李雪 李俊敏 張雷 李杉

（華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣州 510006）

細胞穿膜肽（cell-penetrating peptides，CPPs）是一類由5-30個氨基酸組成可以穿透生物膜的短肽。CPPs可攜帶各種外源物質(zhì)將其遞送到細胞內(nèi)［1-2］，與其他遞送方式相比，這種有效的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)不受細胞類型的影響，能夠與生物活性蛋白融合表達，具有較低的細胞毒性且在完成外源物質(zhì)的遞送后可降解［3］，近年來，在藥物遞送系統(tǒng)中得到廣泛的應(yīng)用［4］。穿膜肽M918衍生自抑癌蛋白p14ARF，由22個氨基 酸（MVTVLFRRLRLRIRRACGPPRVRV） 組 成，其中含有7個帶正電荷的氨基酸，屬于陽離子CPP。M918在高濃度條件下仍不具有細胞毒性，并且可以有效的將大分子外源物質(zhì)（蛋白質(zhì)和肽核酸）以共價結(jié)合物或非共價復(fù)合物的形式遞送到動植物細胞中［5］。與大多數(shù)CPP相似，M918的穿膜機制主要為能量依賴的內(nèi)吞機制，尤其是巨胞飲作用，不同的是M918的內(nèi)吞不依賴于細胞表面的糖胺聚糖［6］。

近年來，靶向治療受到越來越多的關(guān)注。單鏈抗體（single chain antibody，scFv）分子量低（約28 kD），結(jié)構(gòu)簡單，易于合成，免疫原性低，廣泛的應(yīng)用于靶向遞送載體［7］。然而，由于大多數(shù)抗癌抗體及其衍生物在腫瘤組織中的滲透性較差，其遞送效率受到嚴(yán)重的限制［8］，因此需要尋找一種新的靶向遞送至腫瘤組織的方法。

在本研究中，將穿膜肽M918與靶向人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor-2，HER2）的scFv偶聯(lián)，經(jīng)過純化得到重組蛋白M918-scFv，通過微量熱泳動（microscale thermophoresis，MST）技術(shù)和流式細胞儀檢測M918-scFv與HER2抗原的親和能力及內(nèi)吞效率。旨在探索一種靶向遞送的新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 PET-28b質(zhì)粒由本實驗室保存，PET-28b-scFv-EGFP質(zhì)粒由本實驗室構(gòu)建、保存。穿膜肽M918基因序列由廣州天一輝遠基因科技有限公司合成。分子克隆所用的菌株為大腸桿菌DH5α感受態(tài)（TreliefTM5α Chemically Competent Cell，擎科生物科技有限公司，中國），表達重組蛋白所用的菌株為大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)（BL21（DE3）Chemically Competent Cell，天根生化科技有限公司，中國）。HER2陽性乳腺癌細胞SK-BR-3，BT474及HER2陰性乳腺癌細胞MCF-7購于中科院上海細胞庫。

1.1.2 主要儀器 Fusion Solo S化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Vilber，法國）；BioLogic LP低壓層析儀（BIO-RAD，美 國 ）；T100TMThermal Cycler PCR儀（BIO-RAD，美國）；SK-ⅡD超聲波細胞破碎儀（寧波歐藍，中國）；Accuri C6 plus 分析型流式細胞儀（BD，美國）；MO NT.115相互作用分析儀（Nano Temper，德國）；激光共聚焦顯微鏡（ZEISS，美國）。

1.2 方法

1.2.1 重組PET-28b-M918-scFv-EGFP質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)M918和scFv-EGFP的基因序列，用Premier 5軟件設(shè)計基因擴增所需的引物（表1），由廣州天一輝遠基因科技有限公司合成。利用overlap PCR技術(shù)將基因片段M918與scFv-EGFP連接，以獲得M918-scFv-EGFP基因片段。PCR產(chǎn)物回收后，用限制性核酸內(nèi)切酶Nde Ⅰ和Hind Ⅲ分別雙酶切PET-28b質(zhì)粒和純化回收后的M918-scFv-EGFP基因，酶切產(chǎn)物回收后用T4連接酶進行連接，并將連接產(chǎn)物用化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)中，在卡那霉素抗性（終濃度為50 μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜。挑選陽性轉(zhuǎn)化子用通用引物進行菌落PCR鑒定并送天一輝遠基因公司測序進行更進一步的驗證，保存測序結(jié)果與目的基因比對正確的質(zhì)粒并命名為PET-28b-M918-scFv-EGFP。

表1 擴增M918-scFv基因片段所需引物Table 1 Primers used to amplify M918-scFv

1.2.2 重組蛋白M918-scFv的表達、純化 將上一步中測序結(jié)果正確的PET-28b-M918-scFv-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，并接種于卡那抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 220 r/min培養(yǎng)過夜作為種子液。按1∶100的比例轉(zhuǎn)接種子液并培養(yǎng)至OD600≈1.5，向各組培養(yǎng)液中分別加入終濃度為300、500、800、1 000 μmol/L的異丙基硫代半乳糖苷（Isopropyl β-D-Thiogalactoside，IPTG）誘導(dǎo)蛋白表達，16℃ 130 r/min誘導(dǎo)過夜。比較在IPTG濃度不同時，重組蛋白M918-scFv-EGFP的表達情況，篩選出誘導(dǎo)M918-scFv-EGFP表達的最適IPTG濃度。用篩選出的最適IPTG濃度誘導(dǎo)重組蛋白大量表達，誘導(dǎo)結(jié)束后4℃ 6 700 r/min離心20 min 收集菌體，菌體沉淀可于-20℃保存。

用鎳親和層析純化重組蛋白M918-scFv-EGFP。向收集到的菌體中加入適量的裂解緩沖液（500 mmol/L NaCl，20 mmol/L磷酸鈉，20 mmol/L咪唑和2%（V/V）Tween-20，pH 6.8）充分重懸菌體，冰上超聲破碎菌體（變幅桿Φ6、功率50%，超聲1 s開、1 s關(guān)，40 min）。超聲破碎結(jié)束后，4℃ 6 700 r/min離心30 min收集上清。將上清加載到預(yù)先用結(jié)合緩沖液（500 mmol/L NaCl，20 mmol/L磷酸鈉，20 mmol/L咪唑，pH 6.8）平衡好的Ni-NTA（Cytiva）上，緩慢梯度洗脫（20 mmol/L磷酸鈉，0.5-1 mol/L NaCl，20-500 mmol/L咪唑，pH 6.8）目的蛋白。用SDS-PAGE檢測純化后的蛋白。純化得到的蛋白經(jīng)1×PBS透析和PEG-20000濃縮后，用BSA試劑盒測定蛋白濃度，Western Blot對獲得的蛋白進行進一步的鑒定。

1.2.3 細胞培養(yǎng) SK-BR-3和MCF-7細胞均置于含1%青鏈霉素混合液和10%胎牛血清的DEME高糖培養(yǎng)基中，BT474細胞置于含1%青鏈霉素混合液和10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，在5% CO2，37℃的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞增殖到適宜密度后進行擴大培養(yǎng)并進行試驗。

1.2.4 HER2抗原結(jié)合實驗 用Monolith NT.115儀通過MST技術(shù)評估純化得到的scFv和M918-scFv與HER2抗原的結(jié)合能力。因為重組蛋白本身帶有綠色熒光蛋白，因此儀器可根據(jù)GFP的熒光信號，檢測抗原與重組蛋白scFv、M918-scFv結(jié)合后熱泳信號的變化。用MST緩沖液（20 mmol/L 磷酸鈉，50%（m/V）BSA，0.05%（V/V）Tween-20，pH 7.4） 配置100 nmol/L的scFv和M918-scFv溶液。將HER2抗原從400 nmol/L開始進行半倍稀釋成16個梯度，與等體積的重組蛋白混合均勻并轉(zhuǎn)移至毛細管中。將毛細管置于儀器中，在藍光激發(fā)，LED power 20%的條件下進行測試。

1.2.5 內(nèi)吞效率檢測 用流式細胞儀檢測細胞表面平均熒光強度（mean fluorescence intensity，MFI）。將處于對數(shù)生長期的細胞，以5×105個/mL的密度接種于6孔板中，各接種兩板。37℃ 5% CO2培養(yǎng)24 h。分別向每孔中加入60 μg重組蛋白scFv和M918-scFv，并設(shè)置未加蛋白的孔做空白對照，4℃培養(yǎng)1 h。培養(yǎng)結(jié)束后，用提前預(yù)冷的1×PBS清洗。清洗結(jié)束后，各取一板細胞用流式細胞儀檢測其細胞表明MFI，另一組細胞37℃繼續(xù)培養(yǎng)2 h。培養(yǎng)結(jié)束后，用流式細胞儀檢測其表面MFI，即可根據(jù)公式計算出重組蛋白的內(nèi)吞效率［9］。

內(nèi)吞（%）=（4℃表面總 MFI-37℃表面總MFI）/（4℃表面總 MFI）×100 %

用激光共聚焦顯微鏡觀察M918-scFv的內(nèi)吞。將3種細胞按5×103個/mL的密度接種在激光共聚焦皿中 37℃培養(yǎng) 24 h。加入 500 μL 5 μg/mL 的Hoechst 33342室溫孵育30 min，孵育結(jié)束后用提前預(yù)熱的培養(yǎng)基洗3次。再用過量的scFv和M918-scFv處理細胞，4、37℃孵育結(jié)束后，用激光共聚焦觀察細胞。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 所有數(shù)據(jù)均進行3次獨立重復(fù)實驗，結(jié)果以平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。用軟件GraphPad Prism 7.0分析數(shù)據(jù)，使用軟件中單邊t檢驗，檢驗實驗不同組之間的顯著性差異，其中P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01認為差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PET-28b-M918-scFv-EGFP表達載體的構(gòu)建

通過overlap PCR將穿膜肽M918基因片段與scFv基因片段連接，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1-A所示，目的片段在1 500 bp處，與M918-scFv分子量（約1.58 kb）大小相符，說明目的基因M918-scFv擴增成功。經(jīng)雙酶切、連接、轉(zhuǎn)化后挑選適量個數(shù)的陽性轉(zhuǎn)化子做菌落PCR，以驗證載體構(gòu)建結(jié)果。如圖1-B所示，菌落PCR片段與預(yù)期值相符，測序結(jié)果與目的基因序列一致，說明PET-28b-M918-scFv-EGFP表達載體構(gòu)建成功。

圖1 重組質(zhì)粒PET-28b-M918-scFv-EGFP的構(gòu)建Fig.1 Construction of recombinant plasmid PET-28b-M918-scFv-EGFP

2.2 M918-scFv蛋白的純化

用Western Blot檢測（anti-His tag 抗體）優(yōu)化誘導(dǎo)劑濃度結(jié)果如圖2-A 所示，重組蛋白M918-scFv在上清和沉淀中均有表達，隨著IPTG濃度的增加，目的蛋白的總表達量也會相應(yīng)的提高，但上清中目的蛋白的含量呈先升高后降低的趨勢，當(dāng)IPTG濃度為800 μmol/L時，目的蛋白在上清中的表達量最高。

用篩選出的最適IPTG濃度誘導(dǎo)重組蛋白大量表達，并通過Ni-NTA進行純化。在梯度洗脫過程中，在20% Buffer B洗脫時有目的蛋白（分子量約為57 kD）被洗脫下來，40% Buffer B洗脫時目的蛋白被大量洗脫，但此時雜蛋白較多。隨著洗脫的繼續(xù)進行，雜蛋白含量逐漸減少，此時目的蛋白純度較高（圖2-B）。

圖2 重組蛋白M918-scFv-EGFP的純化Fig.2 Purification of recombinant protein M918-scFv

將收集的60% Buffer B至100% Buffer B洗脫的重組蛋白，在含20%（V/V）丙三醇的1×PBS中透析24 h，用PEG-20000和超濾管濃縮蛋白，結(jié)果如圖3所示。用BCA試劑盒測定重組蛋白M918-scFv的濃度為537.6 μg/mL；用軟件Image J進行灰度值分析，蛋白純度為90.5%，符合后續(xù)生物學(xué)活性驗證標(biāo)準(zhǔn)。

圖3 Western Blot鑒定純化后的重組蛋白M918-scFFig.3 Identification of the purified recombinant protein M918-scFv by Western Blot

2.3 scFv、M918-scFv與HER2抗原的相互作用

scFv和M918-scFv與HER2抗原的結(jié)合解離常數(shù)Kd擬合曲線如圖所示4，HER2抗原與scFv、M918-scFv的 Kd值 分 別 為（8.26±2.51）×10-9mol/L和（8.41±1.58）×10-9mol/L，且信噪比均大于5。scFv和CPP-scFv的Kd值都在10-9這一數(shù)量級，說明M918-scFv偶聯(lián)穿膜肽后并不會影響scFv與Her2抗原的結(jié)合，M918-scFv保留了scFv特異性靶向HER2的能力。

圖4 scFv（A）和M918-scFv（B）與HER2抗原的結(jié)合曲線Fig 4 Binding curve of scFv（A）and M918-scFv（B）to HER2 antigen

2.4 scFv、M918-scFv的內(nèi)吞效率

用流式細胞儀定量計算重組蛋白的內(nèi)吞效率，在4℃條件下培養(yǎng)細胞，細胞處于禁止外源物質(zhì)內(nèi)化進入狀態(tài)，重組蛋白附著在細胞表面，而當(dāng)在37℃條件培養(yǎng)細胞時，細胞處于允許外源物質(zhì)內(nèi)化進入細胞狀態(tài)，重組蛋白可通過抗原抗體相互作用和穿膜肽的穿膜特性進入細胞內(nèi)。因此細胞表面結(jié)合重組蛋白的內(nèi)吞效率可通過37℃樣品相對于4℃對照樣品的MFI降低水平得到［10］。實驗結(jié)果如圖5所示，HER2陽性細胞與重組蛋白scFv、M918-scFv經(jīng)過4℃孵育，再轉(zhuǎn)移至37℃培養(yǎng)后，細胞表面的MFI均有一定程度的降低（圖5-A、B），其中M918-scFv的效果更顯著，在SK-BR-3和BT474中其內(nèi)吞效率分別是scFv的1.8倍和1.5倍（圖5-D）。而在HER2陰性細胞MCF-7中，由于細胞表面缺少HER2抗原，因此重組蛋白scFv、M918-scFv處理后細胞表面的MFI沒有明顯的變化。說明scFv、M918-scFv都是通過HER2特異性結(jié)合來結(jié)合細胞的，且通過偶聯(lián)穿膜肽可以提高scFv的內(nèi)吞。

圖5 流式細胞儀檢測scFv、M918-scFv在不同細胞系中的內(nèi)吞效率Fig.5 Uptake studies of scFv and M918-scFv into different cell lines detected by flow cytometry

激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果與流式細胞儀檢測結(jié)果相同。如圖6所示，在HER2陽性細胞SKBR-3和BT474中，4℃孵育后，重組蛋白在細胞周圍有明顯的聚集；37℃孵育后，觀察到明顯的內(nèi)吞，重組蛋白均勻的分布在細胞質(zhì)中。在MCF-7細胞中，則觀察不到重組蛋白的聚集。

圖6 激光共聚焦顯微鏡觀察scFv、M918-scFv在SKBR-3（A）、BT474（B）、MCF-7（C）中的內(nèi)吞Fig.6 Uptake studies of scFv，M918-scFv into SK-BR-3（A），BT474（B） and MCF-7（C）cells observed by confocal laser scanning microscopy

3 討論

CPPs自發(fā)現(xiàn)以來，就在藥物遞送領(lǐng)域得到了廣泛的關(guān)注和應(yīng)用。然而CPPs不受細胞類型的影響，未經(jīng)修飾的CPP作為藥物遞送載體存在靶向性差，靶細胞攝取率低等問題，單憑CPPs無法使藥物定向蓄積，使作用于靶細胞或靶組織的藥物濃度減少，對正常組織損傷較大，限制了其作為藥物載體的應(yīng)用［11-12］?？贵w能特異性識別腫瘤細胞靶分子，可將一定量的抑癌藥物富集到腫瘤組織中，具有特異性高、性質(zhì)均一及針對特定靶點定向制備等優(yōu)點。由于單克隆抗體本身存在著篩選周期長，篩選效率低等問題，使其成為治療的瓶頸［13］。scFv和傳統(tǒng)的抗體相比具有顯著的優(yōu)勢，即保持了原抗體的結(jié)合位點，又降低了一般異源性抗體的免疫反應(yīng)，易于進行分子改造等優(yōu)點［14］。

為此本研究利用抗體的靶向性及CPP的穿膜性能，使用基因工程手段將穿膜肽M918與靶向HER2的scFv偶聯(lián)，構(gòu)建了原核表達質(zhì)粒。scFv是由全抗的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)組成的，不含F(xiàn)c段。在蛋白表達過程中很容易形成“包涵體”沉淀表達［15］。低溫誘導(dǎo)可降低目的蛋白的合成速率，從而增加目的蛋白的可溶性。誘導(dǎo)劑IPTG的濃度也會影響目的蛋白的溶解性。因此通過實驗優(yōu)化了融合蛋白上清表達的最適IPTG濃度，使重組蛋白主要在上清中表達并純化了重組蛋白M918-scFv，獲得的蛋白濃度及純度均符合生物學(xué)驗證標(biāo)準(zhǔn)。

MST實驗結(jié)果表明穿膜肽與scFv偶聯(lián)，不會影響抗體與抗原的相互作用。流式細胞儀及激光共聚焦實驗結(jié)果表明偶聯(lián)M918后，重組蛋白仍通過HER2特異性結(jié)合來結(jié)合細胞使重組蛋白M918-scFv獲得了scFv的靶向性，解決了穿膜肽靶向性差的問題。同時在穿膜肽M918的作用下，提高了scFv在HER2陽性細胞中的內(nèi)吞效率，重組蛋白M918-scFv兼具了穿膜肽的穿膜效率。與許多傳統(tǒng)的穿膜肽相比，M918含有7個帶正電的氨基酸，同時具有很低的兩親性，內(nèi)吞不依賴于細胞表面的糖胺聚糖，因此更容易內(nèi)化到細胞內(nèi)，并且M918在遞送蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)時表現(xiàn)出最佳的傳遞特性［16］。因此融合蛋白M918-scFv表現(xiàn)出良好的內(nèi)吞效率。

4 結(jié)論

本研究將穿膜肽M918與靶向HER2的scFv偶聯(lián)，成功的表達并純化出重組蛋白M918-scFv。與單獨的scFv相比，重組蛋白M918-scFv不僅表現(xiàn)出M918肽的穿膜特性，內(nèi)吞效率顯著提高，同時還保留了scFv的靶向性，重組蛋白能夠靶向遞送至HER2陽性乳腺癌細胞中。