張浩 張亞楠 李鑫 王佳美 王永 朱江江 熊燕林亞秋

（1. 青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用教育部四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041；2. 西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，成都 610041）

肌內(nèi)脂肪（intramuscular fat，IMF）含量是影響肉質(zhì)的重要指標(biāo)，它的提高有助于提高肉的嫩度及多汁性并改善肉質(zhì)及風(fēng)味［1］。脂肪組織是一類結(jié)締組織，包括前體脂肪細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及白細(xì)胞等不同的細(xì)胞類型［2］。而通過(guò)控制脂肪沉積水平進(jìn)一步提升肉質(zhì)水平是改善肉質(zhì)的重要手段，也是當(dāng)前畜牧工作者關(guān)注的熱點(diǎn)。

丙酮酸脫氫酶激酶（pyruvate dehydrogenase kinase，PDKs）是一類三磷酸腺苷酶，通過(guò)編碼具有組氨酸激酶結(jié)構(gòu)域來(lái)抑制丙酮酸脫氫酶復(fù)合體的活性，從而控制丙酮酸脫羧轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶5A［3］。PDKs具有PDK1、2、3和4這4種同工酶［4］，其中PDK4在各種代謝過(guò)程中發(fā)揮重要作用，比如在肝臟中可以通過(guò)PPARα或TR-RXR異二聚化使PDK4表達(dá)上調(diào)，且PPARα激活后存在PDK4的優(yōu)先表達(dá)［5］；人骨骼肌中PDK4在機(jī)體長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)、短期高強(qiáng)度和長(zhǎng)期低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)之后其 mRNA顯著增加［6］，說(shuō)明PDK4影響骨骼肌代謝；同時(shí)PDK4與高血糖、胰島素抵抗、過(guò)敏和癌癥在內(nèi)的代謝疾病有關(guān)［7］。除此之外，PDK4在脂代謝中的作用也有報(bào)道，章琳俐等［8］通過(guò)RNA-seq揭示PDK4是鴨肉風(fēng)味相關(guān)的候選基因，可能調(diào)節(jié)鮮味氨基酸和脂肪酸形成。Yamaguchi等［9］指出PDK4表達(dá)存在晝夜變化，這種變化與血漿游離脂肪酸（FFA）的利用有關(guān)。Newhardt等［10］通過(guò)構(gòu)建心臟糖酵解的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，發(fā)現(xiàn)高脂飲食小鼠的 PDK4表達(dá)升高。潘鵬丞等［11］鑒定PDK4在陸川豬皮下脂肪中高表達(dá)，Zhang等［12］在豬和小鼠肌肉中特異性過(guò)表達(dá)PGC-1α后，PDK4和PPARγ蛋白表達(dá)增加，可能促進(jìn)糖原沉積和脂肪酸氧化。Xu等［13］通過(guò)測(cè)序比較圩豬和約克夏豬背最長(zhǎng)肌中的基因表達(dá)模式，指出PDK4可能對(duì)肌內(nèi)脂肪積聚有影響。以上研究證明PDK4在脂代謝和脂肪沉積方面發(fā)揮作用，但其對(duì)山羊脂肪細(xì)胞脂代謝的影響尚不清楚，且作用機(jī)制尚未探明。

因此本研究在克隆山羊PDK4 基因序列的基礎(chǔ)上，分析其分子特征；使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）繪制PDK4基因在山羊各組織中和肌內(nèi)脂肪細(xì)胞分化時(shí)的表達(dá)圖譜；采用干擾和過(guò)表達(dá)手段探究PDK4對(duì)脂肪細(xì)胞脂代謝的影響，為深入研究該基因調(diào)控山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞脂代謝提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

隨機(jī)選取8頭健康的一周歲簡(jiǎn)州大耳羊公羊（四川簡(jiǎn)陽(yáng)大哥大牧業(yè)有限公司），空腹屠宰后采集樣品：內(nèi)臟（心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟）、皮下脂肪和肌肉（背最長(zhǎng)肌、股二頭肌和臂三頭?。┑葮颖荆肨RIzol法提取各組織中的總RNA，按TIANGEN FastQuant RT Kit（with gDNase）反轉(zhuǎn)錄為cDNA備用。

將本實(shí)驗(yàn)室前期凍存的山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞復(fù)蘇，培養(yǎng)至F3代時(shí)接種于12孔板，待細(xì)胞融合度達(dá)到90%時(shí)加入終濃度為50 μmol/L的油酸的完全培養(yǎng)基誘導(dǎo)細(xì)胞分化，分別收集分化0-7 d的肌內(nèi)脂肪細(xì)胞（n=3），TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA備用。

1.2 方法

1.2.1 山羊PDK4克隆及分子特征分析 使用Primer 5.0 軟件根據(jù) NCBI中牛 PDK4的預(yù)測(cè)序列（NM_001101883.1）設(shè)計(jì)山羊PDK4 的克隆引物。以來(lái)自皮下脂肪組織的cDNA 為模板進(jìn)行擴(kuò)增。按cDNA 1.0 μL，sense/anti-sense primer（10 μmol/L）1.0 μL，2×GC-Rich PCR MasterMix 12.5 μL，ddH2O補(bǔ)齊體系至 25 μL。程序?yàn)椋?4℃ 3 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 2 min，35 個(gè)循環(huán) ；72℃延伸 10 min。從1%瓊脂糖凝膠中回收目的片段，連接至pMD-19T載體后轉(zhuǎn)化至DH5α，挑取陽(yáng)性菌落送擎科生物科技有限公司測(cè)序。

利用生物信息學(xué)軟件對(duì)山羊PDK4的理化性質(zhì)，磷酸化位點(diǎn)，信號(hào)肽及亞細(xì)胞定位，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行分析，具體方法參照文獻(xiàn)［14］。

1.2.2 山羊PDK4過(guò)表達(dá)和干擾細(xì)胞模式的構(gòu)建 將本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建保存山羊HBADE-PDK4-3*flag-GFP過(guò)表達(dá)載體和HBAD-GFP對(duì)照載體滴加入12孔板中感染12 h，然后更換培養(yǎng)基為誘導(dǎo)液，收集誘導(dǎo)分化48 h的脂肪細(xì)胞。接種于12孔板的細(xì)胞待融合度達(dá)到80%-90%每孔加入450 μL Opti-MEM培養(yǎng)液，然后在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h，按每孔 3 μL Lipo3000，2 μL 20 μmol/L siRNA，50 μL Opti-MEM體系配置預(yù)混液，室溫靜置15 min后加入孔中，轉(zhuǎn)染6 h后更換終濃度為50 μmol/L油酸的完全培養(yǎng)液，48 h后收集細(xì)胞。

1.2.3 油紅O染色及OD值檢測(cè) 用于染色的細(xì)胞接種于24孔板，細(xì)胞處理同1.2.2，對(duì)應(yīng)病毒感染用量和干擾轉(zhuǎn)染體系均減半處理，48 h后進(jìn)行油紅O染色及OD值檢測(cè)，PBS洗滌3次后用10%中性甲醛固定30 min，PBS洗凈甲醛后加入配制好的油紅O工作液，染色30 min后PBS洗凈浮色，置于顯微鏡下觀察并拍照。然后每孔加入1 mL異丙醇，溶解染料后轉(zhuǎn)移至96孔板并測(cè)定其吸光度值。

1.2.4 熒光定量PCR 及數(shù)據(jù)分析 利用qPCR檢測(cè)PDK4在山羊各組織中和山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)水平。用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)特異性引物（表1），以TBP（XM_018053502.1）作為內(nèi)參基因，qPCR反應(yīng)體系包括cDNA 1 μL，SYBR?Premix Ex TaqTM（2×）10 μL，10 μmol/L 上、下游引物各 1 μL，RNase Free H2O 7 μL。反應(yīng)條件為 95℃預(yù)變性3 min；95℃變性10 s，59℃退火20 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。利用2-ΔΔCT法分析qPCR結(jié)果，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SEM）”展示，使用SPSS 18.0 軟件并選擇One-way ANOVA方法分析數(shù)據(jù)差異顯著性，mRNA相對(duì)表達(dá)量以Duncan 法進(jìn)行多重比較。當(dāng) P＜0.05 時(shí)，認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。“*”表示差異顯著（P＜0.05），“**”表示差異極顯著（P＜0.01）。

表1 引物信息Table 1 Primer information

2 結(jié)果

2.1 山羊PDK4的生物學(xué)特性

克隆獲得山羊PDK4基因長(zhǎng) 1 808 bp（GenBank登錄號(hào)：MF564045.1），其中CDS區(qū)長(zhǎng)1 224 bp，可編碼407個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白分子質(zhì)量為46.2 ku（圖1-A）。NCBI conserved Domains Batch Search分析發(fā)現(xiàn)PDK4蛋白含有HATPase_PDK-like和BCDHK_Adom3結(jié)構(gòu)域（圖1-B），主要定位在線粒體（47.8%）和細(xì)胞質(zhì)（30.4%），理論等電點(diǎn)6.43，二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)PDK4 蛋白包含52.09%無(wú)規(guī)則卷曲（212個(gè)氨基酸）、31.45% α螺旋（128個(gè)氨基酸）和16.46%延伸鏈（67個(gè)氨基酸）（圖1-C）。STRING數(shù)據(jù)庫(kù)顯示DLAT、PDHA1、PDP2、PDK2、DLD、PDHB 和 PDHA1 等蛋白與PDK4存在相互作用（圖1-D）。

圖1 山羊PDK4序列分析Fig. 1 Sequence analysis of goat PDK4

2.2 同源性分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

山羊PDK4氨基酸序列與綿羊、牛、豬、人、小鼠的同源性均在90%以上（圖2-A），利用MAGE5構(gòu)建PDK4的系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果（圖2-B）顯示山羊與綿羊和牛處于同一分支，親緣關(guān)系最近。

圖2 山羊PDK4同源性分析（A）和進(jìn)化樹（B）Fig. 2 Homology analysis（A）and phylogenetic tree（B）of goat PDK4

2.3 山羊PDK4組織和細(xì)胞表達(dá)模式

qPCR結(jié)果顯示PDK4在山羊肺臟和臂三頭肌的表達(dá)量極顯著高于其他組織（P＜0.01），其次為肝臟，極顯著高于心臟、脾臟、腎臟、瘤胃和皮下脂肪組織（P＜0.01）（圖3-A）。PDK4在山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中表達(dá)呈上升趨勢(shì)，且在第5天時(shí)的表達(dá)量最高，極顯著高于分化前的表達(dá)量（P＜0.05）（圖 3-B）。

圖3 山羊PDK4組織表達(dá)譜（A）和時(shí)序表達(dá)譜（B）Fig. 3 Tissue expression profile（A）and temporal expression profile（B）of goat PDK4

2.4 PDK4對(duì)山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞脂代謝的影響

2.4.1 過(guò)表達(dá)和干擾效率檢測(cè) 分別以不同濃度的山羊PDK4腺病毒過(guò)表達(dá)載體和空白對(duì)照的腺病毒感染山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞，誘導(dǎo)分化48 h后在利用顯微鏡觀察細(xì)胞處于正常狀態(tài)的基礎(chǔ)上，收集細(xì)胞并提取總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，qPCR檢測(cè)其過(guò)表達(dá)效率，結(jié)果（圖4）顯示過(guò)表達(dá)PDK4基因后，與對(duì)照相比，PDK4基因過(guò)表達(dá)效率大約為307.9倍（P＜0.01）。

圖4 PDK4過(guò)表達(dá)（A）和干擾（B）效率Fig. 4 Efficiency of PDK4 overexpression（A）and inter-ference（B）

兩對(duì)siRNA（siPDK4-1和siPDK4-2）轉(zhuǎn)染組與同對(duì)照組相比均極顯著地降低目的基因的表達(dá)，干擾效率分別為56%和67%（P＜0.01）。siPDK4-2的干擾效率高于siPDK4-1的干擾效率，因此本研究后期均以siPDK4-2作為有效干擾片段進(jìn)行研究。

2.4.2 形態(tài)學(xué)觀察 過(guò)表達(dá)PDK4后肌內(nèi)脂肪細(xì)胞中的脂質(zhì)積聚顯著高于陰性對(duì)照組（圖5-A），同時(shí)進(jìn)行OD值檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)OE-PDK4組的OD值顯著高于陰性對(duì)照組（P＜0.05）（圖5-B）。

轉(zhuǎn)染siPDK4-2 48 h后細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生改變，但脂滴聚積明顯減少（圖5-C），干擾后OD值顯著低于對(duì)照組（圖5-D）。

圖5 油紅O染色及OD值Fig. 5 Oil red O staining and OD value

2.4.3 脂代謝相關(guān)基因表達(dá)水平檢測(cè) 過(guò)表達(dá)PDK4后，與對(duì)照相比，OE-PDK4組脂肪酸合成基因ACACA mRNA，脂質(zhì)吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)基因FABP3和CD36、甘油三酯合成基因AGPAT6和ADRP mRNA表達(dá)極顯著上調(diào)（P＜0.01）（圖6-A）。而干擾PDK4后與NC相比，F(xiàn)ABP3、AGPAT6 mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)（P＜0.05），CD36、ACACA、ADRP mRNA 表達(dá)極顯著下調(diào)（P＜0.01）（圖6-B）。

圖6 脂代謝相關(guān)基因表達(dá)水平Fig. 6 Expression levels of lipid metabolism-related genes

3 討論

本研究獲得山羊PDK4 DNA序列1 808 bp，包含編碼407個(gè)氨基酸的CDS區(qū)序列1 224 bp，序列分析顯示，山羊PDK4蛋白共有36個(gè)潛在磷酸化位點(diǎn)和22個(gè)潛在糖基化位點(diǎn)，這可能與蛋白質(zhì)翻譯后修飾有關(guān)［15］，從而激活PDK4的活性發(fā)揮其自身的調(diào)控作用。PDK4蛋白在不同物種間存在差異，而氨基酸序列的差異是否會(huì)導(dǎo)致其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變，引起其功能的變化以及在不同物種間的功能是否有變化仍需進(jìn)一步證明。

PDK4組織表達(dá)譜顯示PDK4在山羊肺臟和臂三頭肌中的相對(duì)表達(dá)水平最高，顯著高于檢測(cè)的其它組織中的表達(dá)，而有研究顯示PDK4在動(dòng)物心臟、氧化型肌肉、肝臟和腎臟等組織中高表達(dá)［16-17］；PDK4在榮昌豬仔豬的多種組織中表達(dá)，且在小腸中高表達(dá)，在腎臟、脾臟和脂肪組織中也存在較高水平的表達(dá)［18］，這與本研究結(jié)果存在差異。楊洋等［19］報(bào)道 PDK4基因在大白豬和從江香豬兩個(gè)品種中的脂肪組織中均存在較高水平的表達(dá)，但在從江香豬的腎臟中表達(dá)水平最高，與本研究結(jié)果類似，也表明PDK4在不同品種中存在差異；張榕婧等［16］研究發(fā)現(xiàn)，PDK4在雞的肌肉組織中表達(dá)量最高，這與上述報(bào)道存在差異，但與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，推測(cè)PDK4在不同物種中具有不同的表達(dá)模式。此外，PDK4在巴馬香豬和杜長(zhǎng)大豬兩個(gè)品種的腹部脂肪組織中表達(dá)量最高，其中杜長(zhǎng)大豬的皮脂、腹脂、肝、脾以及腎中PDK4基因的表達(dá)水平較高［20］；但奚子英等［21］對(duì)肉雞的研究中發(fā)現(xiàn)，PDK4基因在雞的皮脂和腹脂中的表達(dá)水平顯著高于下丘腦和肝臟中的表達(dá)水平?；赑DK4在不同物種脂肪組織中的高表達(dá)，本研究構(gòu)建了山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞時(shí)序表達(dá)譜，顯示PDK4在山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中表達(dá)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，推測(cè)山羊PDK4可能具有促進(jìn)肌內(nèi)脂肪細(xì)胞脂質(zhì)積聚的作用。這與張罕星等［22］報(bào)道相似，PDK4在豬肌內(nèi)和皮下脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中表達(dá)水平均呈逐漸上升的趨勢(shì)，推測(cè)PDK4在脂肪細(xì)胞分化和脂質(zhì)積聚過(guò)程中可能扮演重要角色。Schafer等［23］發(fā)現(xiàn)高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠中CoA（CoASH）促進(jìn)PDK4的降解，充當(dāng)將PDK4降解速率與心臟中的脂肪酸利用率相關(guān)聯(lián)的代謝傳感器，間接指出PDK4在脂代謝中的調(diào)控作用。因此，為了明確PDK4是否調(diào)控山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞脂代謝，本研究后續(xù)采用干擾及過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行闡明。

研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)PDK4促進(jìn)了肌內(nèi)脂肪細(xì)胞脂質(zhì)的積聚，而干擾山羊PDK4抑制了肌內(nèi)脂肪細(xì)胞脂滴的積聚，但脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志基因沒有發(fā)生改變（數(shù)據(jù)未展示），這與Sarsenbayeva等［24］的報(bào)道相類似，Sarsenbayeva等發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)線粒體功能的PGC1α、PDK4和CPT1B基因受藥物作用表達(dá)降低，可影響人皮下脂肪組織的脂代謝，卻對(duì)脂肪因子Leptin和AdipoQ的表達(dá)無(wú)影響，對(duì)PPARγ也無(wú)影響?；诖耍覀兛紤]PDK4是否通過(guò)調(diào)控脂代謝相關(guān)基因表達(dá)變化來(lái)完成促進(jìn)脂滴積聚的作用，因此檢測(cè)了脂代謝相關(guān)基因FABP3、CD36、AGPAT6、ADRP和ACACA表達(dá)水平的變化。FABP3是脂肪酸結(jié)合蛋白家族（FABPs）成員之一，主要通過(guò)促進(jìn)甘油三酯沉積影響脂質(zhì)代謝［25-26］，抑制FABP3基因后明顯抑制葡萄糖氧化從而促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)甘油三酯合成［27］，另外FABP3可協(xié)同ACSL2基因?qū)㈤L(zhǎng)鏈脂肪酸酯化形成甘油三酯［28］。CD36可作為脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)組織細(xì)胞對(duì)脂肪酸的攝取，參與脂肪酸代謝［29］。磷酸甘油?；D(zhuǎn)移酶6（1-acylglycerol-3-phosphate O-acyltransferase6，AGPAT6）來(lái)自 AGPAT家族，在多種哺乳動(dòng)物中參與甘油三酯和三?；视蜕锖铣桑?0］。AGPAT6基因缺失小鼠的遺傳性肥胖的幾率降低［31-34］。ADRP基因可促進(jìn)脂肪細(xì)胞脂肪的合成［35-36］。結(jié)果發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)山羊PDK4可使脂代謝相關(guān)基因FABP3、CD36、ACACA、AGPAT6和ADRP mRNA表達(dá)發(fā)生變化，其隨著PDK4基因的上調(diào)而呈顯著增高。干擾PDK4后FABP3、AGPAT6、ADRP和CD36基因的表達(dá)呈現(xiàn)相反的表化，推測(cè)PDK4可能通過(guò)調(diào)節(jié)FABP3、AGPAT6、ADRP、ACACA和CD36基因表達(dá)促進(jìn)山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞脂代謝。但是PDK4調(diào)控山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞脂代謝的具體分子機(jī)理仍不清楚，需要進(jìn)一步的研究來(lái)闡明。

4 結(jié)論

山羊PDK4基因在山羊各組織及肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分化各個(gè)階段均有表達(dá)；過(guò)表達(dá)后促進(jìn)了脂肪細(xì)胞脂滴積聚，甘油三酯合成和脂質(zhì)沉積相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，而干擾后呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)和表達(dá)，表明PDK4切實(shí)影響山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞的脂質(zhì)沉積。