李芹梅，李文祥，曹孟會(huì)，劉 松，張?zhí)熘{，汪 瓊，黃美娟，黃海泉

（西南林業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院/國(guó)家林業(yè)和草原局西南風(fēng)景園林工程技術(shù)研究中心/云南省功能性花卉資源及產(chǎn)業(yè)化技術(shù)工程研究中心/西南林業(yè)大學(xué)園林園藝花卉研發(fā)中心，云南 昆明 650224）

0 引言

【研究意義】鳳仙花屬（ImpatiensL.）植物以花色多樣化和具有兩側(cè)對(duì)稱花為主要特征，被認(rèn)為是“雙子葉蘭科植物”[1]。滇水金鳳（Impatiens uliginosa）是鳳仙花科的一年生或多年生植物，其花形奇特，花期長(zhǎng)，適應(yīng)性廣，具有很高的觀賞價(jià)值[2]。關(guān)于滇水金鳳研究主要集中在花色及花發(fā)育調(diào)控基因克隆[3-4]、葉綠體全基因組[5]和金屬元素測(cè)定[6]等，目前缺少非生物脅迫，尤其是重金屬脅迫下滇水金鳳花色的變化研究。因此，本研究以滇水金鳳為試驗(yàn)材料，探討不同含量Cu2+對(duì)其花色及各生理生化指標(biāo)的影響，有助于進(jìn)一步為滇水金鳳的新品種選育提供參考依據(jù)。【前人研究進(jìn)展】花色是觀賞植物重要特征之一[7-8]?；伾怯啥喾N因素共同決定的，如色素種類及含量、液泡pH值、共色素、金屬離子含量等[9-10]。其中花色苷成分和含量是影響花色最重要的因素[11]，吳艷梅等[12]認(rèn)為花色苷成分影響紅色麗格海棠（Rieger Begonia）花色深淺；江潔蓓等[13]認(rèn)為花色苷含量是影響粉紅珙桐（Davidiainvolucrata）花色關(guān)鍵因素。目前金屬離子對(duì)花色的影響僅集中在少數(shù)金屬對(duì)指定植物。如，Ito等[14-15]發(fā)現(xiàn)Al3+、K+、繡球藍(lán)復(fù)合物和共色素分布在繡球花（Hydrangea macrophylla）萼片組織中從而形成藍(lán)色萼片；Takeda等[16]發(fā)現(xiàn)Fe3+、矢車菊素-3-5-葡萄糖苷和黃酮醇絡(luò)合為共色復(fù)合體形成藍(lán)花矢車菊（Centaurea cyanus）；Yoshida等[17]研究發(fā)現(xiàn)大綠絨蒿（Meconopsis horridula）的黃酮醇與Fe3+、Mg2+作用導(dǎo)致其花瓣呈藍(lán)色；李榮華[18]發(fā)現(xiàn)紅色新幾內(nèi)亞鳳仙花（Impatiens hawkeri）花色受Cu2+、Al3+影響發(fā)生了改變。此外，基礎(chǔ)代謝物含量對(duì)花色影響也引起了研究者們關(guān)注，植物體內(nèi)重要基礎(chǔ)代謝物是可溶性蛋白、脯氨酸和作為花色苷合成的前體和信號(hào)物質(zhì)的糖，這些物質(zhì)含量變化均會(huì)影響花瓣呈色[13,19]。【本研究切入點(diǎn)】課題組前期對(duì)銅脅迫下滇水金鳳的生理響應(yīng)和富集特征研究發(fā)現(xiàn)，不同含量Cu2+處理下滇水金鳳花色發(fā)生明顯改變，肉眼觀測(cè)到花色隨Cu2+含量增加花色逐漸變淡，但其花色變化的影響途徑有待深入探討。【擬解決的關(guān)鍵問題】測(cè)定在不同含量Cu2+處理下滇水金鳳盛花期花瓣色度值、細(xì)胞液pH值、色素和基礎(chǔ)代謝物含量，分析Cu2+、各生理生化指標(biāo)與花色之間的關(guān)系，為金屬離子調(diào)控花色提供一定理論數(shù)據(jù)和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

滇水金鳳的種子采自云南省昆明市撈魚河濕地公園（E102°46′02″，N24°49′34″），供試重金屬為CuSO4·5H2O，處理液均用去離子水進(jìn)行配置。試驗(yàn)采用水培法，于2020年9～12月進(jìn)行。在西南林業(yè)大學(xué)樹木園進(jìn)行播種、育苗，挑選性狀一致、生長(zhǎng)健壯的滇水金鳳植株，株高約30 cm，用去離子水將根部土壤沖洗干凈后移入水培箱（4 L）水培一周，再用 1/2 改良Hoagland（不含CuSO4）馴化一周開始試驗(yàn)處理。基于課題組前期研究共設(shè)置5個(gè)銅（Cu2+）濃度梯度：0（CK）、5、10、15、20 mg·L-1，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)，每重復(fù)10株，每3 d更換一次營(yíng)養(yǎng)液，以此保證銅濃度。在銅（Cu2+）處理30 d后，采集盛花期花瓣開展后續(xù)相關(guān)試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

參考陳小紅[20]的方法測(cè)定花瓣明度L*、色相a*值和b*值、彩度C*和色相角h（°）；細(xì)胞液pH值測(cè)定參考Grlesbach[21]的方法；花色苷（Anthocyanin content）、總黃酮（Flavonoid content）和類胡蘿卜素（Carotenoid content）含量測(cè)定參考陳小紅[20]的方法；可溶性糖（Soluble sugar content）、可溶性蛋白（Soluble protein content）和脯氨酸（Proline content）含量測(cè)定參考李合生[22]的方法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010和SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Origin 2018進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同含量Cu2+處理下滇水金鳳花瓣色度值變化

從圖1可知，在不同含量Cu2+處理下，滇水金鳳花瓣顏色發(fā)生變化，表現(xiàn)為花色隨Cu2+含量增加逐漸變淡，花瓣色度值也發(fā)生了較大變化（表1）。明度L*在51.60～56.86，色相a*值范圍介于17.60～29.27，色相b*值范圍介于-8.06～-14.73。在Cu2+含量20 mg·L-1時(shí)，明度L*、色相a*值和b*值數(shù)值均最小，且與其他組比呈顯著差異（P＜0.05）；彩度C*值逐漸變小，表明彩度變淡，與肉眼觀察結(jié)果一致。色相角h變化不明顯，僅在Cu2+含量為10 mg·L-1時(shí)急劇增大，其余都在-25°左右。

表1 不同含量Cu2+處理下滇水金鳳花瓣色度值變化Table 1 Flower petal chromaticity of I. uliginosa treated with different concentration of Cu2+

圖1 不同含量Cu2+處理下滇水金鳳花瓣顏色變化Fig. 1 Variation of petal color of I. uliginosa treated with different concentrations of Cu2+

2.2 不同含量Cu2+處理下滇水金鳳花瓣細(xì)胞液pH變化

從圖2可知，滇水金鳳花瓣細(xì)胞液pH值均為弱酸性，其花瓣細(xì)胞液pH值變化分為兩個(gè)階段：Cu2+含量為0～5 mg·L-1，pH值升高；Cu2+含量為10～20 mg·L-1，pH值逐漸下降，而花色開始變淡。Cu2+含量為5 mg·L-1和10 mg·L-1時(shí)，pH值差異不顯著（P＞0.05），據(jù)2.1花色測(cè)定結(jié)果可知，這兩個(gè)Cu2+含量下花瓣色相a*值變化不大，以上結(jié)果表明細(xì)胞液pH值大小可能影響花色苷穩(wěn)定性。

圖2 不同含量Cu2+處理下滇水金鳳花瓣細(xì)胞液pH變化Fig. 2 Petal cell fluid pH of I. uliginosa treated with different concentrations of Cu2+

2.3 不同含量Cu2+處理下滇水金鳳花瓣花色素含量的變化

色素是植物呈色的物質(zhì)基礎(chǔ)，隨Cu2+含量增加，肉眼觀測(cè)到花色逐漸變淡。從圖3 -A可以看出，花色苷含量不斷下降，與對(duì)照組比，均達(dá)顯著性差異（P＜0.05）；Cu2+含量20 mg·L-1時(shí)，花色苷含量最低，比CK少54.7%?？傸S酮含量隨Cu2+含量增加總體呈下降趨勢(shì)，與對(duì)照比，均達(dá)顯著性差異（P＜0.05）；Cu2+含量20 mg·L-1時(shí)，總黃酮含量最低，比CK少40.91%（圖3-B）。因此，花色苷和總黃酮含量減少是影響滇水金鳳花色變淡的關(guān)鍵因素。隨Cu2+含量增加，類胡蘿卜素含量先下降再升高，在Cu2+含量20 mg·L-1時(shí)，類胡蘿卜素含量最高，達(dá)0.13 mg·g-1，與其他組差異顯著（P＜0.05），表明類胡蘿卜素可能影響滇水金鳳花色變化（圖3-C）。

圖3 不同含量Cu2+處理下滇水金鳳花瓣花色素的變化Fig. 3 Anthocyanidins in petals of I. uliginosa treated with different concentrations of Cu2+

2.4 不同含量Cu2+處理下滇水金鳳花瓣基礎(chǔ)代謝物含量的變化

糖作為花色苷合成的前體和信號(hào)物質(zhì)，對(duì)花色形成有重要影響。可溶性糖含量隨Cu2+含量增加而下降，與對(duì)照比，均存顯著性差異（P＜0.05）；Cu2+含量20 mg·L-1時(shí)，可溶性糖含量最低，比CK少48.5%，說明可溶性糖含量下降，在一定程度上抑制了花色苷的合成（圖4-A）。隨Cu2+含量增加，可溶性蛋白含量先降后升，Cu2+含量20 mg·L-1時(shí)，可溶性蛋白含量最高，為7.47 mg·g-1，是CK的2.10倍（圖4-B）。脯氨酸是植物體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，Cu2+含量在0～15 mg·L-1時(shí)，與對(duì)照比，脯氨酸含量無顯著差異（P＜0.05）；Cu2+含量20 mg·L-1時(shí)，脯氨酸含量低至98.42 μg·g-1，與其他組比呈顯著性差異（P＜0.05）（圖4-C）。綜上所述，基礎(chǔ)代謝物質(zhì)含量變化與滇水金鳳花色變化有著密切關(guān)系。

圖4 不同含量Cu2+處理下滇水金鳳花瓣基礎(chǔ)代謝物含量的變化Fig. 4 Basal metabolites in petals of I. uliginosa treated with different concentrations of Cu2+

2.5 Cu2+、各生理生化指標(biāo)與花色之間的關(guān)系

2.5.1 簡(jiǎn)單相關(guān)分析 由表2可以看出Cu2+、各生理生化指標(biāo)與花色之間存在著相關(guān)性。Cu2+與色相b*值呈極顯著正相關(guān)，與色相a*值呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），與明度L*呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；明度L*與總黃酮、可溶性糖呈顯著正相關(guān)，與可溶性蛋白呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。色相a*值與花色苷、總黃酮、可溶性糖和脯氨酸極顯著正相關(guān)，與可溶性蛋白極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）；色相b*值與可溶性蛋白呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與花色苷、可溶性糖、脯氨酸極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。Cu2+與可溶性蛋白呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與花色苷、總黃酮、可溶性糖呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）?？梢?，Cu2+通過影響滇水金鳳色素、基礎(chǔ)代謝物含量來調(diào)控花瓣呈色。

2.5.2 逐步回歸分析 在相關(guān)性分析中Cu2+、各生理生化指標(biāo)與花色之間表現(xiàn)出顯著差異性影響因素較多，進(jìn)一步從各生理生化指標(biāo)進(jìn)行逐步回歸分析，分別找到受Cu2+影響最顯著的因子及影響色相a*值、色相b*值最顯著的因子（P＜0.05）。逐步回歸方程（表3）表明，Cu2+與可溶性蛋白含量呈顯著正相關(guān)，與色相a*值呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），表明Cu2+對(duì)色相a*值和可溶性蛋白含量有直接影響。色相a*值與花色苷、脯氨酸呈正相關(guān)（P＜0.05）；色相b*值與可溶性糖呈顯著正相關(guān)，與色相a*值呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），表明顯著影響滇水金鳳花瓣呈色因素有花色苷、脯氨酸和可溶性糖含量。

表3 Cu2+、各生理生化指標(biāo)與花色之間的逐步回歸分析Table 3 Stepwise regression on Cu2+, physiological and biochemical indices, and flower color

3 討論與結(jié)論

為更直觀、準(zhǔn)確地研究Cu2+、各生理生化指標(biāo)與花色之間的相關(guān)性，對(duì)花色Lab進(jìn)行測(cè)定，可使花色描述由模糊變?yōu)榱炕痆23]。本研究發(fā)現(xiàn)隨Cu2+含量增加滇水金鳳花瓣顏色變淡，相關(guān)性分析表明Cu2+與色相b*值呈極顯著正相關(guān)，與色相a*值呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），且逐步回歸分析中發(fā)現(xiàn)Cu2+與色相a*值呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），表明Cu2+是影響色相值的重要因素。

花瓣顏色受細(xì)胞液pH值調(diào)控，如日本牽牛（Pharbitis nil）在花蕾期紫紅色細(xì)胞液pH為6.6，在開花期藍(lán)色細(xì)胞液pH為7.7[24]。本研究發(fā)現(xiàn)滇水金鳳紫紅色細(xì)胞液pH值均為弱酸性，隨Cu2+含量增加，pH值先增后減，與花色苷含量相關(guān)性不顯著，表明細(xì)胞液pH值變化對(duì)花色調(diào)節(jié)作用不明顯，與金銀花（Lonicera japonica）[25]研究結(jié)果較為一致。

雖然影響花瓣呈色原因眾多，但最主要原因是色素種類在植物細(xì)胞中的存在，影響植物花色色素主要有3類：類黃酮化合物、類胡蘿卜素和甜菜色素[16,26]?；ㄉ諏儆陬慄S酮化合物，是影響植物色彩呈現(xiàn)關(guān)鍵因素[27]，如在臘梅（Chimonanthus praecox）[28]、玉蘭（Magnolia）[29]、麗格海棠[12]等研究中發(fā)現(xiàn)花色苷含量變化是影響植物花瓣呈色的主要因素。本研究發(fā)現(xiàn)隨Cu2+含量增加滇水金鳳花瓣顏色變淡，總黃酮、花色苷、脯氨酸、可溶性糖含量呈下降趨勢(shì)，相關(guān)性分析表明影響色相a*值、b*值因素有花色苷、總黃酮、可溶性糖、脯氨酸和可溶性蛋白含量，且逐步回歸分析中色相a*值與花色苷、脯氨酸含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），色相b*值與可溶性糖呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），表明花色苷、脯氨酸含量是直接影響色相a*值的重要因素，可溶性糖含量是影響色相b*值的重要因素。因此，花色苷和基礎(chǔ)代謝物含量是影響花瓣呈色的關(guān)鍵因素。

花色苷是由色素和各種糖自然形成，故其生物合成與糖含量高低有密切關(guān)系[9]。本研究發(fā)現(xiàn)隨Cu2+含量增加可溶性糖含量下降，其與花色苷含量極顯著正相關(guān)（P＜0.01），表明可溶性糖含量的減少抑制了花色苷積累，與江潔蓓[13]、張超[29]研究結(jié)果一致。脯氨酸是植物體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，逆境脅迫下能調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育[30]，本研究發(fā)現(xiàn)隨Cu2+含量增加脯氨酸含量下降，其與花色苷含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），表明脯氨酸含量影響花色苷合成，與珙桐[31]苞片研究一致。不同植物的可溶性蛋白和花色苷含量表現(xiàn)出很大差異性，如紅櫨（Cotinus coggygria‘Royal Purple’）中兩者顯著正相關(guān)（P＜0.05）[32]，矮牽牛（Petunia hybrida）研究表明可溶性蛋白和花色苷含量之間沒有直接關(guān)系[33]。本研究發(fā)現(xiàn)隨Cu2+含量增加可溶性蛋白含量明顯上升，其與花色苷含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），表明可溶性蛋白抑制了滇水金鳳花色苷合成，與粉紅珙桐[13]研究結(jié)果一致。因此，基礎(chǔ)代謝物含量影響花色苷合成。

不同濃度不同金屬離子對(duì)植物的影響是不一樣的[34]，如李榮華[18]發(fā)現(xiàn)紅色新幾內(nèi)亞花色受Cu2+和Al3+濃度影 響，當(dāng)Cu2+濃度為3.2×10-7mol·L-1時(shí)，其花色均最深；隨Al3+濃度增加，其花色先變淺后又逐漸加深；Schreiber等[35]發(fā)現(xiàn)繡球花發(fā)藍(lán)所需Al3+閾值為40 μg·g-1，10 μg·g-1Al3+足以讓萼片顏色從紅向紫變化。本研究肉眼觀測(cè)到隨Cu2+濃度增加滇水金鳳花色逐漸變淺，當(dāng)Cu2+含量為20 mg·L-1時(shí)，花色最淺。相關(guān)性分析表明Cu2+與可溶性蛋白呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與花色苷、總黃酮、可溶性糖呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），逐步回歸分析發(fā)現(xiàn)Cu2+與可溶性蛋白含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），表明Cu2+含量影響基礎(chǔ)代謝物含量。

綜上所述，花色苷含量是影響滇水金鳳花色變化的主要因素，Cu2+濃度影響控制合成花色苷的基礎(chǔ)代謝物含量，推測(cè)Cu2+是通過調(diào)控滇水金鳳花色苷的生物合成來影響花瓣呈色。本研究?jī)H分析Cu2+、各生理生化指標(biāo)與花色之間的關(guān)系，今后研究還應(yīng)從解剖結(jié)構(gòu)、分子遺傳等方面對(duì)滇水金鳳花色變化機(jī)制進(jìn)行深入研究。