胨。

圖2 不同氮源在不同發(fā)酵時間對凝結(jié)芽孢桿菌數(shù)量的影響

2.2 發(fā)酵產(chǎn)物有效成分檢測

發(fā)酵前后皂苷含量的變化如圖3所示。由圖3可知，相較發(fā)酵前，發(fā)酵后絞股藍皂苷的含量大大提高，呈差異性極顯著。說明凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵可以降解藥材中的纖維素，促進復(fù)方中藥的有效成分溶出。

圖3 發(fā)酵前后皂苷含量的變化

發(fā)酵前后多糖含量的變化如圖4所示。由圖4可知，相較發(fā)酵前，發(fā)酵后總多糖的含量大大提高，呈差異性顯著。說明凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵可以分解藥材的細胞壁，促使多糖從細胞壁或者蛋白復(fù)合體中游離出來。

圖4 發(fā)酵前后多糖含量的變化

3 討論

為確保食品安全、降低耐藥性風(fēng)險及抗生素殘留造成的危害，世界各國紛紛在食品動物飼養(yǎng)過程中實行“減抗”、“禁抗”政策，研究開發(fā)新型抗生素替代產(chǎn)品以減少抗生素的使用是一條可行之路。

發(fā)酵中獸藥作為一種新型抗生素替代產(chǎn)品，成為目前畜牧業(yè)研究的熱點。該研究通過單因素試驗法采用凝結(jié)芽孢桿菌對中藥復(fù)方進行固體發(fā)酵，摸索凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵中藥的最佳碳源為玉米粉，與李登云、崔東良等研究結(jié)果一致；最佳氮源為蛋白胨，最優(yōu)發(fā)酵時間為48 h。

黃芪、白術(shù)、防風(fēng)及絞股藍作為一種提升機體免疫力的中藥組方，其發(fā)揮功能的主要有效成分是多糖類和皂苷類物質(zhì)。該研究通過檢測發(fā)酵前后多糖類和皂苷類的含量變化，研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后可有效提高多糖及皂苷等有效成分的溶出，為后期發(fā)酵復(fù)方中藥在臨床中應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

4 小結(jié)

通過用凝結(jié)芽孢桿菌對復(fù)方中藥進行發(fā)酵，摸索發(fā)酵最佳碳源、氮源及發(fā)酵時間，并檢測發(fā)酵前后凝結(jié)芽孢桿菌含量及總多糖、絞股藍皂苷含量的變化。試驗結(jié)果表明：最佳發(fā)酵碳源為玉米粉，最佳發(fā)酵氮源為蛋白胨，最優(yōu)發(fā)酵時間為48 h。該發(fā)酵條件下，凝結(jié)芽孢桿菌含量增加，發(fā)酵的復(fù)方中藥有效成分總多糖及絞股藍皂苷含量增加?！?/p>