梁旺旺 李成龍 陳文智 豐志華 蔡少麗 陳騏

（福建省天然免疫生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 福建師范大學(xué)南方生物醫(yī)學(xué)研究中心，福州 350117）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）感染家豬及野豬引起的一種急性、出血性、烈性傳染?。?］。該病于1921年在肯尼亞首次報(bào)道，迄今已成為全球性豬養(yǎng)殖業(yè)難題，其致死率約為100%［2］。2018年8月，我國(guó)遼寧省沈陽(yáng)市出現(xiàn)首例國(guó)內(nèi)非洲豬瘟病例，至今疫情已擴(kuò)散至全國(guó)［3］。

ASFV為雙鏈DNA病毒，病毒顆粒直徑約200 nm，具有多層結(jié)構(gòu)，由類核、核殼、內(nèi)包膜、衣殼和宿主衍生的外包膜組成［4］。根據(jù)毒株的不同，基因組大小介于170-190 kb之間，含約150個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORFs），至少可編碼54個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和100多個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白［5］。ASFV CD2v與宿主的CD2結(jié)構(gòu)與功能類似，主要參與ASFV的免疫逃逸，以及感染細(xì)胞后對(duì)紅細(xì)胞的吸附［6］。在弱毒活疫苗研發(fā)過(guò)程中CD2v通常被刪除，研究表明缺失CD2v后的毒株接種家豬后無(wú)明顯臨床感染癥狀，可以保護(hù)強(qiáng)毒攻擊［7］。與CD2v不同，P12位于外囊膜及內(nèi)囊膜上，目前P12被認(rèn)為是ASFV與宿主細(xì)胞結(jié)合的配體，用重組P12蛋白孵育細(xì)胞后體外感染被阻斷，且針對(duì)P12的抗體被證明阻礙了病毒與宿主細(xì)胞的結(jié)合，但并不能完全抑制病毒結(jié)合或中和病毒感染，因此它不是導(dǎo)致病毒對(duì)細(xì)胞結(jié)合的唯一配體［8］。CD2v與P12通常被用作DNA疫苗、亞單位疫苗和病毒載體疫苗的研發(fā)，研究表明將CD2v與P12蛋白通過(guò)哺乳動(dòng)物細(xì)胞和桿狀病毒載體表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)后制成亞單位疫苗，或?qū)D2v與P12制成DNA疫苗或病毒載體疫苗對(duì)豬進(jìn)行接種，可檢測(cè)到體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)［9-11］。但目前并無(wú)商業(yè)化疫苗用于預(yù)防ASF，其疫苗的研發(fā)需要更多的探索。

偽狂犬病也稱奧耶斯基氏?。ˋujeszky’s disease），由偽狂犬病毒感染引起，給世界豬養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。偽狂犬病毒（PRV）屬于皰疹病毒科，α皰疹病毒亞科水痘病毒屬［12］。其基因組為約145 kb的雙鏈DNA，呈現(xiàn)圓形的完整病毒顆粒直徑在150-180 nm之間，核衣殼直徑約為110 nm［13］。其基因組中含有大量復(fù)制非必須基因，如TK、gI與gE等，這些基因通?？杀煌庠椿蛉〈?，從而構(gòu)建活病毒載體疫苗［14-15］。該研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)成功構(gòu)建了TK及gI缺失且重組表達(dá)ASFV CD2v與P12的重組弱毒株P(guān)RV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v），我們對(duì)該重組毒株遺傳穩(wěn)定性及安全性進(jìn)行了評(píng)估，為將來(lái)研發(fā)預(yù)防非洲豬瘟及偽狂犬多價(jià)疫苗提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒細(xì)胞毒株動(dòng)物 pX459質(zhì)粒購(gòu)自Addgene，大腸桿菌（E. coli Trans 5α）購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；PRV-Fa經(jīng)典病毒株由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供；同源重組質(zhì)粒pcDNA3.1-PRV-TKCD2v與pcDNA3.1-PRV-gI-P12由武漢金開(kāi)瑞生物工程有限公司合成；人胚腎上皮細(xì)胞（HEK293T）與非洲綠猴腎上皮細(xì)胞（Vero）均購(gòu)自ATCC（American Type Culture Collection）；ICR（Institute of Cancer Research）小鼠購(gòu)自吳氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物貿(mào)易有限公司。

1.1.2 主要試劑與儀器 2 × Phanta Max Master Mix聚合酶購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；Lipofectamiane 2000 轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Life Techology；鼠源His（組氨酸）單克隆抗體與鼠源FLAG單克隆抗體購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；羊抗鼠IgG購(gòu)自英國(guó)Abcam；800 CW donkey anti-mouse Ab購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；Gbico胎牛血清購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；Opti MEM 培養(yǎng)基購(gòu)自Life Techology。

所用的儀器包括PCR儀 2720型（美國(guó)ABI公司）；NanoDrop 微量分光光度計(jì)（賽默飛世爾科技公司）；Bio-Red凝膠成像系統(tǒng)（伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司）；雙色紅外激光成像儀（美國(guó)LI-COR公司）；槽式蛋白轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)Hoefer公司）；激光共聚焦顯微鏡（德國(guó)蔡司公司）。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 通過(guò)https：//zlab.bio/guidedesign-resources網(wǎng)站設(shè)計(jì)針對(duì)PRV病毒TK及gI基因的sgRNA序列（見(jiàn)表1），由浙江尚亞生物合成。

表1 靶向CD2v與p12基因的sgRNA序列Table 1 sgRNA sequences targetting CD2v and p12 gene

1.2.2 表達(dá)非洲豬瘟病毒CD2v和P12的重組偽狂犬病毒的構(gòu)建

1.2.2.1 敲除載體的構(gòu)建 將sgRNA退火，把退火產(chǎn)物與BpiI酶切后的pX459質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，提取質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增，獲得敲除載體。

1.2.2.2 重組載體pcDNA3.1-PRV-TK-CD2v與pc-DNA3.1-PRV-gI-p12的合成 從NCBI獲取CD2v基因與p12基因序列，在CD2v基因序列前分別加入 EF1α（elongation actor 1 alpha） 啟 動(dòng) 子，CMV（Cytomegalovirus）增強(qiáng)子，CMV啟動(dòng)子和綠色熒光蛋白（EGFP）序列；在p12基因序列前分別加入EF1α啟動(dòng)子，CMV增強(qiáng)子，CMV啟動(dòng)子和能表達(dá)紅色的mCherry蛋白序列，并通過(guò)武漢金開(kāi)瑞生物工程有限公司分別合成在pcDNA3.1質(zhì)粒上，酶切位點(diǎn)分別為EcoR V，BamH I；EcoR V，Hind III。

1.2.2.3 重組病毒 PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）的構(gòu)建 分別以pcDNA3.1-PRV-TK-CD2v 與pcDNA3.1-PRV-gI-p12為模板通過(guò)PCR分別克隆出包含同源臂的EGFP-CD2v與mCherry-P12的基因片段；將純化后的片段與敲除載體共轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞并接種PRV，待細(xì)胞病變至80%時(shí)，收獲細(xì)胞與上清，放置4℃待用。在Vero細(xì)胞中通過(guò)噬斑篩選獲得F0代重組病毒，經(jīng)過(guò)4輪噬斑篩選，最終在Vero細(xì)胞中擴(kuò)增并純化出陽(yáng)性率為100% 的PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）重組病毒株。圖1為重組病毒PRVΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）構(gòu)建示意圖。

Fig.1 重組毒株P(guān)RV-△gI-（p12）-△TK-（CD2v）構(gòu)建示意圖Fig.1 Schematic diagram of constructing recombinant strain（PRV-△ gI-（p12）-△ TK-（CD2v））

1.2.3 重 組 毒 株 PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v） 的Western blot和熒光鑒定

1.2.3.1 重 組 毒 株 PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）的Western blot分析鑒定 在1×106個(gè)Vero細(xì)胞中接種1×103TCID50重組病毒，共培養(yǎng)36 h后提取總蛋白，用1 mL磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）清洗殘余的培養(yǎng)基，加入80 μL蛋白質(zhì)裂解液，用無(wú)菌細(xì)胞刮刀將細(xì)胞從培養(yǎng)皿中刮下，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管，冰浴15 min，14 000 r/min離心10 min，吸取上清，取1 μL上清用于蛋白質(zhì)濃度測(cè)定，剩余上清與5×SDS Loading Buffer混合，98℃變性5 min；進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%BSA室溫封閉2 h，TBST清洗3次后與鼠源His單克隆抗體和鼠源flag單克隆抗體分別4℃孵育8 h，TBST清洗3次后孵育二抗，TBST清洗3次后掃膜鑒定。

1.2.3.2 重 組 病 毒 PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）的熒光鑒定 共聚焦皿中加入2×105個(gè)Vero細(xì)胞，并接種1×103TCID50的重組病毒；共培養(yǎng)36 h后在共聚焦顯微鏡下觀察熒光。

1.2.4 重組病毒 PRV-ΔgI-（p12）- ΔTK-（CD2v）生物學(xué)特性分析

1.2.4.1 重組病毒 PRV-ΔgI-（p12）- ΔTK-（CD2v）的遺傳穩(wěn)定性測(cè)定 將重組病毒在Vero細(xì)胞上增殖30代，分別取10、20和30代細(xì)胞培養(yǎng)液上清，提取基因組，并用驗(yàn)證引物擴(kuò)增，判斷CD2v和P12能否在重組病毒中穩(wěn)定存在。

1.2.4.2 重 組 病 毒 PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）一步生長(zhǎng)曲線測(cè)定 將重組病毒與野生型PRV病毒各取1×103TCID50分別接種至1×106個(gè)Vero細(xì)胞，分別在接種后12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h收獲培養(yǎng)上清及細(xì)胞并進(jìn)行滴度測(cè)定。將收獲的病毒液按10倍梯度稀釋（10-1-10-7）并接種至1×106個(gè)Vero細(xì)胞中，共培養(yǎng)48 h后用4%的多聚甲醛固定細(xì)胞，用結(jié)晶紫染色統(tǒng)計(jì)噬斑并計(jì)算滴度繪制一步生長(zhǎng)曲線。

1.2.5 重組毒株 PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）的安全性驗(yàn)證

1.2.5.1 重 組 毒 株 PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）的生存曲線測(cè)定 30只ICR小鼠分成3組，每組各10只。在適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，第1組在小鼠右后腿肌肉注射100 μL的生理鹽水，第2組在小鼠右后腿肌肉注射100 μL滴度為1×105TCID50的重組病毒PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v），第 3 組在小鼠右后腿肌肉注射100 μL滴度為1×105TCID50的野生型病毒PRV-Fa，連續(xù)觀察15 d后繪制生存曲線。

1.2.5.2 蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining） 用4%多聚甲醛固定小鼠組織12 h，用30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇、95%乙醇和無(wú)水乙醇各處理30 min，后用乙醇和二甲苯1∶1混合透明處理，用二甲苯代替組織中的乙醇。組織用石蠟和二甲苯1∶1混合處理，然后植入石蠟中。將組織切成7 μm薄片，HE染色，后用顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-PRV-TK-CD2V和pcDNA3.1-PRV-gI-P12的PCR鑒定及EGFPCD2V與mCherry-P12基因片段的純化

以重組質(zhì)粒為模板，使用表2中的引物3.1-P12與3.1-CD2V進(jìn)行PCR擴(kuò)增并純化得到片段，其結(jié)果與目的基因大小相符，如圖2-A所示。

2.2 重組病毒PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）的PCR鑒定

分別以野生型病毒PRV-Fa和重組病毒PRVΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）的基因組為模板，用表2中的引物PRV-TK和PRV-gI進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果與片段大小相符，如圖2-B所示；針對(duì)重組病毒的左右同源臂設(shè)計(jì)引物，分別以野生型病毒PRV-Fa和重組病毒 PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）的基因組為模板用表2中的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序，判斷插入位點(diǎn)，如圖2-C-D所示。結(jié)果表明，CD2v與p12的片段均已插入到PRV的基因組中。

圖2 同源重組片段制備及重組位點(diǎn)驗(yàn)證Fig.2 Preparation of homologous recombinant fragment and verification of recombination sites

表2 PCR擴(kuò)增引物與驗(yàn)證引物Table 2 PCR primers for amplification and verfication

2.3 重組病毒PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）遺傳穩(wěn)定性測(cè)定

將重組病毒 PRV-ΔTK-（CD2v）-ΔgI-（p12）接種在Vero細(xì)胞中傳30代，取第10、20、30代細(xì)胞培養(yǎng)上清，富集病毒并提取基因組。用驗(yàn)證引物擴(kuò)增CD2v與p12，結(jié)果顯示均能擴(kuò)增出目的基因，表明p12與CD2v基因能夠穩(wěn)定存在于重組毒株基因組中（圖3-A）。

2.4 重組病毒PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）western blot鑒定

在感染了重組毒株P(guān)RV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）的Vero細(xì)胞中CD2v與P12均有表達(dá)，而感染PRVFa的Vero細(xì)胞中未檢測(cè)到CD2v與P12條帶。并且我們發(fā)現(xiàn)感染 PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）中CD2v有3條帶，分別為26 kD C端截短形式；45 kD非糖基化全長(zhǎng)形式；89 kD 糖基化全長(zhǎng)形式存在，如圖3-B。這些結(jié)果說(shuō)明CD2v與P12穩(wěn)定表達(dá)的同時(shí)，ASFV的入侵對(duì)于CD2v的糖基化是非必須的。

2.5 重組病毒PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）的熒光鑒定

將野生型病毒PRV-Fa與重組病毒PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）分別接種到Vero細(xì)胞中，培養(yǎng)24 h，通過(guò)熒光共聚焦顯微鏡檢測(cè)，研究發(fā)現(xiàn)接種野生型PRV-FA的Vero細(xì)胞無(wú)任何熒光，而接種重 組 病 毒 PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v） 的 Vero細(xì)胞中有綠色和紅色熒光如圖3-C。

圖3 遺傳穩(wěn)定性鑒定Fig.3 Identification of genetic stability

2.6 重組毒株P(guān)RV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）一步生長(zhǎng)曲線測(cè)定

用 Vero細(xì)胞測(cè)試了 PRV-Fa 與 PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）一次性增殖曲線，如圖4-E所示，重組 病 毒 PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v） 在 Vero 細(xì)胞中增殖能力明顯弱于強(qiáng)毒株P(guān)RV-Fa。

2.7 重組病毒PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）的安全性評(píng)估

為了評(píng)估重組病毒PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）的生物安全性，我們用PRV-Fa與PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）兩株病毒對(duì)小鼠進(jìn)行接種，如圖4-F所示，接種 PRV-Fa 組小鼠在接種第4天全部死亡，而接種 PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）組小鼠觀察至15 d未見(jiàn)死亡。此外，我們還觀察到接種PRVFa組小鼠第3天開(kāi)始出現(xiàn)嚴(yán)重的瘙癢，而在小鼠右后腿肌肉注射接種接種PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）組小鼠未見(jiàn)瘙癢癥狀，表明重組毒株安全性良好，對(duì)小鼠不具致死能力。

圖4 重組病毒一步生長(zhǎng)曲線與小鼠生存曲線Fig.4 One-step growth curve of recombinant viruses and mice’s survival curve

2.8 小鼠病理學(xué)評(píng)估

將接種PRV-Fa與PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）兩株病毒的小鼠與空白小鼠器官進(jìn)行HE染色，HE染色顯示小鼠的心臟、肝臟和腎臟無(wú)明顯變化，如圖5-A、B和5-E所示。感染PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）小鼠脾臟組織淋巴細(xì)胞增殖明顯，而PRVFa組與空白組無(wú)明顯差異，如圖5-C。PRV-Fa可導(dǎo)致肺部腫大與誘導(dǎo)腦內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，而對(duì)其他兩組感染組則無(wú)明顯影響，如圖5-D和5-F。以上結(jié)果表明，PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）的毒力與PRV-Fa相比毒力減弱，同時(shí)也可以能激活免疫應(yīng)答，引起免疫細(xì)胞增殖。

圖5 小鼠組織病理學(xué)切片F(xiàn)ig.5 Histopathological sections of mice tissues

3 討論

非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒感染引起的一種急性、出血性、烈性傳染病。該病是我國(guó)重點(diǎn)防范的一類動(dòng)物疫病［1］。2018年8月，遼寧省沈陽(yáng)市出現(xiàn)首例國(guó)內(nèi)非洲豬瘟病例，至今疫情已擴(kuò)散至全國(guó)［3］。我國(guó)為豬養(yǎng)殖與消費(fèi)大國(guó)，豬出欄量、存欄量以及豬肉的消費(fèi)量均位于全球首位，每年種豬及豬肉制品進(jìn)口總量巨大，與多個(gè)國(guó)家貿(mào)易頻繁，ASF帶來(lái)的直接以及間接損失不可估量。

目前，針對(duì)非洲豬瘟疫苗制備已進(jìn)行了多方面的嘗試，如構(gòu)建了滅活苗、減毒活疫苗、亞單位疫苗、病毒活載體疫苗與DNA疫苗等，但均未商業(yè)化［16］。其中利用天然分離或敲除毒力基因的ASFV弱毒和減毒活疫苗的免疫原性較好，研究進(jìn)度較為樂(lè)觀，但弱活疫苗安全性一直飽受詬病，需要綜合評(píng)價(jià)毒株的不良反應(yīng)與持續(xù)性感染等安全風(fēng)險(xiǎn)，并且需要大量的臨床實(shí)驗(yàn)［17］?；蚬こ桃呙?、ASFV亞單位疫苗、核酸疫苗，在安全性、鑒別診斷等方面優(yōu)勢(shì)明顯，但由于ASFV基因組龐大和免疫逃逸機(jī)制復(fù)雜，需要在充分解析ASFV主要蛋白結(jié)構(gòu)與功能、感染與免疫機(jī)制上進(jìn)行更全面的研究［18-19］。

CD2v與P12為非洲豬瘟病毒囊膜蛋白，其中CD2v參與非洲豬瘟病毒的免疫逃逸，是晚期表達(dá)蛋白。CD2v蛋白與T細(xì)胞表面黏附因子CD2具有相似性，且CD2v與C型凝集素蛋白為ASFV重要保護(hù)性抗原［20］。P12參與病毒的附著過(guò)程，純化的P12蛋白會(huì)與宿主細(xì)胞結(jié)合可阻止病毒與細(xì)胞的結(jié)合。因此，若能阻斷CD2v及P12的功能則可提高宿主抗病毒能力及削弱病毒侵染能力［8］。CD2v與P12免疫源性強(qiáng)，其作為亞單位疫苗、DNA疫苗與病毒載體疫苗免疫后可誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答及細(xì)胞免疫應(yīng)答。而利用桿狀病毒作為載體，表達(dá)CD2v的重組疫苗免疫豬后產(chǎn)生了抗體，并且攻毒后全部存活［21］。

PRV已被廣泛應(yīng)用于病毒載體疫苗的研發(fā)，其主要蛋白的功能已有較為全面的了解，并同時(shí)可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。TK基因?yàn)镻RV主要毒力基因，TK基因的缺失可顯著降低PRV對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的侵襲性和豬的致病性，但免疫原性不受影響［22］。gI為PRV增殖過(guò)程中的非必須基因，通常在構(gòu)建PRV弱毒活疫苗的過(guò)程中將其刪除，gI的刪除可降低病毒侵染能力使弱毒活疫苗更加安全［15，23］。目前，以PRV作為載體所研發(fā)的活病毒載體疫苗主要有豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒-豬偽狂犬病病毒重組疫苗［24］、豬圓環(huán)病毒 II 型-豬偽狂犬病病毒重組疫苗與豬瘟病毒-豬偽狂犬病病毒重組疫苗等［25］。本研究通過(guò)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，利用PRV作為載體分別將ASFV CD2v與p12分別插入至PRV TK與gI中構(gòu)建了重組表達(dá)ASFV CD2v及P12蛋白的重組毒株 PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）。CD2v與P12為非洲豬瘟病毒囊膜蛋白，這兩種蛋白作為ASFV的重要抗原已被人證實(shí)安全有效。在用作亞單位疫苗與DNA疫苗時(shí)均能產(chǎn)生特異性抗體。本研究通過(guò)PRV活載體在vero細(xì)胞中成功表達(dá)出CD2v與P12，并且CD2v中還存在幾種CD2v糖基化亞型。因此，CD2v的糖基化可能不依賴于ASFV的感染。而缺失的TK與gI基因則使得PRV的毒力降低，大大提高了安全性。通過(guò)小鼠器官HE染色發(fā)現(xiàn)與野生型毒株相比缺失TK與gI的毒株不引起小鼠腦部炎癥與肺部腫大，但會(huì)引起小鼠脾臟的淋巴細(xì)胞增殖。這表明該重組病毒成功激活了小鼠的免疫系統(tǒng)。

本研究首次通過(guò)PRV為載體構(gòu)建了表達(dá)非洲豬瘟病毒CD2v與P12蛋白的重組偽狂犬病毒，該重組毒株遺傳性狀穩(wěn)定CD2v及P12可穩(wěn)定表達(dá)、體外增殖能力良好、毒力弱、具有較好的安全性，其將為ASF及PR多價(jià)疫苗研發(fā)做鋪墊。但還需要更多實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證該毒株是否可作為候選疫苗株，如驗(yàn)證該毒株在豬體內(nèi)的有效性及可能存在的副作用。

4 結(jié)論

成功構(gòu)建了表達(dá)非洲豬瘟病毒CD2v與P12蛋白的重組偽狂犬重組毒株，該重組毒株毒力弱安全性良好，該研究將為ASF疫苗研發(fā)提供新的借鑒。