楊悅 陶妍 謝晶 錢韻芳

（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306）

溶菌酶是抗菌肽的一種類型，它存在于絕大多數(shù)生物的機體中，在內(nèi)源性免疫系統(tǒng)中具有非常重要的作用。根據(jù)溶菌酶的氨基酸序列、化學(xué)性質(zhì)和生物學(xué)活性，可以將動物界的溶菌酶劃分為3種：C型溶菌酶（chicken-type）、G型溶菌酶（goose-type）和I型溶菌酶（invertebrate-type）［1］；其中C型溶菌酶的分布最為廣泛，它不僅存在于哺乳動物和禽類等溫血動物中，也存在于魚類和貝類冷血動物中［2］。迄今為止，最典型的C型溶菌酶是母雞的雞蛋清溶菌酶（hen egg white lysozyme，HEWL）；對于它的結(jié)構(gòu)分析表明它含有兩個結(jié)構(gòu)域，Glu35和Asp52兩個高度保守的殘基形成了它的活性位點［3］。由于HEWL能夠裂解細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖的N-乙酰胞壁酸與N-乙酰氨基葡萄糖之間的β-1，4糖苷鍵，它對革蘭氏陽性細(xì)菌的抗菌作用已在許多報道中得到了證實，是食品工業(yè)中目前唯一被允許使用的溶菌酶［4-5］。與HEWL相比，水產(chǎn)生物來源C型溶菌酶的表達(dá)則極其受水域環(huán)境中病原微生物的影響。有研究表明：當(dāng)斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）處于溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）污染的環(huán)境中24 h，其頭腎中C型溶菌酶基因的轉(zhuǎn)錄水平增高4.6倍［6］；哲羅魚（Hucho taimen）在含有魯氏耶爾森氏菌（Yersinia ruckeri）的水域環(huán)境中生活24 h后，其肝臟中C型溶菌酶基因的mRNA水平是對照組的7.2倍［7］；馬尼拉蛤仔（Venerupis philippinarum）在被鰻弧菌（Vibrio anguillarum）侵染12 h后，其體內(nèi)的兩種C型溶菌酶mRNA的表達(dá)均顯著上調(diào)［8］。由此可以確認(rèn)C型溶菌酶在魚貝等水產(chǎn)生物抵御病原微生物侵染的過程中發(fā)揮了重要的作用，也因此具有成為水產(chǎn)養(yǎng)殖綠色飼料添加劑或天然抗菌劑的開發(fā)利用價值。

目前已有不少利用重組DNA技術(shù)制備水產(chǎn)生物C型溶菌酶的研究報道。有學(xué)者在大腸桿菌（Escherichia coli）中表達(dá)了日本對蝦（Marsupenaeus japonicus）的重組C型溶菌酶，但是重組蛋白存在于包涵體沉淀中，必須對其進(jìn)行純化復(fù)性處理，才顯示抗革蘭氏陰性細(xì)菌的活性［9］；此外，來源于奧利亞羅非魚（Oreochromis aureus）的C型溶菌酶也在大腸桿菌中被成功表達(dá)，重組蛋白也是以包涵體形式存在，需要對其進(jìn)行變性溶解和透析復(fù)性，才具有溶菌活性［10］。由此可見，大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)具有一定的局限性，它無法對多肽鏈進(jìn)行翻譯后的加工，大多數(shù)情況下表達(dá)產(chǎn)物為不溶性且無活性的包涵體［11］。相比之下，在畢赤酵母細(xì)胞中表達(dá)的重組蛋白可以實現(xiàn)多肽鏈的正確折疊以及翻譯后的其他必要修飾，并將表達(dá)產(chǎn)物分泌至胞外而便于純化，因此被認(rèn)為是首選的基因工程菌［12］。近幾年來，我們一直致力于基于畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的魚貝類重組抗菌肽的生物合成，已經(jīng)成功實現(xiàn)斑點叉尾鮰（Ictaluru punctatus）、三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）和鯉魚（Cyprinus carpio）C型溶菌酶在畢赤酵母中的重組DNA表達(dá)［13-15］，3種重組C型溶菌酶均顯示了良好的抗菌活性。

草魚（Ctenopharyngodon idella）是我國淡水魚養(yǎng)殖中的四大家魚之一，也是其中個體最大的魚種。由于近年來對水產(chǎn)動物蛋白質(zhì)的需求量不斷增長，草魚的養(yǎng)殖規(guī)模也逐年增大，在2017年其養(yǎng)殖量就占淡水養(yǎng)殖產(chǎn)品的18.40%［16］；這種高密度養(yǎng)殖必然為病原微生物的交叉感染提供了適宜的環(huán)境，但近年來的草魚產(chǎn)量仍居高不下，2019年的數(shù)據(jù)顯示其養(yǎng)殖量仍占18.36%［17］；其原因除了廣泛使用抗生素外，主要歸咎于草魚自身擁有超強的抵御病原微生物侵染的能力，而這種能力得益于其自身完善的免疫系統(tǒng)。已有研究表明：在草魚的多個免疫器官中均有C型溶菌酶的表達(dá)，且這種表達(dá)會明顯受到環(huán)境病原微生物刺激的影響。例如：當(dāng)草魚被嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）感染72 h后，在其鰓部中C型溶菌酶基因的轉(zhuǎn)錄水平是對照組的5.4倍［18］；當(dāng)草魚被維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）感染12 h后，其肝臟和脾臟中的C型溶菌酶基因的轉(zhuǎn)錄水平分別提高7.5倍和27倍［19］。因此，可以確定C型溶菌酶在草魚內(nèi)源性免疫機制中的作用舉足輕重，它具有成為水產(chǎn)養(yǎng)殖綠色飼料添加劑或天然抗菌劑的應(yīng)用前景。據(jù)此，本研究擬通過構(gòu)建重組畢赤酵母菌株實現(xiàn)草魚C型溶菌酶的生物合成，并對重組菌株產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)及生物學(xué)活性進(jìn)行考察，旨在為魚類來源C型溶菌酶的大規(guī)模制備奠定良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物、菌株和載體 鮮活草魚來源于上海市古棕路農(nóng)貿(mào)市場；大腸桿菌DH5α：天根生物科技有限公司（北京）；pMD19-T simple克隆載體：TaKaRa公司（日本）；畢赤酵母X-33和表達(dá)載體pPICZαA：Invitrogen公司（美國）；用于抑菌試驗的細(xì)菌：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，ATCC 6538）、 枯 草 芽 孢 桿 菌（Bacillus subtilis，ATCC 6633）、 單 增 李 斯 特 菌（Listeria monocytogenes，ATCC 19115）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus，ATCC 14579）、 沙 門 氏 菌（Salmonella，ATCC 14028）、 銅 綠 假 單 胞 菌（Pseudomonas aeruginosa，ATCC 27853）、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，ATCC 17802）、大腸桿菌（Escherichia coli，ATCC 10305）。

1.1.2 主要試劑和設(shè)備 RNA提取試劑盒RNAiso Plus、Taq DNA 聚合酶、T4 DNA 連接酶和限制性內(nèi) 切 酶（Sac I、Xho I和 Xba I）：TaKaRa公 司 ；FastKing第一鏈cDNA合成試劑盒、DNA割膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、酵母 DNA 提取試劑盒、BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒和DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)：天根生物科技有限公司；超低蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)和彩虹預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)：中科瑞泰生物科技有限公司（北京）；Western blot試劑盒：康為世紀(jì)生物科技有限公司（北京）；用于培養(yǎng)細(xì)菌和畢赤酵母的所有培養(yǎng)基配方（LB、YPD、MM、MD、BMG、BMM）見畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)手冊（Invitrogen公司）。PCR儀、Gene Pulser XcellTM電穿孔系統(tǒng)、聚丙烯酰氨凝膠電泳儀和ProfiniaTM蛋白質(zhì)純化儀：BIO-RAD公司（美國）；切向回流超濾器：賽多利斯公司（德國）。PCR引物的合成：上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的RT-PCR克隆及其相關(guān)位點的添加 取草魚頭腎，使用“RNAiso Plus試劑盒”提取其總RNA；使用“FastKing第一鏈cDNA合成試劑盒”合成第一鏈cDNA。PCR引物的設(shè)計參考已有的草魚C型溶菌酶的基因序列（GenBank No. EU835654）（表1）。第一次PCR為擴增草魚C型溶菌酶的全長cDNA，反應(yīng)體系：第一鏈cDNA 0.2 μL、引物CF 和 CR（10 μmol/L） 各 0.8 μL、10×Taq Buffer 2 μL、dNTP（2.5 μmol/L each）1.6 μL、Taq DNA 聚合酶（2.5 U/μL）0.2 μL，總 20 μL ；反應(yīng)條件 ：94℃3 min ；94℃ 40 s，56.2℃ 30 s，72℃ 1 min（30 個循環(huán)）；72℃ 5 min。第二次PCR為將6×His標(biāo)簽和Xba I位點及終止密碼子分別添加在5′端和3′端，反應(yīng)體系和條件：模板為第一次PCR產(chǎn)物、引物為CP1和CP2，退火溫度為55.9℃，其他同第一次PCR。第三次PCR為將Xho I位點和Kex 2信號肽酶切割位點添加在5′端，反應(yīng)體系和條件：模板為第二次PCR產(chǎn)物、引物為CP3和CP2，退火溫度為55.8℃，其他同第一次PCR；此次PCR擴增的產(chǎn)物即目的基因“Cilyc”。將“Cilyc”插入“pMD19-T”克隆載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α細(xì)胞，經(jīng)37℃培養(yǎng)后挑選陽性克隆交由上海生工生物工程有限公司做DNA測序。使用ExPASy軟件（http：//web.expasy.org/compute.pi/）預(yù)測重組Cilyc的分子量；使用SWISS MODEL建模服務(wù)器（https：//swissmodel.expasy.org/）和PyMOL軟件對重組Cilyc的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.2 重組畢赤酵母菌株X-33/pPICZαA-CilyC的構(gòu)建及篩選 對重組克隆質(zhì)?！皃MD-19T-CilyC”和表達(dá)載體“pPICZαA”同時進(jìn)行Xho I和Xba I雙酶切后，將片段“CilyC”與 pPICZαA按3∶7（V/V）混合，于16℃經(jīng)T4DNA連接酶作用1 h；此混合液與大腸桿菌DH5α細(xì)胞經(jīng)熱激處理后于37℃培養(yǎng)至菌落產(chǎn)生，再通過PCR、Xho I和Xba I雙酶切及DNA測序驗證重組表達(dá)載體“pPICZαA- CilyC”。

pPICZαA-CilyC經(jīng)Sac I酶切后與畢赤酵母X-33感受態(tài)細(xì)胞按1∶8（V/V）混合，于電轉(zhuǎn)杯中在如下條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)：2 000 V、25 μF、200 Ω、電擊5 ms；加入1 mL山梨醇（1 mol/L）靜置2 h后再加入1 mL YPD培養(yǎng)基，于搖床中培養(yǎng)1.5 h（29℃、250 r/min）；培養(yǎng)液離心后將其菌體涂于YPD平板上（含100 μg/mL博來霉素），29℃培養(yǎng)48 h。另外，同上構(gòu)建重組菌株“X-33/pPICZαA”作為陰性對照。從YPD平板上挑選優(yōu)勢菌株分別接種于MD、MM和含1 000 μg/mL博來霉素的YPD平板上，于29℃培養(yǎng)48 h后進(jìn)一步篩選優(yōu)勢菌株（含高拷貝目的基因、甲醇利用快速型），并對其進(jìn)行基因組DNA的PCR鑒定，以驗證重組菌株“X-33/pPICZαA-CilyC”，引物為 3′AOX1 和 5′AOX1（表 1）。

1.2.3 重組蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)及其純化鑒定 將入選重組菌株先接種于5 mL YPD培養(yǎng)基中，于搖床（29℃、250 r/min）培養(yǎng)18 h后從中取500 μL轉(zhuǎn)接于50 mL BMG培養(yǎng)基中，在同樣條件下再培養(yǎng)24 h；取培養(yǎng)液離心后的菌體重新懸浮于50 mL BMM培養(yǎng)基中，于搖床（29℃、250 r/min）培養(yǎng)24 h后加入1%甲醇開始重組蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)；同時，以重組菌株“X-33/pPICZαA”作為陰性對照同上進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。對搖床培養(yǎng)96 h后的培養(yǎng)液進(jìn)行離心（4℃、12 000 r/min、10 min），其上清用于Tricine-SDS-PAGE分析（5%濃縮膠、18%分離膠、0.1 mol/L Tricine、0.1%SDS）。在以上預(yù)表達(dá)的基礎(chǔ)上，挑選一個重組菌株進(jìn)行進(jìn)一步的甲醇濃度（0、0.5、1、1.5、2、2.5、3%）和表達(dá)時間（0、24、48、72、96、120 h）的優(yōu)化試驗。使用BCA試劑盒和Excel 2018分別測定蛋白質(zhì)濃度和進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

在確定最佳表達(dá)條件后，對該重組菌株進(jìn)行1 L的發(fā)酵培養(yǎng)；使用切向回流超濾器對培養(yǎng)液上清進(jìn)行濃縮后，通過ProfiniaTM蛋白質(zhì)純化儀對其進(jìn)行鎳離子親和層析的純化。純化產(chǎn)物用于Western blot分析：將純化產(chǎn)物電轉(zhuǎn)至PVDF膜上后，按試劑盒說明書依次添加一抗（鼠單克隆抗體）和二抗（山羊抗小鼠lgG）；經(jīng)洗膜后使用HRP-DAB試劑盒進(jìn)行顯色。另一方面，將純化產(chǎn)物交由上海中科新生命生物科技有限公司進(jìn)行LC-MS/MS質(zhì)譜分析。

1.2.4 重組蛋白質(zhì)的抑菌活性測定 將金色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、單增李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌、沙門氏菌、銅綠假單胞菌、副溶血性弧菌和大腸桿菌于37℃培養(yǎng)至OD600=0.5，用LB培養(yǎng)基將其稀釋100倍后分別取1 μL與100 μL的X-33/pPICZαA-CilyC的培養(yǎng)液上清混合，于37℃孵育2 h；從中取30 μL涂于LB平板后再于37℃培養(yǎng)12 h，以考察菌落長勢。同時，將X-33/pPICZαA的培養(yǎng)液上清與細(xì)菌混合作為陰性對照。

另一方面，將上述經(jīng)平板涂布法檢驗后有良好抑菌活性的細(xì)菌于37℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期，再用LB培養(yǎng)基將其稀釋至106CFU/mL；用PBS將純化的重組CilyC配制成40、60、80、120、160、240、320、480、640、960、1 280 μg/mL 的溶液；按 1∶100（V/V）將細(xì)菌懸浮液與重組CilyC溶液混合于96孔板中，于37℃孵育24 h后測定OD600吸光值。另外，用PBS替代重組CilyC溶液作為陰性對照。抑菌率（%）=（陰性對照組吸光值-試驗組吸光值）/（陰性對照組吸光值）×100%；使抑菌率≥95%的重組CilyC濃度被視為最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）［20］。在測定不同濃度 CilyC 的抑制率時，每個濃度均設(shè)置3個重復(fù)，以保證數(shù)據(jù)的可信度。

2 結(jié)果

2.1 目的基因CilyC的擴增結(jié)果及其編碼的CilyC蛋白的三維結(jié)構(gòu)

三次PCR分別擴增得到524、411 和423 bp的cDNA片段，最后一次PCR擴增的片段經(jīng)DNA測序顯示（圖1）：相關(guān)酶切位點、6×His標(biāo)簽和終止密碼子均已正確添加，該片段即為添加了所有必需位點的編碼草魚C型溶菌酶成熟肽（除去信號肽）的目的基因“CilyC”。除去添加的位點或序列，381 bp的cDNA編碼了由127個氨基酸殘基組成的草魚C型溶菌酶成熟肽，內(nèi)含8個保守的半胱氨酸殘基和2個活性位點的殘基。經(jīng) ExPASy 軟件預(yù)測，CilyC蛋白的分子量為14.5 kD。

圖1 目的基因CilyC的核苷酸及其推斷的氨基酸序列Fig. 1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of the target gene CilyC

圖2是通過SWISS MODEL建模服務(wù)器和PyMOL軟件獲得的CilyC蛋白的三維結(jié)構(gòu)，可以發(fā)現(xiàn)：它含有的構(gòu)象元素包括α螺旋、β折疊和無規(guī)卷曲；8個半胱氨酸殘基在形成Cys12-Cys130（綠色）、Cys36-Cys118（黃色）、Cys80-Cys98（紅色）和Cys69-Cys84（藍(lán)色）4對二硫鍵時，每對二硫鍵的2個半胱氨酸殘基在空間上將α螺旋與無規(guī)卷曲締結(jié)在一起，這樣的配對方式使重組CilyC蛋白形成了一個穩(wěn)定的橢球狀空間結(jié)構(gòu)，也更有利于賦予其生物學(xué)功能；另外，Glu41和Asp57兩個殘基在空間上形成了一個明顯的活性位點。

圖2 CilyC蛋白的三維結(jié)構(gòu)Fig.2 Three-dimensional structure of the CilyC protein

2.2 重組畢赤酵母菌株X-33/pPICZαA-CilyC的篩選

使用通用引物 3′AOX1 和 5′AOX1 對 9 株重組大腸桿菌“DH5α/pPICZαA-CilyC”的菌落PCR鑒定發(fā)現(xiàn)：1-4號、7-9號菌株均在900 bp處有明顯條帶（圖3-A），與理論分子量927 bp相符；以2號菌株為代表對其進(jìn)行DNA測序，結(jié)果顯示CilyC插入pPICZαA的正確位點。另一方面，對pPICZαA-CilyC進(jìn)行Xho I 和Xba I雙酶切處理，結(jié)果如圖3-B所示：在略高于400 bp處顯示1個淺條帶，與423 bp的預(yù)期分子量相符，由此判斷重組表達(dá)載體“pPICZαACilyC”已成功構(gòu)建。

圖3 重組表達(dá)載體pPICZαA-CilyC的菌落PCR（A）和雙酶切鑒定（B）Fig. 3 Identification of recombinant expression vector pPICZαA-CilyC by colony PCR（A）and restriction endonuclease digestion（B）

通過MD、MM和含1 000 μg/mL博來霉素的YPD平板篩選到8株優(yōu)勢重組畢赤酵母菌株“X-33/pPICZαA-CilyC”；使用引物 3′AOX1 和 5′AOX1 對它們的基因組DNA進(jìn)行PCR擴增，結(jié)果如圖4所示：2號、4-8號重組菌株均在700-1 000 bp處顯示明顯的擴增條帶，符合預(yù)期分子量927 bp。由此可以確認(rèn)X-33/pPICZαA-CilyC已成功構(gòu)建。

2.3 重組CilyC的誘導(dǎo)表達(dá)及其條件優(yōu)化

選擇圖4中的5、6、8號重組菌株進(jìn)行預(yù)表達(dá)，表達(dá)條件為：29℃、250 r/min、1.0%甲醇、96 h。經(jīng)Tricine-SDS-PAGE分析顯示（圖5）：這3株重組菌株的培養(yǎng)液上清均在略高于14.4 kD處有明顯蛋白質(zhì)條帶，與CilyC的理論分子量14.5 kD相符，但陰性對照X-33/pPICZαA的培養(yǎng)液上清未顯示任何條帶。由此初步推斷，目的蛋白CilyC已成功表達(dá)。

圖4 重組畢赤酵母菌株基因組DNA的PCR鑒定Fig. 4 PCR identification for the genome DNA of recombinant P. pastoris strain

圖5 重組菌株預(yù)表達(dá)產(chǎn)物的Tricine-SDS-PAGE分析Fig. 5 Tricine-SDS-PAGE analysis for pre-expressed products of the recombinant strains

進(jìn)一步選擇8號菌株進(jìn)行甲醇濃度和表達(dá)時間的優(yōu)化，由圖6-A可見：當(dāng)甲醇濃度為1.0%-2.5%時，在略高于14.4 kD處都顯示了較明顯的蛋白質(zhì)條帶，而對應(yīng)總蛋白質(zhì)濃度最高（0.63 mg/mL）的甲醇濃度為1.0%，因此選擇此濃度作為以下實驗的條件。圖6-B顯示了誘導(dǎo)表達(dá)時間對重組蛋白質(zhì)表達(dá)的影響，可以發(fā)現(xiàn)當(dāng)表達(dá)時間為96 h時蛋白質(zhì)條帶最深，對應(yīng)的總蛋白質(zhì)濃度也最高（0.61 mg/mL），而繼續(xù)延長表達(dá)時間并無明顯效果，因此以96 h為最適表達(dá)時間。

圖6 甲醇濃度（A）和表達(dá)時間（B）對重組菌株表達(dá)產(chǎn)物的影響Fig. 6 Effects of methanol concentration（A）and expression time（B）on the expression products of the recombinant strain

2.4 表達(dá)產(chǎn)物的純化及其鑒定

1 L發(fā)酵培養(yǎng)液經(jīng)濃縮后通過鎳離子親和層析獲得純化的蛋白質(zhì)，由Tricine-SDS-PAGE顯示為近15 kD處的單一蛋白質(zhì)條帶（圖7-A），符合重組CilyC的分子量（14.5 kD）；通過測定蛋白質(zhì)濃度后估算其表達(dá)量為13.7 mg/L。由Western blot分析顯示的條帶與電泳條帶一致（圖7-B），由此初步推測該純化蛋白質(zhì)為重組CilyC。進(jìn)一步的LCMS/MS測定捕捉到11個肽段，它們與推斷的相應(yīng)位置的理論氨基酸序列完全一致，其中兩個最長的肽段顯示的分別是N端起45-61位的氨基酸序列（TADVGKDYGIFQINSFK）和72-94位的氨基酸序列（NLCNLPCSDLLKDDLKPSVECAK）（圖 8），由此確定純化蛋白質(zhì)即為預(yù)期的重組CilyC。

圖7 純化蛋白質(zhì)的Tricine-SDS-PAGE（A）和Western blot（B）分析Fig. 7 Tricine-SDS-PAGE（A）and Western blot（B）analysis for the purified protein

圖8 純化蛋白質(zhì)的LC-MS/MS質(zhì)譜分析Fig. 8 LC-MS/MS analysis for the purified protein

2.5 重組CilyC的抑菌活性

X-33/pPICZαA-CilyC的培養(yǎng)液上清與8種細(xì)菌作用后，由平板涂布法結(jié)果顯示（圖9）：其對革蘭氏陽性的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、單增李斯特菌和蠟樣芽孢桿菌以及革蘭氏陰性的沙門氏菌和銅綠假單胞菌具有明顯的抑菌活性；但對于革蘭氏陰性的副溶血性弧菌和大腸桿菌無明顯的抑菌效果。另外，表2顯示了純化的重組CilyC對上述顯示抑菌活性的6種細(xì)菌的最小抑菌濃度（MIC），可以發(fā)現(xiàn)對于金色葡萄球菌的MIC最低（60 μg/mL），對于銅綠假單胞菌的MIC最高（120 μg/mL），對于其他4種細(xì)菌的MIC均為80 μg/mL。

表2 重組CilyC對受試菌株的最小抑菌濃度Table 2 Minimum inhibitory concentration（MIC）of the recombinant CilyC against different test bacteria

圖9 重組菌株培養(yǎng)液上清對革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌的抑菌活性Fig. 9 Antibacterial activities of the recombinant strain culture supernatant against Gram-positive and Gram-negative bacteria

3 討論

本研究通過構(gòu)建重組畢赤酵母菌株X-33/pPICZαA-CilyC，首次實現(xiàn)了基于重組畢赤酵母的草魚C型溶菌酶生物合成。通過PCR擴增到目的基因“CilyC”后，對其編碼的重組CilyC蛋白的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示：一級結(jié)構(gòu)中相距甚遠(yuǎn)的8個半胱氨酸殘基形成的4對二硫鍵將6個α螺旋、3個β折疊和無規(guī)卷曲等二級結(jié)構(gòu)單元締結(jié)在一起，使重組CilyC形成了一個緊密橢球狀的空間結(jié)構(gòu)，這樣穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)確保了其擁有生物學(xué)活性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)；進(jìn)一步的抑菌試驗也證實了這一推論。就實際生產(chǎn)時的成本和操作簡單化而論，不可能對培養(yǎng)液上清進(jìn)行純化處理；則培養(yǎng)液上清是否具有抑菌活性顯得至關(guān)重要。本研究通過平板涂布法證明含重組CilyC的培養(yǎng)液上清對于4種革蘭氏陽性細(xì)菌和兩種革蘭氏陰性細(xì)菌具有明顯的抑菌活性，與基于最小抑菌濃度（MIC）測定法的純化重組CilyC的抑菌試驗結(jié)果是一致的；這就意味著重組菌株 X-33/pPICZαA-CilyC的培養(yǎng)液上清可直接作為生產(chǎn)天然抗菌劑的原液而無需對其進(jìn)行繁瑣的純化處理，符合大規(guī)模生產(chǎn)的需要。上述抑菌效果與我們之前報道的來自三疣梭子蟹和鯉魚的C型溶菌酶的抑菌效果相似［14-15］。而來自雞蛋清的C型溶菌酶僅對革蘭氏陽性細(xì)菌具有強大的抑菌活性，由此可以初步確定水產(chǎn)生物來源的C型溶菌酶具有更為廣泛的抑菌譜。但本研究獲得的重組CilyC對于革蘭氏陰性的副溶血性弧菌和大腸桿菌并未顯示明顯的抑菌活性，曾有學(xué)者報道了大菱鲆（Scophthalmus maximus）C型溶菌酶對革蘭氏陽性細(xì)菌的抑菌活性高于革蘭氏陰性細(xì)菌［3］。以往的研究已經(jīng)明確溶菌酶的作用機理是破壞細(xì)菌細(xì)胞壁中N-乙酰胞壁酸與N-乙酰氨基葡萄糖之間的β-1，4糖苷鍵；而革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖層比革蘭氏陽性細(xì)菌的薄得多，且還被一層外膜包圍［21］，因此可能會阻礙溶菌酶的進(jìn)入。已有研究表明：通過融合蛋白的方法可以改善溶菌酶的體外抗菌活性和抗菌譜，Lu等［22］將人溶菌酶（Hly）與天蠶素（Mdc）在大腸桿菌中進(jìn)行融合表達(dá)，證明重組Hly-Mdc的抑菌譜明顯變廣；Zhao等［23］在畢赤酵母中表達(dá)了人溶菌酶（Hly）與parasin I（從鯰魚皮膚中分離到的一種抗菌肽）的融合蛋白，發(fā)現(xiàn)重組Hly-parasin I彌補了人溶菌酶對大腸桿菌無抑菌活性的缺陷。據(jù)此，后續(xù)研究將致力于構(gòu)建含草魚C型溶菌酶與其他小分子抗菌肽融合表達(dá)載體的重組畢赤酵母菌株。

通常，基于多拷貝表達(dá)菌株的產(chǎn)生是一種提高畢赤酵母產(chǎn)重組蛋白產(chǎn)量的常規(guī)技術(shù)，但在電轉(zhuǎn)過程中產(chǎn)生基因高拷貝數(shù)的頻率較低，因此需要在大量的菌落中篩選基因量高或產(chǎn)物表達(dá)量高的重組菌株［24］。本研究在篩選高拷貝重組畢赤酵母菌株時，用于評估目的基因CilyC高拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)為重組菌株在含1 000 μg/mL博來霉素培養(yǎng)基上的良好生長能力；經(jīng)該標(biāo)準(zhǔn)篩選到的優(yōu)良菌株產(chǎn)重組CilyC的量為13.7 mg/L，較之前基于重組畢赤酵母表達(dá)的斑點叉尾鮰C型溶菌酶的產(chǎn)量高了近5倍［13］。然而，有學(xué)者報道，他們通過使用經(jīng)密碼子優(yōu)化后的人C型溶菌酶6（LYZL6）的cDNA，在30 L發(fā)酵罐中進(jìn)行125 h高密度發(fā)酵，最終重組LYZL6的產(chǎn)量高達(dá)331 mg/L［25］。由此推斷，重組CilyC產(chǎn)量較低的原因之一可能源于目的基因“CilyC”為天然cDNA，經(jīng)Graphical Codon Usage Analyser（http：//www.guca.schoedl.de/）檢測，CilyC中存在7個畢赤酵母的低頻密碼子；另一方面，搖瓶發(fā)酵本身通氧量難以控制、流體狀態(tài)相對較差，這些缺陷也會大大影響發(fā)酵的效果。因此，如何對編碼草魚C型溶菌酶的cDNA進(jìn)行密碼子優(yōu)化，并在本研究的基礎(chǔ)上先通過小型發(fā)酵罐探索大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)的條件也是后續(xù)研究中必需解決的問題。

4 結(jié)論

本研究構(gòu)建了產(chǎn)草魚C型溶菌酶CilyC的重組畢赤酵母菌株X-33/pPICZαA-CilyC，對該菌株的最適誘導(dǎo)表達(dá)條件為：29℃、250 r/min、1.0%甲醇濃度、96 h，在此條件下獲得產(chǎn)量為13.7 mg/L的重組CilyC?；谄桨逋坎挤ê妥钚∫志鷿舛龋∕IC）測定法的抑菌試驗結(jié)果表明：重組CilyC具有明顯的抗革蘭氏陽性的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、單增李斯特菌和蠟樣芽孢桿菌以及革蘭氏陰性的沙門氏菌和銅綠假單胞菌的生物學(xué)活性。