李芹梅,李文祥,曹孟會,劉 松,張?zhí)熘{,汪 瓊,黃美娟,黃海泉
(西南林業(yè)大學園林園藝學院/國家林業(yè)和草原局西南風景園林工程技術研究中心/云南省功能性花卉資源及產業(yè)化技術工程研究中心/西南林業(yè)大學園林園藝花卉研發(fā)中心,云南 昆明 650224)
【研究意義】鳳仙花屬(ImpatiensL.)植物以花色多樣化和具有兩側對稱花為主要特征,被認為是“雙子葉蘭科植物”[1]。滇水金鳳(Impatiens uliginosa)是鳳仙花科的一年生或多年生植物,其花形奇特,花期長,適應性廣,具有很高的觀賞價值[2]。關于滇水金鳳研究主要集中在花色及花發(fā)育調控基因克隆[3-4]、葉綠體全基因組[5]和金屬元素測定[6]等,目前缺少非生物脅迫,尤其是重金屬脅迫下滇水金鳳花色的變化研究。因此,本研究以滇水金鳳為試驗材料,探討不同含量Cu2+對其花色及各生理生化指標的影響,有助于進一步為滇水金鳳的新品種選育提供參考依據?!厩叭搜芯窟M展】花色是觀賞植物重要特征之一[7-8]?;伾怯啥喾N因素共同決定的,如色素種類及含量、液泡pH值、共色素、金屬離子含量等[9-10]。其中花色苷成分和含量是影響花色最重要的因素[11],吳艷梅等[12]認為花色苷成分影響紅色麗格海棠(Rieger Begonia)花色深淺;江潔蓓等[13]認為花色苷含量是影響粉紅珙桐(Davidiainvolucrata)花色關鍵因素。目前金屬離子對花色的影響僅集中在少數金屬對指定植物。如,Ito等[14-15]發(fā)現(xiàn)Al3+、K+、繡球藍復合物和共色素分布在繡球花(Hydrangea macrophylla)萼片組織中從而形成藍色萼片;Takeda等[16]發(fā)現(xiàn)Fe3+、矢車菊素-3-5-葡萄糖苷和黃酮醇絡合為共色復合體形成藍花矢車菊(Centaurea cyanus);Yoshida等[17]研究發(fā)現(xiàn)大綠絨蒿(Meconopsis horridula)的黃酮醇與Fe3+、Mg2+作用導致其花瓣呈藍色;李榮華[18]發(fā)現(xiàn)紅色新幾內亞鳳仙花(Impatiens hawkeri)花色受Cu2+、Al3+影響發(fā)生了改變。此外,基礎代謝物含量對花色影響也引起了研究者們關注,植物體內重要基礎代謝物是可溶性蛋白、脯氨酸和作為花色苷合成的前體和信號物質的糖,這些物質含量變化均會影響花瓣呈色[13,19]?!颈狙芯壳腥朦c】課題組前期對銅脅迫下滇水金鳳的生理響應和富集特征研究發(fā)現(xiàn),不同含量Cu2+處理下滇水金鳳花色發(fā)生明顯改變,肉眼觀測到花色隨Cu2+含量增加花色逐漸變淡,但其花色變化的影響途徑有待深入探討。【擬解決的關鍵問題】測定在不同含量Cu2+處理下滇水金鳳盛花期花瓣色度值、細胞液pH值、色素和基礎代謝物含量,分析Cu2+、各生理生化指標與花色之間的關系,為金屬離子調控花色提供一定理論數據和參考依據。
滇水金鳳的種子采自云南省昆明市撈魚河濕地公園(E102°46′02″,N24°49′34″),供試重金屬為CuSO4·5H2O,處理液均用去離子水進行配置。試驗采用水培法,于2020年9~12月進行。在西南林業(yè)大學樹木園進行播種、育苗,挑選性狀一致、生長健壯的滇水金鳳植株,株高約30 cm,用去離子水將根部土壤沖洗干凈后移入水培箱(4 L)水培一周,再用 1/2 改良Hoagland(不含CuSO4)馴化一周開始試驗處理?;谡n題組前期研究共設置5個銅(Cu2+)濃度梯度:0(CK)、5、10、15、20 mg·L-1,每個處理5個重復,每重復10株,每3 d更換一次營養(yǎng)液,以此保證銅濃度。在銅(Cu2+)處理30 d后,采集盛花期花瓣開展后續(xù)相關試驗。
參考陳小紅[20]的方法測定花瓣明度L*、色相a*值和b*值、彩度C*和色相角h(°);細胞液pH值測定參考Grlesbach[21]的方法;花色苷(Anthocyanin content)、總黃酮(Flavonoid content)和類胡蘿卜素(Carotenoid content)含量測定參考陳小紅[20]的方法;可溶性糖(Soluble sugar content)、可溶性蛋白(Soluble protein content)和脯氨酸(Proline content)含量測定參考李合生[22]的方法。
采用Excel 2010和SPSS 26.0軟件進行數據分析,采用Origin 2018進行作圖。
從圖1可知,在不同含量Cu2+處理下,滇水金鳳花瓣顏色發(fā)生變化,表現(xiàn)為花色隨Cu2+含量增加逐漸變淡,花瓣色度值也發(fā)生了較大變化(表1)。明度L*在51.60~56.86,色相a*值范圍介于17.60~29.27,色相b*值范圍介于-8.06~-14.73。在Cu2+含量20 mg·L-1時,明度L*、色相a*值和b*值數值均最小,且與其他組比呈顯著差異(P<0.05);彩度C*值逐漸變小,表明彩度變淡,與肉眼觀察結果一致。色相角h變化不明顯,僅在Cu2+含量為10 mg·L-1時急劇增大,其余都在-25°左右。
表1 不同含量Cu2+處理下滇水金鳳花瓣色度值變化Table 1 Flower petal chromaticity of I. uliginosa treated with different concentration of Cu2+
圖1 不同含量Cu2+處理下滇水金鳳花瓣顏色變化Fig. 1 Variation of petal color of I. uliginosa treated with different concentrations of Cu2+
從圖2可知,滇水金鳳花瓣細胞液pH值均為弱酸性,其花瓣細胞液pH值變化分為兩個階段:Cu2+含量為0~5 mg·L-1,pH值升高;Cu2+含量為10~20 mg·L-1,pH值逐漸下降,而花色開始變淡。Cu2+含量為5 mg·L-1和10 mg·L-1時,pH值差異不顯著(P>0.05),據2.1花色測定結果可知,這兩個Cu2+含量下花瓣色相a*值變化不大,以上結果表明細胞液pH值大小可能影響花色苷穩(wěn)定性。
圖2 不同含量Cu2+處理下滇水金鳳花瓣細胞液pH變化Fig. 2 Petal cell fluid pH of I. uliginosa treated with different concentrations of Cu2+
色素是植物呈色的物質基礎,隨Cu2+含量增加,肉眼觀測到花色逐漸變淡。從圖3 -A可以看出,花色苷含量不斷下降,與對照組比,均達顯著性差異(P<0.05);Cu2+含量20 mg·L-1時,花色苷含量最低,比CK少54.7%。總黃酮含量隨Cu2+含量增加總體呈下降趨勢,與對照比,均達顯著性差異(P<0.05);Cu2+含量20 mg·L-1時,總黃酮含量最低,比CK少40.91%(圖3-B)。因此,花色苷和總黃酮含量減少是影響滇水金鳳花色變淡的關鍵因素。隨Cu2+含量增加,類胡蘿卜素含量先下降再升高,在Cu2+含量20 mg·L-1時,類胡蘿卜素含量最高,達0.13 mg·g-1,與其他組差異顯著(P<0.05),表明類胡蘿卜素可能影響滇水金鳳花色變化(圖3-C)。
圖3 不同含量Cu2+處理下滇水金鳳花瓣花色素的變化Fig. 3 Anthocyanidins in petals of I. uliginosa treated with different concentrations of Cu2+
糖作為花色苷合成的前體和信號物質,對花色形成有重要影響??扇苄蕴呛侩SCu2+含量增加而下降,與對照比,均存顯著性差異(P<0.05);Cu2+含量20 mg·L-1時,可溶性糖含量最低,比CK少48.5%,說明可溶性糖含量下降,在一定程度上抑制了花色苷的合成(圖4-A)。隨Cu2+含量增加,可溶性蛋白含量先降后升,Cu2+含量20 mg·L-1時,可溶性蛋白含量最高,為7.47 mg·g-1,是CK的2.10倍(圖4-B)。脯氨酸是植物體內滲透調節(jié)物質,Cu2+含量在0~15 mg·L-1時,與對照比,脯氨酸含量無顯著差異(P<0.05);Cu2+含量20 mg·L-1時,脯氨酸含量低至98.42 μg·g-1,與其他組比呈顯著性差異(P<0.05)(圖4-C)。綜上所述,基礎代謝物質含量變化與滇水金鳳花色變化有著密切關系。
圖4 不同含量Cu2+處理下滇水金鳳花瓣基礎代謝物含量的變化Fig. 4 Basal metabolites in petals of I. uliginosa treated with different concentrations of Cu2+
2.5.1 簡單相關分析 由表2可以看出Cu2+、各生理生化指標與花色之間存在著相關性。Cu2+與色相b*值呈極顯著正相關,與色相a*值呈極顯著負相關(P<0.01),與明度L*呈顯著負相關(P<0.05);明度L*與總黃酮、可溶性糖呈顯著正相關,與可溶性蛋白呈顯著負相關(P<0.05)。色相a*值與花色苷、總黃酮、可溶性糖和脯氨酸極顯著正相關,與可溶性蛋白極顯著負相關(P<0.01);色相b*值與可溶性蛋白呈顯著正相關(P<0.05),與花色苷、可溶性糖、脯氨酸極顯著負相關(P<0.01)。Cu2+與可溶性蛋白呈顯著正相關(P<0.05),與花色苷、總黃酮、可溶性糖呈極顯著負相關(P<0.01)??梢?,Cu2+通過影響滇水金鳳色素、基礎代謝物含量來調控花瓣呈色。
2.5.2 逐步回歸分析 在相關性分析中Cu2+、各生理生化指標與花色之間表現(xiàn)出顯著差異性影響因素較多,進一步從各生理生化指標進行逐步回歸分析,分別找到受Cu2+影響最顯著的因子及影響色相a*值、色相b*值最顯著的因子(P<0.05)。逐步回歸方程(表3)表明,Cu2+與可溶性蛋白含量呈顯著正相關,與色相a*值呈顯著負相關(P<0.05),表明Cu2+對色相a*值和可溶性蛋白含量有直接影響。色相a*值與花色苷、脯氨酸呈正相關(P<0.05);色相b*值與可溶性糖呈顯著正相關,與色相a*值呈顯著負相關(P<0.05),表明顯著影響滇水金鳳花瓣呈色因素有花色苷、脯氨酸和可溶性糖含量。
表3 Cu2+、各生理生化指標與花色之間的逐步回歸分析Table 3 Stepwise regression on Cu2+, physiological and biochemical indices, and flower color
為更直觀、準確地研究Cu2+、各生理生化指標與花色之間的相關性,對花色Lab進行測定,可使花色描述由模糊變?yōu)榱炕痆23]。本研究發(fā)現(xiàn)隨Cu2+含量增加滇水金鳳花瓣顏色變淡,相關性分析表明Cu2+與色相b*值呈極顯著正相關,與色相a*值呈極顯著負相關(P<0.01),且逐步回歸分析中發(fā)現(xiàn)Cu2+與色相a*值呈顯著負相關(P<0.05),表明Cu2+是影響色相值的重要因素。
花瓣顏色受細胞液pH值調控,如日本牽牛(Pharbitis nil)在花蕾期紫紅色細胞液pH為6.6,在開花期藍色細胞液pH為7.7[24]。本研究發(fā)現(xiàn)滇水金鳳紫紅色細胞液pH值均為弱酸性,隨Cu2+含量增加,pH值先增后減,與花色苷含量相關性不顯著,表明細胞液pH值變化對花色調節(jié)作用不明顯,與金銀花(Lonicera japonica)[25]研究結果較為一致。
雖然影響花瓣呈色原因眾多,但最主要原因是色素種類在植物細胞中的存在,影響植物花色色素主要有3類:類黃酮化合物、類胡蘿卜素和甜菜色素[16,26]?;ㄉ諏儆陬慄S酮化合物,是影響植物色彩呈現(xiàn)關鍵因素[27],如在臘梅(Chimonanthus praecox)[28]、玉蘭(Magnolia)[29]、麗格海棠[12]等研究中發(fā)現(xiàn)花色苷含量變化是影響植物花瓣呈色的主要因素。本研究發(fā)現(xiàn)隨Cu2+含量增加滇水金鳳花瓣顏色變淡,總黃酮、花色苷、脯氨酸、可溶性糖含量呈下降趨勢,相關性分析表明影響色相a*值、b*值因素有花色苷、總黃酮、可溶性糖、脯氨酸和可溶性蛋白含量,且逐步回歸分析中色相a*值與花色苷、脯氨酸含量呈顯著正相關(P<0.05),色相b*值與可溶性糖呈顯著正相關(P<0.05),表明花色苷、脯氨酸含量是直接影響色相a*值的重要因素,可溶性糖含量是影響色相b*值的重要因素。因此,花色苷和基礎代謝物含量是影響花瓣呈色的關鍵因素。
花色苷是由色素和各種糖自然形成,故其生物合成與糖含量高低有密切關系[9]。本研究發(fā)現(xiàn)隨Cu2+含量增加可溶性糖含量下降,其與花色苷含量極顯著正相關(P<0.01),表明可溶性糖含量的減少抑制了花色苷積累,與江潔蓓[13]、張超[29]研究結果一致。脯氨酸是植物體內滲透調節(jié)物質,逆境脅迫下能調節(jié)植物生長發(fā)育[30],本研究發(fā)現(xiàn)隨Cu2+含量增加脯氨酸含量下降,其與花色苷含量呈顯著正相關(P<0.05),表明脯氨酸含量影響花色苷合成,與珙桐[31]苞片研究一致。不同植物的可溶性蛋白和花色苷含量表現(xiàn)出很大差異性,如紅櫨(Cotinus coggygria‘Royal Purple’)中兩者顯著正相關(P<0.05)[32],矮牽牛(Petunia hybrida)研究表明可溶性蛋白和花色苷含量之間沒有直接關系[33]。本研究發(fā)現(xiàn)隨Cu2+含量增加可溶性蛋白含量明顯上升,其與花色苷含量呈極顯著負相關(P<0.01),表明可溶性蛋白抑制了滇水金鳳花色苷合成,與粉紅珙桐[13]研究結果一致。因此,基礎代謝物含量影響花色苷合成。
不同濃度不同金屬離子對植物的影響是不一樣的[34],如李榮華[18]發(fā)現(xiàn)紅色新幾內亞花色受Cu2+和Al3+濃度影 響,當Cu2+濃度為3.2×10-7mol·L-1時,其花色均最深;隨Al3+濃度增加,其花色先變淺后又逐漸加深;Schreiber等[35]發(fā)現(xiàn)繡球花發(fā)藍所需Al3+閾值為40 μg·g-1,10 μg·g-1Al3+足以讓萼片顏色從紅向紫變化。本研究肉眼觀測到隨Cu2+濃度增加滇水金鳳花色逐漸變淺,當Cu2+含量為20 mg·L-1時,花色最淺。相關性分析表明Cu2+與可溶性蛋白呈顯著正相關(P<0.05),與花色苷、總黃酮、可溶性糖呈極顯著負相關(P<0.01),逐步回歸分析發(fā)現(xiàn)Cu2+與可溶性蛋白含量呈顯著負相關(P<0.05),表明Cu2+含量影響基礎代謝物含量。
綜上所述,花色苷含量是影響滇水金鳳花色變化的主要因素,Cu2+濃度影響控制合成花色苷的基礎代謝物含量,推測Cu2+是通過調控滇水金鳳花色苷的生物合成來影響花瓣呈色。本研究僅分析Cu2+、各生理生化指標與花色之間的關系,今后研究還應從解剖結構、分子遺傳等方面對滇水金鳳花色變化機制進行深入研究。