楊彩瓊， 李 安， 楊義成， 王小利， 王子苑， 舒健虹

(1.凱里市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局， 貴州 凱里 556000； 2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草業(yè)研究所， 貴陽(yáng) 550006；3.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院/山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/山地生態(tài)與農(nóng)業(yè)生物工程協(xié)同創(chuàng)新中心， 貴陽(yáng) 550025)

黑麥草(LoliumperenneL.)屬于禾本科一年生或多年生優(yōu)良牧草，在我國(guó)長(zhǎng)江中下游及其以南各地均有大面積栽培[1-2]，其優(yōu)勢(shì)在于充分利用田間水、熱、光、氣等自然資源實(shí)施引草入田。可解決冬春季因青綠飼草不足而家畜生長(zhǎng)緩慢、掉膘甚至死亡問(wèn)題。一年生黑麥草是一種高產(chǎn)耐寒，適口性佳，粗蛋白含量高的優(yōu)質(zhì)牧草。利用冬閑田種植一年生黑麥草，既能提供食草家畜冬季所需營(yíng)養(yǎng)，增強(qiáng)抵抗能力，又提高了土地復(fù)種指數(shù)，還可以將草收割后殘存在田土中的根系翻漚作肥培肥土壤[3-4]。為了其產(chǎn)量能夠持續(xù)供應(yīng)，需要滿足農(nóng)作物生產(chǎn)所需的氮、磷等營(yíng)養(yǎng)元素，工業(yè)化肥一直被認(rèn)為是實(shí)現(xiàn)這一目的主要途徑。然而隨著集約化的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)加劇了溫室效應(yīng)，并造成了嚴(yán)重的環(huán)境問(wèn)題，如大氣污染、地表水和地下水富營(yíng)養(yǎng)化以及土地酸化和降解[5]，微生物和植物都共生于土壤中，近年來(lái)已將微生物群落解釋為植物抗逆性的關(guān)鍵因素，可通過(guò)微生物的活動(dòng)增加植物養(yǎng)分的供應(yīng)，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提高作物產(chǎn)量，改善作物品質(zhì)。植物根際促生菌通過(guò)機(jī)制包括增加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)，產(chǎn)生植物激素，增強(qiáng)其他有益細(xì)菌對(duì)植物病害的控制[6-11]等一系列生防機(jī)制，促進(jìn)植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)的吸收，有利于植物生長(zhǎng)提高產(chǎn)量。禾本科牧草和禾谷類作物根際及葉際具有與豆類作物類似的生物固氮、溶磷及分泌植物激素的菌株[12]。雖然從實(shí)驗(yàn)室所獲得的菌株在理論上有一定的促生效果，但關(guān)于多種菌混合接種植物體的盆栽試驗(yàn)及其促生效應(yīng)至今研究不多[13]。因此，為了探索固氮菌和溶磷菌組合菌劑對(duì)黑麥草生產(chǎn)性能的影響，本研究以禾本科和豆科植株根際分離篩選的固氮菌、溶磷菌種為材料進(jìn)行組合實(shí)驗(yàn)，探討不同菌種組合對(duì)黑麥草生長(zhǎng)性能的影響，以及菌株間分泌激素和有機(jī)酸的變化，以期為黑麥草等禾本科牧草與禾谷類作物微生物菌肥的研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

黑麥草品種為邦德(Abundant)黑麥草，種子購(gòu)于貴陽(yáng)霖卉園林綠化有限公司。

供試菌株為本試驗(yàn)前期從當(dāng)?shù)囟箍坪秃瘫究颇敛莞H分離的固氮菌和溶磷菌株，并利用黑麥草進(jìn)行回接篩選實(shí)驗(yàn)，將黑麥草產(chǎn)量較高的供試固氮菌株和溶磷菌株，分別進(jìn)行兩兩交叉劃線拮抗試驗(yàn)，選擇不發(fā)生拮抗反應(yīng)的3株固氮菌株(CS 34-3、CS 6-3-2、CS 1-5)和3株溶磷菌株(PD 4-5、P 35-2、P 33-3)，將菌株制備成菌懸液進(jìn)行復(fù)合菌種試驗(yàn)，見表1。

表1 供試菌種來(lái)源及編號(hào)

1.2 復(fù)合菌的培養(yǎng)

將供試促生菌接種在固體LB斜面上活化，然后轉(zhuǎn)接在LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃，150 r·min-1，搖床培養(yǎng)，菌株培養(yǎng)2 d，用液體LB培養(yǎng)基調(diào)OD值(λ=600 nm)，使菌體濃度達(dá)109個(gè)·mL-1，按1∶1的比例[15]分別吸取固氮菌和溶磷菌進(jìn)行混合培養(yǎng)，其總量為150 mL，ck(LB培養(yǎng)液)，菌株培養(yǎng)2～3 d后進(jìn)行灌根處理，復(fù)合菌劑處理組合見表2。

1.3 Hoagland全營(yíng)養(yǎng)液

配方如下：1.25 mM KNO3，1.25 mM Ca(NO3)2·4 H2O，0.5 mM MgSO4·7 H2O， 0.25 mM KH2(PO4)， 11.6 μM H3BO3，4.6 μM MnCl2·4 H2O，0.19 μM ZnSO4·7 H2O，0.12 μM Na2MoO4·2 H2O，0.08 μM CuSO4·5 H2O和10 μM Fe(III)-EDTA[17]。

注：缺乏氮素的系統(tǒng)中，NO3-為被Cl-取代，在缺磷的系統(tǒng)中(PO4)3-被(SO4)2-取代。

1.4 蛭石盆栽試驗(yàn)

選擇無(wú)蟲害的黑麥草種子，在75%的酒精中浸泡2 min，用3%次氯酸鈉滅菌10 min，然后用無(wú)菌水清洗5～6次，播種在盛有滅菌并混有磷礦粉120 g的蛭石塑料盆(8.2 cm×11 cm)中，每盆20顆種子，將植株置于白天25 ℃、夜間25 ℃、每天光照16 h的人工氣候室中培養(yǎng)。出苗后每盆留生長(zhǎng)一致的幼苗12株，每個(gè)花盆用針打入40 mL的復(fù)合菌液(20 mL菌液+20mL無(wú)菌水)，不接種用相同處理量的LB培養(yǎng)液為全空白對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)5次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組排列。幼苗噴施不同的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液(上海國(guó)藥、表2) 保持基質(zhì)濕潤(rùn)，處理培養(yǎng)30 d，植株生長(zhǎng)共43 d后收獲。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.5 促生菌株分泌激素和有機(jī)酸種類及含量分析

參考王召娜等[18]的方法，取第9天的培養(yǎng)液采用高效液相色譜法測(cè)定其有關(guān)激素和有機(jī)酸成分。

1.5.1發(fā)酵液成分測(cè)定

取一定量的發(fā)酵液，4 ℃，12 000 r·min-1離心10 min，取1 mL上清液，用針頭式過(guò)濾器濾膜(0.45 um)過(guò)濾于帶有內(nèi)襯管的樣品瓶?jī)?nèi)待測(cè)。

1.5.2標(biāo)準(zhǔn)品混合液制備

分別準(zhǔn)確稱量激素(GA3、IAA、ZT)和有機(jī)酸(蘋果酸、草酸、檸檬酸、甲酸、乳酸、丁酸)標(biāo)準(zhǔn)品，將其溶解后定容即標(biāo)準(zhǔn)品混合液。

1.5.3含量測(cè)定

激素和有機(jī)酸含量使用HPLC(Aglient 1260)分析。

1.6 促生菌對(duì)黑麥草地上部分的影響

每一處理的每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)選取5株(共25株)測(cè)量株高，植株高度為地面到旗葉的高度。刈割后每盆選取10株為一個(gè)整體測(cè)定，每組測(cè)5個(gè)重復(fù)(以第一片葉葉痕處為劃分標(biāo)準(zhǔn))，稱地上部分的鮮重；在105 ℃下殺青15 min，65 ℃烘干至恒重，稱重。

1.7 植株全磷、全氮含量的測(cè)定

全氮含量采用全自動(dòng)凱氏定氮法測(cè)定，全磷含量采用紫外可見分光光度法[16]。

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003和SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Tukey多重比較檢驗(yàn)不同處理間的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同復(fù)合促生菌對(duì)黑麥草單株干物質(zhì)產(chǎn)量的影響

不同復(fù)合促生菌劑對(duì)黑麥草單株干物質(zhì)產(chǎn)量都有促進(jìn)作用(圖1)，處理組黑麥草單株干物質(zhì)產(chǎn)量在1.25～1.78 g之間，對(duì)照組為0.72～1.36 g。促生效果最顯著的是復(fù)合菌劑B 3，其單株干物質(zhì)產(chǎn)量為1.78 g，較ck1、ck2和ck3分別增加30.88%、81.63%、147.22%，差異極顯著(p<0.01)；其次是處理組B 1、B 2、C 2和C 1與ck1(全營(yíng)養(yǎng)液)相比分別增加22.79%、16.91%、11.69%、8.82%，差異極顯著；A 1和A 2的單株干物質(zhì)產(chǎn)量明顯低于ck1，與相同營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)的ck2相比增加27.55%、30.61%，差異極顯著；單株干物質(zhì)產(chǎn)量順序?yàn)椋築 3>B 1>B 2>C 2>C 1>B 4>ck1>A 2>A 1>ck2>ck3。表明所施加復(fù)合促生菌劑的黑麥草植株對(duì)其地上生物量都有促生作用，其中B 3、B 1、B 2、C 2這4個(gè)組合最有利于增加黑麥草植株產(chǎn)量。

圖1 不同復(fù)合促生菌劑對(duì)黑麥草植株地上生物量的影響

2.2 不同復(fù)合促生菌劑對(duì)黑麥草株高的影響

不同復(fù)合促生菌對(duì)黑麥草生長(zhǎng)都有促進(jìn)作用(除A 2外)，處理組B 4、B 3和B 2與ck1相比植株增高25.99%、24.63%、13.33%，差異極顯著(表3)；其次為B 1、C 2和C 1組合菌劑，較ck1分別增高10.61%、9.64%、5.62%，差異不顯著(p>0.05)，與ck2相比分別增高31.80%、30.64%、25.84%，差異極顯著；處理組A 1、A 2的株高均比ck1顯著降低，A 1與ck2相比增加9.91%，但差異不顯著；對(duì)黑麥草株高的促進(jìn)效果依次為：B 4>B 3>B 2>B 1>C 2>C 1>ck1>A 1>ck2>A 2>ck3。所進(jìn)行的不同復(fù)合菌劑處理試驗(yàn)中A 2對(duì)黑麥草株高生長(zhǎng)的促進(jìn)效果最差，B 4、B 3、B 2和B 1這4個(gè)組合菌劑最有利于促進(jìn)黑麥草株高的生長(zhǎng)。

表3 不同促生菌對(duì)黑麥草株高的影響

2.3 不同復(fù)合促生菌對(duì)黑麥草植株N、P含量的影響

如圖2所示，不同復(fù)合促生菌劑對(duì)黑麥草植株吸收氮量的影響不同，處理組A 1、A 2與ck1相比黑麥草植株全氮含量分別增加12.07%、10.53%，差異極顯著；處理組B 1、B 4、C 1、C 2與ck1和ck2相比植株全氮量極顯著降低，與ck3相比增加1.17%～2.33%，但差異不顯著；處理組B 2和B 3與ck3相比植株的氮含量降低2.33%、2.72%，但差異不顯著，不同處理黑麥草植株氮含量順序?yàn)椋篈 1>A 2>ck1>ck2>C 1>B 1>B 4>C 2>ck3>B 2>B 3，在所進(jìn)行的試驗(yàn)組合中，A 1和A 2對(duì)黑麥草植株吸收氮元素的促進(jìn)作用最佳。

圖2 A、B不同組合促生菌劑處理對(duì)黑麥草植株吸收氮、磷量的影響

不同復(fù)合促生菌劑對(duì)黑麥草植株全磷量的影響不同(圖3)，處理組A 2與ck1相比增加9.54%，差異極顯著，A 1與ck1相比增加5.59%，差異不顯著；C 1與ck2相比降低2.03%，差異不顯著；B 2、C 2、B 1、B 3和B 4較ck1和ck2處理的植株磷含量顯著降低，但與ck3相比增加27.42%～42.47%，差異極顯著。不同處理黑麥草植株磷含量順序?yàn)椋篈 2>A 1>ck1>ck2>C 1>B 4>B 3>B 1>C 2>B 2>ck3， 在所進(jìn)行的試驗(yàn)組合中A 1和A 2對(duì)黑麥草植株吸收磷元素的促進(jìn)作用最佳。

2.4 不同復(fù)合促生菌分泌激素的含量

為了進(jìn)一步了解不同復(fù)合促生菌劑分泌激素、有機(jī)酸的種類及含量，選擇了關(guān)聯(lián)性高的6個(gè)組合菌株液體培養(yǎng)生長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定。由表4所示，施入組合菌液A 2的黑麥草ZT含量最高，B 1和C 1與A 1相比增加20.41%、22.30%，差異極顯著，B 4和C 2與A 2相比下降6.47%、17.41%，差異極顯著；GA3含量最高的組合菌劑是C 2，B 1與A 1相比增加33.68%，差異極顯著，C 1與A 1相比有所增加，差異不顯著，B 4和C 2與A 2相比增加40.13%、160.19%，差異極顯著；IAA含量最高的組合菌劑是C 2，B 1與A 1相比增加35.94%，差異極顯著，C 1與A 1相比降低28.13%，差異極顯著，B 4和C 2與A 2相比增加39.39%、15 033.33%，差異極顯著。在試驗(yàn)中C 2組合所分泌的IAA和GA3含量最高，分泌激素總含量依次為C 2>B 4>A 2，B 1>C 1>A 1。

表4 不同復(fù)合促生菌劑分泌激素的含量 單位：μg·mL-1

2.5 不同復(fù)合促生菌分泌有機(jī)酸的含量

從表5看出，在液體培養(yǎng)中復(fù)合促生菌劑分泌有機(jī)酸的種類和含量差異很大，分泌草酸最高的是C 1，為297.41 μg·mL-1，組合菌株中B 1和C 1與A 1相比增加44.32%、48.80%，差異極顯著，B 4和C 2與A 2相比降低29.15%、93.51%，差異極顯著；甲酸含量最高的是C 2，為407.11 μg·mL-1，B 1與A 1相比增加37.54%，差異極顯著，C 1與A 1相比降低39.59%，差異極顯著，B 4和C 2與A 2相比增加174.24%、432.38%，差異極顯著；蘋果酸含量最高的是C 2，為454.23 μg·mL-1，B 1與A 1相比增加43.94%，差異極顯著，C 1與A 1相比有所增加，但差異不顯著，B 4與A 2相比降低54.45%，差異極顯著，C 2與A 2相比增加519.43%，差異極顯著；乳酸含量最高的是B 4，為209.95 μg·mL-1，其他組合菌劑分泌量為20.65～119.33 μg·mL-1，含量高低為B 4>A 2>C 2，B 1>C 1>A 1，組合間差異極顯著；檸檬酸含量最高的是A 2，為65.86 μg·mL-1，其他組合菌劑分泌量為11.18～26.45 μg·mL-1，含量高低為A 2>C 2>B 4，組合間差異極顯著，B 1=C 1=A 1；丁酸含量最高的是B 4為542.80 μg·mL-1，其他組合菌劑分泌量為30.56～80.70 μg·mL-1，含量高低為B 4>A 2>C 2，A 1>B 1=C 1，組合間差異極顯著?？傆袡C(jī)酸含量排序?yàn)锽 4>C 2>A 2，B 1>A 1>C 1。

表5 不同復(fù)合促生菌劑培養(yǎng)分泌有機(jī)酸的含量 單位：μg·mL-1

3 討 論

3.1 復(fù)合促生菌對(duì)黑麥草地上部分的影響

固氮菌可通過(guò)固定空氣中的氮元素為作物提供氮肥，溶磷菌能將土壤中難溶性磷轉(zhuǎn)化成可溶性磷被植物吸收利用，這將逐漸成為代表未來(lái)綠色農(nóng)業(yè)發(fā)展的方向之一[19]。然而固氮菌與溶磷菌，以及同一類菌的不同菌株之間，存在著互作與拮抗等關(guān)系，促生菌株的實(shí)際應(yīng)用效果非常重要，已有文獻(xiàn)對(duì)這方面進(jìn)行報(bào)道，如溶磷菌在玉米株高和干重方面分別增加了35.5%和28.9%[20]，PGPR替代 20%化肥可使豌豆經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量增加 3.2%[21]，促生菌能促進(jìn)大豆和百脈根作物增產(chǎn)和品質(zhì)提高[20]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)不同促生菌組合對(duì)黑麥草地上生物量和株高的影響得知，施入B 3、B 1、B 2、C 2和C 1復(fù)合菌劑的黑麥草干物質(zhì)產(chǎn)量極顯著高于ck1；A 1和A 2極顯著高于ck2；干物質(zhì)產(chǎn)量依次為：B 3>B 1>B 2>C 2>C 1>B 4>ck1>A 2>A 1>ck2。對(duì)黑麥草株高影響，B 4、B 3和B 2極顯著高于ck1，B 1、C 2和C 1極顯著高于ck2；促生效果依次為：B 4>B 3>B 2>B 1>C 2>C 1>ck1>A 1>ck2>A 2；綜合單株干物質(zhì)產(chǎn)量和株高來(lái)看，B 3、B 1、B 2組合最好。說(shuō)明只有篩選出較佳的溶磷菌與固氮菌組合才具有“1+1>2”的良好互作效應(yīng)，不同菌株組合的加成效應(yīng)與韓華雯等[24]和舒健虹等[18]的研究結(jié)果相同?？梢姸喙痰鷦┙M合比單一固氮菌劑組合的促生效果顯著，但并不是簡(jiǎn)單的疊加組合，只有深入研究PGPR的作用機(jī)理，篩選具有疊加促進(jìn)效應(yīng)的菌株組合，才能充分發(fā)揮復(fù)合菌劑的促生增質(zhì)效果[23]。

3.2 復(fù)合促生菌對(duì)黑麥草氮、磷含量的影響

有研究表明，土壤中磷細(xì)菌的生命活動(dòng)可增加土壤水溶性磷含量，為固氮菌提供磷素營(yíng)養(yǎng)，而固氮菌的存在不但增加了土壤的氮素含量并且在其生命活動(dòng)中合成和分泌的生理活性物質(zhì)，加速了磷細(xì)菌芽孢的萌發(fā)，從而增加了水溶性磷形成過(guò)程[24]，而植株氮元素含量增加能夠促進(jìn)磷元素的吸收[25]。在對(duì)黑麥草植株氮、磷含量的分析中可知，施加單一固氮菌加溶磷菌組合菌劑(A 1、A 2)的黑麥草植株氮含量極顯著大于ck1，磷含量A 2極顯著大于ck1，A 1比ck1有所增加，差異不顯著。施加B和C組合劑的黑麥草植株氮、磷含量極顯著低于A組合和ck2處理的植株，但其氮、磷含量極顯著優(yōu)于ck3處理的植株。此結(jié)果與吳統(tǒng)貴等[27]和李小冬等[28]的研究結(jié)果一致。這可能是因?yàn)橹参镌诔掷m(xù)生長(zhǎng)和生物量不斷增加的同時(shí)，氮、磷含量逐漸稀釋降低，植株產(chǎn)量增加與氮、磷含量不成正比。

3.3 復(fù)合促生菌分泌激素的差異

激素能夠調(diào)控植株的生長(zhǎng)發(fā)育，IAA與GA3作為植物的重要內(nèi)源激素之一，具有促進(jìn)植株生長(zhǎng)和延緩衰老的功效[28]，當(dāng)IAA含量降低時(shí)植株生長(zhǎng)會(huì)受到一定的抑制[29]，Law證實(shí)，GA3可以促進(jìn)L-色氨酸轉(zhuǎn)化為D-色氨酸，進(jìn)而被合成IAA[30]，ZT能提高小麥、高羊茅、多年生黑麥草等植物的抗旱性[31-32]。在對(duì)不同復(fù)合促生菌株激素含量的分析中可知，黑麥草ZT含量B 1和C 1極顯著高于A 1，B 4和C 2極顯著低于A 2；黑麥草GA3和IAA總含量B 1>A 1=C 1，C 2>B 4>A 2；IAA含量B 1>A 1>C 1，C 2>A 2>B 4，差異極顯著。在進(jìn)行試驗(yàn)中C 2組合所分泌的IAA和GA3含量最高，但黑麥草株高B 4>B 1>C 2>C 1>A 1>A 2；干物質(zhì)產(chǎn)量B 1>C 2>C 1>B 4>A 2>A 1，可能根系分泌物與菌株的互作還存在其他激素促進(jìn)黑麥草生長(zhǎng)，還需下一步深入研究。

3.4 復(fù)合促生菌分泌有機(jī)酸的差異

有機(jī)酸可以不同程度地增加Ca 2-P、Ca 8-P的含量，促進(jìn)難溶性磷向可溶性磷轉(zhuǎn)化，其中草酸>檸檬酸>酒石酸[33]，在低磷條件下，檸檬酸、草酸、酒石酸能夠抵制土壤對(duì)磷的吸附，達(dá)到解磷效果[34]。試驗(yàn)中復(fù)合菌劑分泌的草酸C 1>B 1>A 1，A 2>B 4>C 2，組間差異極顯著；檸檬酸A 2>C 2>B 4，組間差異極顯著，A 1=B 1=C 1；蘋果酸含量B 1>C 1=A 1，C 2>A 2>B 4；總有機(jī)酸B 1>A 1=C 1，B 4>C 2>A 2，組間差異極顯著，但黑麥草植株磷含量為A 2>B 4>C 2，A 1>C 1>B 1，可見細(xì)菌的溶磷過(guò)程非常復(fù)雜，不能僅僅靠分泌有機(jī)酸含量來(lái)作為判斷指標(biāo)，必須考慮復(fù)合菌種的互作及在宿主根系分泌物的影響下對(duì)微生物生長(zhǎng)環(huán)境的改變，從而影響宿主的產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性，在綜合環(huán)境中尋找具有最佳效應(yīng)的復(fù)合促生菌劑，才能充分發(fā)揮PGPR的促生增質(zhì)效果[35]。

4 結(jié) 論

不同促生菌組合對(duì)黑麥草單株干物質(zhì)產(chǎn)量、株高、及N、P含量都具有一定促生作用，B組合對(duì)黑麥草促生效果較佳，A組合提高黑麥草氮、磷含量最高。組合菌株C 2和B 4分泌的GA3、IAA和ZT激素含量最高，B 4和C 2分泌的總有機(jī)酸含量最高。綜合分析B 1為最佳復(fù)合菌劑，可作為黑麥草專用生物菌肥推廣，優(yōu)質(zhì)促生菌的篩選必須考慮復(fù)合菌種的互作及在宿主根系分泌物的影響下對(duì)微生物生長(zhǎng)環(huán)境的改變，進(jìn)而影響宿主的產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性，所以在開展推廣應(yīng)用前還需進(jìn)行與寄主植株的篩選試驗(yàn)。