劉 潮 唐利洲 韓利紅

(曲靖師范學(xué)院生物資源與食品工程學(xué)院 云南省高校云貴高原動(dòng)植物多樣性及生態(tài)適應(yīng)性進(jìn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 云南省高校特色果酒技術(shù)創(chuàng)新與應(yīng)用工程研究中心 曲靖 655011)

四川山胡椒(Linderasetchuenensis)為樟科(Lauraceae)山胡椒屬(Lindera)常綠灌木，多生于山坡路旁及疏林中，分布于我國(guó)四川、貴州等地(http:∥www.iplant.cn/frps)。四川山胡椒葉片提取物香精油對(duì)金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、白色念珠菌(Candidaalbicans)和大腸桿菌(Escherichiacoli)均具有明顯的抑制作用(Weietal.， 2016)，其葉片中提取的多種化合物具有抗腫瘤活性(袁娟娟， 2018； 張嘉穗， 2016)。

葉綠體是質(zhì)體的一種，為綠色植物光合作用的場(chǎng)所，具有相對(duì)獨(dú)立的遺傳系統(tǒng)。陸生植物葉綠體基因組大小范圍為107～218 kb，具有高度保守的四分體結(jié)構(gòu)，包括2個(gè)反向重復(fù)區(qū)(inverted repeats，IR)，以及被IR分隔的大單拷貝區(qū)(large single copy，LSC)和小單拷貝區(qū)(small single copy，SSC)(Danielletal.， 2016)。葉綠體基因組編碼120～130個(gè)基因，主要參與光合作用、基因轉(zhuǎn)錄和翻譯(Danielletal.， 2016)。目前多個(gè)山胡椒屬物種葉綠體基因組已被相繼報(bào)道(Songetal.， 2020； Zhaoetal.， 2018； Tianetal.， 2019)。完整的葉綠體基因組序列對(duì)于了解植物相近類群之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和物種進(jìn)化具有重要價(jià)值(Danielletal.， 2016)，基于高通量測(cè)序的系統(tǒng)進(jìn)化基因組學(xué)研究，成為全面理解生物進(jìn)化的重要工具(Songetal.， 2020)。葉綠體基因組數(shù)據(jù)已經(jīng)很好地解決了樟科等多種植物類群的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系(Songetal.， 2017； 2020； Zhaoetal.， 2020； Xieetal.， 2020)。密碼子使用偏性可以反映葉綠體基因組進(jìn)化特征及其影響因素，在基因表達(dá)中起重要作用(Boeletal.， 2016)。葉綠體基因組條形碼可用于品種鑒定和種質(zhì)資源保護(hù)，物種特有的重復(fù)序列可以作為一種潛在的遺傳多樣性標(biāo)記。葉綠體基因組結(jié)構(gòu)特征和進(jìn)化研究，對(duì)于分析物種遺傳背景和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系都具有重要的意義。

四川山胡椒具有重要的潛在藥用價(jià)值，然而關(guān)于四川山胡椒物種遺傳多樣性、進(jìn)化和發(fā)育方面的研究較少，未見(jiàn)葉綠體基因組方面的報(bào)道。本研究首次通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)獲得四川山胡椒葉綠體基因組序列，并對(duì)葉綠體基因組序列重復(fù)、密碼子使用偏性，山胡椒屬物種葉綠體基因組高變區(qū)和進(jìn)化發(fā)育關(guān)系進(jìn)行分析，以期為四川山胡椒的遺傳背景、進(jìn)化發(fā)育和種質(zhì)資源保護(hù)提供借鑒。

1材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 四川山胡椒采自江蘇省南京中山植物園(118°50′3.19″E，32°03′9.67″N)，新鮮葉片置于硅膠中保存。標(biāo)本存放于中國(guó)科學(xué)院西雙版納熱帶植物園(標(biāo)本號(hào)XTBG-BRG-SY36159)。用改良的CTAB法從葉組織中提取四川山胡椒總DNA(Doyleetal.， 1987)，構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)?；贗llumina Genome Analyzer Hiseq 2000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行葉綠體基因組測(cè)序。

1.2 四川山胡椒葉綠體基因組組裝與注釋 使用GetOrganelle軟件(Jinetal.， 2020)組裝獲得完整葉綠體基因組。四川山胡椒完整葉綠體基因組數(shù)據(jù)上傳LCGDB 數(shù)據(jù)庫(kù)(http:∥lcgdb.wordpress.com)，訪問(wèn)號(hào)LAU00108。以山胡椒(Linderaglauca)葉綠體基因組(登錄號(hào)MG581443)為參考，利用GeSeq(https:∥chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/geseq.html)進(jìn)行基因組注釋。利用OGDRAW軟件(https:∥chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/OGDraw.html)繪制葉綠體基因組圖譜(Greineretal.， 2019)。

1.3 四川山胡椒葉綠體密碼子使用偏性分析 利用CodonW 1.4.2軟件分析四川山胡椒葉綠體基因組編碼基因的有效密碼子數(shù)(effective number of codon，ENC)以及鳥嘌呤(guanine)和胞嘧啶(cytosine)含量(GC)，通過(guò)EMBOSS在線網(wǎng)站(http:∥emboss.toulouse.inra.fr/)的cusp軟件分析相對(duì)同義密碼子使用度(relative synonymous codon usage，RSCU)。分別選取ENC值較小和較大的10%基因作為高表達(dá)基因(high expression gene，HEG)和低表達(dá)基因(low expression gene，LEG)，計(jì)算ΔRSCU值(ΔRSCU=RSCU高表達(dá)-RSCU低表達(dá))。密碼子RSCU>1則為高頻密碼子，同時(shí)滿足ΔRSCU≥0.08則為最優(yōu)密碼子。

1.4 四川山胡椒葉綠體序列重復(fù)分析 通過(guò)REPuter軟件(Kurtzetal.， 2001)分析序列重復(fù)，最小重復(fù)長(zhǎng)度為30 bp，序列同源性90%，Hamming距離3，分析了互補(bǔ)(complementary)、正向(forward)、反向(reverse)和回文(palindromic)重復(fù)。利用MISA在線工具檢測(cè)SSR(Beieretal.， 2017)，分析的最小閾值為單核苷酸重復(fù)次數(shù)8，二核苷酸重復(fù)次數(shù)4，三核苷酸重復(fù)次數(shù)4，四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復(fù)次數(shù)均為3。

1.5 山胡椒屬核苷酸多樣性分析 通過(guò)MAFFT v. 7.450(Katohetal.， 2019)對(duì)山胡椒屬物種葉綠體基因組序列進(jìn)行多序列比對(duì)，利用DnaSP 6.0計(jì)算核苷酸多態(tài)性值(Rozasetal.， 2017)，設(shè)置搜索窗口長(zhǎng)度為600 bp，步長(zhǎng)為200 bp，使用R程序繪圖。

1.6 山胡椒屬系統(tǒng)發(fā)育分析 從NCBI和LCGDB數(shù)據(jù)庫(kù)下載30種山胡椒屬和樟屬(Cinnamomum)物種的葉綠體基因組序列，其中三椏烏藥(Linderaobtusiloba，LAU00057)序列由LCGDB數(shù)據(jù)庫(kù)下載，其他物種序列由NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)下載。利用四川山胡椒和28個(gè)山胡椒屬物種的葉綠體基因組序列，以樟(Cinnamomumcamphora)和沉水樟(C.micranthum)為外類群，使用MAFFT v. 7.450進(jìn)行多序列比對(duì)，通過(guò)IQ-TREE v. 2.1.1軟件(Minhetal.， 2020)基于最大似然法(maximum likelihood，ML)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，建樹模型為K3Pu+F+R3，步長(zhǎng)值為1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠體基因組結(jié)構(gòu)特征 四川山胡椒葉綠體基因組全長(zhǎng)為152 851 bp(圖1)，與其他山胡椒屬物種大小相當(dāng)(Tianetal.， 2019； Songetal.， 2020； Zhaoetal.， 2018)，呈典型的四分結(jié)構(gòu)，LSC、SSC和IR區(qū)大小分別為93 742 bp、18 977 bp和20 066 bp?；蚪M總GC含量為39.15%，IR區(qū)GC含量最高(44.42%)，其次為L(zhǎng)SC(37.94%)，SSC最低(33.95%)。四川山胡椒葉綠體基因組共編碼125個(gè)基因，其中蛋白編碼基因81個(gè)，轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)36個(gè)，核糖體RNA(rRNA)8個(gè)，13個(gè)基因?yàn)殡p拷貝基因。

圖1 四川山胡椒葉綠體基因組結(jié)構(gòu)Fig. 1 Complete chloroplast genome map of Lindera setchuenensis

2.2 葉綠體蛋白編碼基因密碼子偏性分析 四川山胡椒葉綠體蛋白編碼基因GC含量為39.13%，鳥嘌呤和胞嘧啶堿基的出現(xiàn)頻率GC3s為27.96%，平均ENC值為49.11。蛋白編碼基因高頻密碼子有31個(gè)(表1)，其中13個(gè)以A結(jié)尾，16個(gè)以U(T)結(jié)尾，以G和C結(jié)尾的分別有1個(gè)。最優(yōu)密碼子有21個(gè)，其中9個(gè)以A結(jié)尾，11個(gè)以U(T)結(jié)尾，1個(gè)以G結(jié)尾。

表1 四川山胡椒葉綠體基因組相對(duì)同義密碼子使用度①Tab.1 Relative synonymous codon usage of genes in the chloroplast genome of Lindera setchuenensis

2.3 葉綠體基因組序列重復(fù)分析 四川山胡椒葉綠體基因組中共檢測(cè)到27對(duì)長(zhǎng)序列重復(fù)(圖2)，長(zhǎng)度30 bp的序列數(shù)目最多，位于IR、LSC和SSC上的數(shù)目分別為8、13和3，其次為33 bp的序列，分別有14和2個(gè)位于IR和LSC上。長(zhǎng)序列重復(fù)中，正向重復(fù)最多，達(dá)24個(gè)(占44%)，其次為回文重復(fù)22個(gè)(占41%)，反向重復(fù)和互補(bǔ)重復(fù)分別為6個(gè)和2個(gè)，其中33 bp和30 bp的序列在正向重復(fù)和回文重復(fù)中均占較高比例，30 bp重復(fù)多數(shù)位于LSC和IR上，33 bp重復(fù)多數(shù)位于IR上。

圖2 四川山胡椒葉綠體基因組序列重復(fù)Fig. 2 Repeats in the chloroplast genome of Lindera setchuenensisLSC、SSC和IR分別表示大單拷貝區(qū)、小單拷貝區(qū)和反向重復(fù)區(qū)，其后數(shù)值表示序列重復(fù)長(zhǎng)度。LSC, SSC and IR represent large single copy, small single copy and inverted repeats, respectively, and the subsequent values represent the sequence repeat length.

四川山胡椒葉綠體基因組中發(fā)現(xiàn)13種類型共181個(gè)SSR位點(diǎn)(圖3)。其中，單堿基SSR數(shù)目最多，占SSR總數(shù)的71.27%，其次為雙堿基SSR，占20.44%。A/T類SSR占單堿基SSR的95.35%，AT/AT類堿基占雙堿基SSR的51.35%(圖3)。55%的SSR位于基因間區(qū)，29%位于編碼序列(coding sequence，CDS)上，15%位于內(nèi)含子區(qū)，僅有1%位于rRNA上(圖4)。

圖3 四川山胡椒葉綠體基因組SSR位點(diǎn)類型及數(shù)量Fig. 3 The types and number of SSRs in the chloroplast genome of Lindera setchuenensis

圖4 四川山胡椒葉綠體基因組SSR 位點(diǎn)分布Fig. 4 The distribution of SSRs in the chloroplast genome of Lindera setchuenensis

2.4 山胡椒屬序列突變熱點(diǎn)分析 序列突變熱點(diǎn)(mutational hotspots)又稱高變區(qū)(hyper-variable regions)，可為設(shè)計(jì)準(zhǔn)確、穩(wěn)定而高效的分子標(biāo)記和物種條形碼提供參考(Niuetal.， 2021)。使用DnaSP 6.0軟件分析了山胡椒屬核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(圖5)，序列比對(duì)總長(zhǎng)度為156 450 bp，序列一致位點(diǎn)長(zhǎng)度為150 149 bp，突變位點(diǎn)數(shù)為4 351，大約2.78%為多態(tài)性位點(diǎn)，核苷酸多樣性值范圍為0～0.019 79，平均值為0.004 08。鑒定的6個(gè)高變區(qū)中，3個(gè)位于LSC區(qū)(petA-psbJ、trnH-psbA、petK-psbI)，3個(gè)位于SSC區(qū)(ycf1、ccsA-ndhD、rpl32-trnL)，IR區(qū)沒(méi)有高變區(qū)，表明單拷貝區(qū)核苷酸多態(tài)性明顯高于IR區(qū)。

圖5 山胡椒屬葉綠體基因組序列核苷酸多態(tài)性分析Fig. 5 The nucleotide diversity(Pi) of chloroplast genome sequence of the genus Lindera

2.5 山胡椒屬系統(tǒng)發(fā)育分析 利用IQtree軟件使用最適模型K3Pu+F+R3構(gòu)建的ML進(jìn)化樹，展示了山胡椒屬物種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系(圖6)。山胡椒屬物種歸為5個(gè)聚類組： 聚類組1成員最多，為11個(gè)，其次是聚類組4，有8個(gè)成員，聚類組2和聚類組5分別有5個(gè)和4個(gè)成員，聚類組3僅有三椏烏藥1種。四川山胡椒與黑殼楠(Linderamegaphylla)、紅脈釣樟(L.rubronervia)、大果山胡椒(L.praecox)、綠葉甘橿(L.neesiana)、絨毛釣樟(L.floribunda)、山橿(L.reflexa)歸在聚類組4，與黑殼楠親緣關(guān)系最近。

圖6 基于最大似然法構(gòu)建的山胡椒屬葉綠體基因組系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 6 The Maximum-likelihood tree of Lindera species based on analyses of the chloroplast genomes

3 討論

植物葉綠體基因組為了解葉綠體功能、細(xì)胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)移、物種多樣性、植物資源保護(hù)和遺傳育種提供分子基礎(chǔ)(Danielletal.， 2016)。本研究對(duì)四川山胡椒葉綠體基因組進(jìn)行測(cè)序、組裝和注釋，獲得了完整的葉綠體基因組數(shù)據(jù)。四川山胡椒葉綠體基因組大小為152 851 bp，具有典型的四分體結(jié)構(gòu)，與之前公布的山胡椒屬物種一致(Zhaoetal.， 2018)。本研究以山胡椒葉綠體基因組(MG581443)為參考，對(duì)四川山胡椒葉綠體基因組進(jìn)行注釋，發(fā)現(xiàn)四川山胡椒基因組共編碼125個(gè)基因，其中單拷貝基因112個(gè)，該結(jié)果與Zhao等(2018)和Tian等(2019)的注釋略有不同，這與基因組注釋時(shí)的參考基因組不同有關(guān)。

密碼子使用偏性是物種對(duì)環(huán)境的長(zhǎng)期適應(yīng)性進(jìn)化的結(jié)果，受多種因素的共同影響(Duanetal.， 2021)。RSCU值反映了不同基因的密碼子使用模式，數(shù)值越高表示該密碼子使用頻率越高(Sharpetal.， 1987)。四川山胡椒葉綠體基因組總GC含量為39.15%，IR區(qū)GC含量明顯高于單拷貝區(qū)，蛋白編碼基因GC含量與葉綠體基因組接近，而GC3s明顯較低(27.96%)，這與山胡椒屬其他物種類似(Zhaoetal.， 2018； Tianetal.， 2019； Xiaoetal.， 2020)。31個(gè)高頻密碼子中以A/U(T)結(jié)尾的占94%，21個(gè)最優(yōu)密碼子中以A/U(T)結(jié)尾的占95%，這與其他植物葉綠體基因組密碼子使用偏性(Duanetal.， 2021)一致，表明葉綠體基因密碼子第3位堿基存在不對(duì)稱性，并表現(xiàn)出對(duì)A/U(T)的偏好性(Duanetal.， 2021； 鄭祎等， 2020； 周曉君等， 2020)。

序列重復(fù)廣泛存在于植物葉綠體基因組中，在基因表達(dá)和調(diào)控中起著重要作用，由于這些區(qū)域存在高度序列多態(tài)性，對(duì)于研究分子進(jìn)化和遺傳多樣性以及開(kāi)發(fā)植物育種所必需的分子標(biāo)記具有重要意義(蔣明等， 2020； Zhengetal.， 2020； Zhuetal.， 2021)。四川山胡椒葉綠體基因組長(zhǎng)序列重復(fù)中，正向重復(fù)和回文重復(fù)含量較高，30 bp序列重復(fù)主要分布在單拷貝區(qū)，33 bp序列重復(fù)主要分布在IR區(qū)。基因組SSR位點(diǎn)含有較高比例的A/T，其中單堿基SSR以A/T型為主，55%的SSR位于基因間區(qū)，與Tian等(2019)結(jié)果類似，SSR較高的A/T含量可能與葉綠體基因組A/T含量較高有關(guān)。豐富的回文序列可能為基因組提供一些二級(jí)結(jié)構(gòu)，而單核苷酸重復(fù)序列可能比其他SSR提供了更多的系統(tǒng)發(fā)育信號(hào)?；蚪M中6個(gè)高變區(qū)均位于單拷貝區(qū)，其中3個(gè)位于LSC，3個(gè)位于SSC，高變區(qū)trnH-psbA、psbK-psbI、petA-psbJ、ccsA-ndhD、ycf1與Zhao等(2018)和Tian等(2019)研究結(jié)果一致，可作為山胡椒屬DNA條形碼用于物種鑒定。所篩選的多態(tài)性SSR和高變區(qū)可為山胡椒屬物種的鑒定和分子標(biāo)記輔助育種提供參考。

山胡椒屬具有重要的經(jīng)濟(jì)和藥用價(jià)值。多個(gè)山胡椒屬物種葉綠體基因組的公布，為山胡椒屬系統(tǒng)發(fā)育研究提供了強(qiáng)有力的數(shù)據(jù)支撐。為了解四川山胡椒與山胡椒屬其他物種之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，本研究基于已公布的葉綠體基因組數(shù)據(jù)構(gòu)建了山胡椒屬物種的系統(tǒng)發(fā)育樹。Zhao等(2018)將山胡椒屬分為2個(gè)或4個(gè)支系，本研究基于進(jìn)化樹支持率將山胡椒屬分為5個(gè)聚類組，四川山胡椒分在聚類組4，與黑殼楠親緣關(guān)系最近，該結(jié)果與Tian等(2019)研究結(jié)果一致。根據(jù)崔鴻賓(1987)基于生物學(xué)性狀的分類，山胡椒屬分為5個(gè)組(Section)，本研究中聚類組1、聚類組2和聚類組3均屬于單系組，其中聚類組1物種屬于三出脈組(LinderaSectionDaphnidium)(除美國(guó)山胡椒未記錄外)，聚類組2屬于長(zhǎng)梗組(LinderaSectionAperula)，聚類組3僅有三椏烏藥一種，屬于掌脈組(LinderaSectionPalminerviae)； 聚類組4為多系組，屬于山胡椒組(LinderaSectionLindera)、三出脈組、球果組(LinderaSectionSphaerocarpae)和杯托組(LinderaSectionCupuliformes)，聚類組5屬于山胡椒組和多蕊組(LinderaSectionPolyadenia)。分析表明，僅基于是否落葉、葉片或頂芽等生物學(xué)特征進(jìn)行的山胡椒屬物種分類具有一定局限性，基于葉綠體基因組的系統(tǒng)發(fā)育分析對(duì)于明確山胡椒屬物種的系統(tǒng)演化具有重要的參考價(jià)值。

4 結(jié)論

本研究基于高通量測(cè)序技術(shù)，從頭測(cè)序并組裝了完整的四川山胡椒葉綠體基因組。該基因組呈典型的四分體結(jié)構(gòu)，基因組全長(zhǎng)為152 851 bp，LSC、SSC和IR區(qū)大小分別為93 742、18 977、20 066 bp。27對(duì)長(zhǎng)序列重復(fù)中，正向重復(fù)最多，其中33 bp和30 bp的序列在正向重復(fù)和回文重復(fù)均占較高比例。181個(gè)SSR位點(diǎn)中，單堿基SSR數(shù)目最多，多數(shù)SSR位于基因間區(qū)。四川山胡椒葉綠體基因組共編碼125個(gè)基因，偏好以A或U(T)結(jié)尾的密碼子。6個(gè)高變區(qū)中，3個(gè)位于LSC區(qū)(petA-psbJ、trnH-psbA、petK-psbI)，3個(gè)位于SSC區(qū)(ycf1、ccsA-ndhD、rpl32-trnL)。系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系上，山胡椒屬物種歸為5個(gè)聚類組，四川山胡椒與黑殼楠親緣關(guān)系最近。