蔡含芳，徐 瑤，許會芬，黃永震，李 明*，陳 宏*

(1. 陜西省動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，西北農林科技大學動物科技學院，陜西 楊凌 712100；2. 河南農業(yè)大學動物科技學院，鄭州 450046)

近年來，隨著分子生物技術的發(fā)展，特別是全基因組高通量測序技術的發(fā)展，使得分子標記的研究進入了一個全新的階段，2004年，Sebat等發(fā)現(xiàn)了拷貝數(shù)變異(copy number variation, CNV)的存在[1]。CNV指的是在基因組上1 kb到幾Mb范圍內片段的插入、缺失、重復等，不同于單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)，CNV的覆蓋范圍更廣，遺傳效應更大。Liu等也在牛的染色體上檢測到了大量的CNV區(qū)域[2]。研究表明，CNV作為一種新的基因變異來源，可作為與繁殖、泌乳和生長等多種性狀相關的分子標記[2]。

成纖維生長因子(fibroblast growth factor, FGF)家族有23個成員，在細胞增殖和分化、組織修復、損傷應答和神經系統(tǒng)的信號轉導等生理過程中發(fā)揮重要作用[3-4]。其中，F(xiàn)GF13基因定位在X染色體上，是調節(jié)神經元極化和遷移的微管穩(wěn)定蛋白，也可調節(jié)細胞電壓門控鈉通道的運輸和功能[5]。相較于人和小鼠上的研究，牛FGF13基因功能研究甚少見報道。

郟縣紅牛是我國優(yōu)良的黃牛品種之一，具有體格高大，肌肉豐滿，耐粗飼，適應性強，肉質細嫩，遺傳性穩(wěn)定等特點，是我國肉牛業(yè)發(fā)展不可多得的優(yōu)良肉牛品種[6]。前期重測序結果顯示，牛FGF13基因序列上存在CNV位點。為此，本研究在郟縣紅牛群體中，檢測了FGF13基因的CNV，并研究了其與生長發(fā)育的相關性，為進一步研究牛FGF13基因的功能和郟縣紅牛的遺傳改良工作提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與體尺測量

本研究所用的57份健康的成年郟縣紅牛血樣，采于河南省郟縣，血樣與20 μg/mL終濃度的ACD抗凝劑混合均勻，用冰盒運回實驗室，置于-80℃ 超低溫冰箱長期保存。同時，測量和記錄個體的體尺性狀，包括體高、體長、十字部高、胸圍、管圍等數(shù)據(jù)。

參照Chen的方法[7]，利用酚-氯仿抽提的方法從血樣中提取DNA，分光光度計測定濃度后，稀釋至標準濃度20 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 qPCR 根據(jù)NCBI上公布的牛FGF13基因(GenBank accession number: NW_020192292.1)的序列，找到發(fā)生CNV的DNA序列，以該序列為參考序列，利用Primer 5設計定量引物，以通用轉錄因子3(basic transcription factor 3, BTF3)基因為參考基因，引物的詳細信息如表1所示。

表1 CNV檢測引物信息

20 μL PCR反應體系為：2×SYBR Premix Ex Taq II 10 μL，上下游引物(10 pmol/L)各1 μL，DNA模板2 μL，滅菌雙蒸水6 μL。采用“三步法”的PCR程序：95 ℃預變性30 s，95 ℃ 變性，5 s；60 ℃退火，5 s；68 ℃延伸，15 s；40個循環(huán)。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理 相對拷貝數(shù)的計算參照Livak和Schmittgen的方法[8]。具體的計算公式為：2×2-ΔΔCt，其中，ΔΔCt=ΔCt(實驗組)-ΔCt(參照組)，ΔCt(實驗組) =Ct(實驗組目的基因) -Ct(實驗組內參基因)，ΔCt(參照組) =Ct(參照組目的基因) -Ct(參照組內參基因)。按照Gain(-ΔΔCt>0.5)，Normal(-0.5 ≤ -ΔΔCt<0.5)和Loss(-ΔΔCt≤0.5)，對每個個體的拷貝數(shù)類型進行分類。

利用數(shù)據(jù)分析軟件SPSS 18.0，采用皮爾遜相關分析，分析FGF13基因的相對拷貝數(shù)與郟縣紅牛體尺性狀之間的相關性。采用獨立樣本T檢驗，比較郟縣紅牛群體與對照組秦川牛的相對拷貝數(shù)高低。

2 結果與分析

圖1 FGF13基因CNV的檢測結果

2.1 FGF13基因CNV的檢測

如圖1所示，F(xiàn)GF13基因的相對拷貝數(shù)在郟縣紅牛群體中，顯著高于對照組秦川牛(P<0.05)，郟縣紅牛的相對拷貝數(shù)約是秦川牛的3倍。在郟縣紅牛中，F(xiàn)GF13基因的拷貝數(shù)類型有三種，拷貝數(shù)增加Gain(n=41)、拷貝數(shù)正常Normal(n=26)和拷貝數(shù)減少Loss(n=1)，三種類型的頻率分別為71.39%，26.32%和1.75%。

2.2 關聯(lián)分析

利用皮爾遜相關分析，進行郟縣紅牛生長性狀與FGF13基因相對拷貝數(shù)之間的關聯(lián)分析。結果表明，F(xiàn)GF13基因的相對拷貝數(shù)與郟縣紅牛的體高、十字部高、胸圍、腹圍和管圍并無顯著的相關性(圖表未列出)，只與體斜長呈顯著的正相關(P<0.05)，如圖2所示，即郟縣紅牛的體斜長隨著FGF13基因拷貝數(shù)的增加而增加。

圖2 FGF13基因相對拷貝數(shù)與郟縣紅牛體斜長的關聯(lián)分析

3 討論

隨著生物學突飛猛進的發(fā)展，分子標記輔助選擇育種技術應運而生，即利用分子標記對動物進行遺傳育種與改良。在我國肉牛的育種工作中，分子標記輔助選擇主要是針對肉牛生長發(fā)育和牛肉品質相關的經濟性狀來開展。多年以來，基于SNPs開展的肉牛分子標記選擇育種工作已取得了很多成績，而近十年，隨著CNV的發(fā)現(xiàn)，越來越多的學者開始關注其作為分子標記應用于肉牛育種工作的研究。不同于SNPs，CNV具有更廣的遺傳效應，它可通過劑量效應、位置效應、基因功能阻斷或融合等諸多機制對基因的表達與功能進行調節(jié)，進而影響動物表型。Seroussi等發(fā)現(xiàn)，牛CNV區(qū)域456與牛肉的蛋白含量和脂肪含量緊密相關[9]，Liu等和Zhang等發(fā)現(xiàn)眾多CNV位點與牛體重和大理石花紋性狀相關的數(shù)量性狀位點重疊[2,10]。Xu等發(fā)現(xiàn)牛MICAL-L2基因的拷貝數(shù)變異可通過劑量效應影響基因的表達，進而與中國黃牛的生長性狀顯著相關[11]。類似的，本文發(fā)現(xiàn)的拷貝數(shù)變異位點與郟縣紅牛的體尺性狀顯著相關，可作為郟縣紅牛選擇育種的分子標記之一。

FGF13基因是重要的生長因子之一，在哺乳動物的多個組織中表達，在胚胎神經組織中高表達[12]。小鼠腿肌中FGF13基因的表達量顯著高于眼外肌[13]。Lu等在小鼠成肌細胞中，研究發(fā)現(xiàn)FGF13基因可抑制成肌細胞分化[14]，進而影響肌肉的生長發(fā)育，由此可見，F(xiàn)GF13基因與機體的生長發(fā)育息息相關。眾多研究表明，肌肉生長發(fā)育相關基因的序列上的分子標記，包括SNPs和CNV，均可作為肉牛生長性狀選育的分子標記，如MYF5基因、LEPR基因和MICAL-L2基因等[11,15-16]。因此，本研究發(fā)現(xiàn)的FGF13基因上的遺傳變異位點可作為生長發(fā)育相關的分子標記，應用于肉牛的遺傳改良當中。

綜上所述，本研究利用qPCR技術，在郟縣紅牛群體中檢測FGF13基因的CNV，關聯(lián)分析結果表明，該位點是與郟縣紅牛的生長性狀顯著相關的分子標記。本研究為加快郟縣紅牛的遺傳改良和促進中國肉牛業(yè)發(fā)展提供了理論依據(jù)。