韓占紅 宗元元 張學(xué)梅 王斌 PRUSKY Dov 畢陽(yáng)

（1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730070；2. Department of Postharvest Science of Fresh Produce，Agricultural Research Organization，Volcani Center，Bet Dagan 50250，Israel）

擴(kuò)展青霉（Penicillium expansum Link）是重要的采后病原真菌，寄主范圍廣，可侵染蘋果、梨、桃、櫻桃等二十多種果實(shí)，其所引起的青霉病造成的采后經(jīng)濟(jì)損失巨大［1］。此外，P. expansum還會(huì)在果實(shí)體內(nèi)產(chǎn)生對(duì)消費(fèi)者健康具有潛在危害的棒曲霉毒素［2］。因此，減輕P. expansum對(duì)果實(shí)的危害是當(dāng)前生產(chǎn)中亟待解決的問(wèn)題。

麥角甾醇（Ergosterol）是真菌細(xì)胞膜上的特有組分，在真菌生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有重要作用［3］，可確保真菌細(xì)胞膜的穩(wěn)定性、流動(dòng)性、滲透性以及膜上相關(guān)蛋白的活性［4-8］。此外，麥角甾醇還對(duì)真菌細(xì)胞內(nèi)外的信號(hào)分子轉(zhuǎn)導(dǎo)、膜蛋白的正確定位以及功能的正常發(fā)揮具有重要影響［9-10］。麥角甾醇的生物合成受一系列erg基因的調(diào)控，其中erg4編碼的是一種甾醇C-24（28）還原酶（sterol C-24（28）reductase），催化麥角甾醇合成的最后一步反應(yīng)，將前體物質(zhì)ergosta-5，7，22，24（28）-四烯醇轉(zhuǎn)化為麥角甾醇［11-12］。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中僅存在一個(gè)erg4基因，該基因的缺失不僅導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)缺陷，還會(huì)改變細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)［13-14］。缺失erg4的S. cerevisiae對(duì)氧化脅迫的敏感性增加［15］。敲除erg4的紅法夫酵母（Red Yeast Xanthophyllomyces dendrorhous）麥角甾醇合成受到抑制，導(dǎo)致前體物質(zhì)大量積累［16］。禾谷鐮孢菌（Fusarium graminearum）中erg4的缺失也會(huì)導(dǎo)致菌絲生長(zhǎng)緩慢、產(chǎn)孢量降低、分生孢子畸形、分隔數(shù)減少、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇合成量下降、致病性及抗氧化脅迫能力顯著降低［17］。煙曲霉（Aspergillus fumigatus）中存在erg4A和erg4B兩個(gè)erg4同源基因，erg4A和erg4B的共同缺失會(huì)完全阻斷麥角甾醇合成，并造成嚴(yán)重的產(chǎn)孢缺陷，但其單獨(dú)缺失既不影響麥角甾醇的合成，也不影響正常產(chǎn)孢［18］。雖然已有erg4調(diào)控酵母和其他絲狀真菌生長(zhǎng)發(fā)育、致病性及產(chǎn)毒方面的報(bào)道，但該基因編碼蛋白是如何參與P. expansum的生物學(xué)過(guò)程還未見(jiàn)報(bào)道。我們前期的生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，P. expansum中存在erg4A、erg4B和erg4C三個(gè)erg4基因，但基本生物學(xué)功能未知。

本研究通過(guò)RT-PCR方法擴(kuò)增erg4A、erg4B及erg4C的CDS區(qū)全長(zhǎng)；利用生物信息學(xué)方法對(duì)這3個(gè)基因的序列信息、編碼蛋白的跨膜螺旋及親疏水性進(jìn)行預(yù)測(cè)分析；通過(guò)構(gòu)建3個(gè)基因的GFP融合表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化P. expansum后觀察3個(gè)融合表達(dá)蛋白的亞細(xì)胞定位。此外，還通過(guò)RT-qPCR對(duì)這3個(gè)基因在P. expansum不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期、不同培養(yǎng)基狀態(tài)以及在黑暗和藍(lán)光培養(yǎng)條件下的表達(dá)特性進(jìn)行分析。以期為全面解析這3種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 擴(kuò)展青霉Penicillium expansum T01和根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens EHA105）及攜帶綠色熒光蛋白基因gfp和篩選標(biāo)記基因G418的亞細(xì)胞定位載體pC-NEO-GFP由中國(guó)科學(xué)院植物研究所果實(shí)逆境應(yīng)答及生物控制技術(shù)研究組惠贈(zèng)。P.expansum于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）上活化擴(kuò)繁。

1.1.2 儀器與設(shè)備 光學(xué)顯微鏡（CX21FSIC型，奧林巴斯工業(yè)有限公司，中國(guó)）；超凈工作臺(tái)（SW-CJ-2FD型，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，中國(guó)）；高速冷凍離心機(jī)（H-1850R型，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司，中國(guó)）；立式壓力蒸汽滅菌鍋（LDZX-30KBS 型，上海申安醫(yī)療器械廠，中國(guó)）；熒光顯微鏡（BX51DP74型，日本奧林巴斯有限公司，日本）；恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9082型，上海-恒科學(xué)儀器有限公司，中國(guó)），超低溫冰箱（DW-HL218型，中科美菱低溫科技有限公司，中國(guó)）；PCR熱循環(huán)儀（S1000，BIO-RAD，美國(guó)）；超微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（206-26300-48，日本島津）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)（QuantStudio?5，美國(guó)THERMO FISHER，美國(guó)）；激光掃描共聚焦顯微鏡（LSM800，德國(guó)Zeiss公司）。

1.2 方法

1.2.1 erg4A、erg4B和erg4C基因序列的獲取 根據(jù)NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中 P. expansum MD-8的erg4基因序列進(jìn)行Nucleotide BLAST比對(duì)，檢索獲得P. expansum T01中erg4A、erg4B和erg4C的基因全長(zhǎng)序列。

1.2.2 總RNA的提取及第一鏈cDNA的合成 用TRNzol Universal總RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）提取P.expansum菌絲總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其結(jié)構(gòu)的完整性，用超微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度和純度，使用PrimeScripTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒（TaKaRa，RR047A）進(jìn)行g(shù)DNA消化以及第一鏈cDNA的合成，于-20℃保存待用。所有操作均按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.3 erg4A、erg4B和erg4C基因CDS的克隆 根據(jù)上述分析得到的3個(gè)基因全長(zhǎng)序列，設(shè)計(jì)特異性引物，引物序列見(jiàn)表1。以cDNA為模板，用2×Phanta Max Master Mix高保真酶（諾唯贊生物，南京）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系如下：0.5 μL F引物（10 μmon/L），0.5 μL R 引物（10 μmon/L），1 μL cDNA，10 μL 2× Phanta Max Master Mix，8 μL ddH2O。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，使用膠回收試劑盒（全式金生物，北京）進(jìn)行PCR產(chǎn)物的回收，回收產(chǎn)物送北京擎科生物科技有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用DNA MAN軟件進(jìn)行比對(duì)分析。

表1 erg4A、erg4B和erg4C基因CDS的克隆引物序列Table 1 Primers sequence for the clone of CDS of gene erg4A，erg4B and erg4C

1.2.4 Erg4A、Erg4B和Erg4C蛋白的生物信息學(xué)分析 通過(guò)在線分析工具GSDS（Gene Structure Display Server，http ：//gsds.gao-lab.org/）分析這 3 個(gè)基因的結(jié)構(gòu)，利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)提供的ORF Finder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder） 對(duì) DNA 序列進(jìn)行開(kāi)放閱讀框（ORF，Open Reading Frame）預(yù)測(cè)。利用生物學(xué)在線分析工具-TMHMM 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）和 ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/） 對(duì) Erg4A、Erg4B及 Erg4C的跨膜螺旋和蛋白親疏水性進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

1.2.5 Erg4A-GFP、Erg4B-GFP和Erg4C-GFP融合表達(dá)載體構(gòu)建 利用同源重組的方法分別在Erg4A和Eg4B蛋白的N端以及Erg4C蛋白的C端進(jìn)行GFP的標(biāo)記。構(gòu)建GFP融合表達(dá)載體的引物見(jiàn)表2。

表2 用于構(gòu)建GFP融合表達(dá)載體的引物序列Table 2 Primer sequences for GFP fusion vector construction

1.2.6 P. expansum的轉(zhuǎn)化 參考Li等［19］農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化P. expansum的方法，通過(guò)PCR驗(yàn)證陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的驗(yàn)證引物序列見(jiàn)表3。

表3 轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證所用引物序列Table 3 Primer sequences for transformant validation

1.2.7 Erg4A、Erg4B和Erg4C的亞細(xì)胞定位的觀察在10 mL CY液體培養(yǎng)基中接種1 mL P. expansum孢子懸浮液，于25℃、200 r/min條件下培養(yǎng)13-14 h，使其孢子萌發(fā)，于8 000 r/min離心5 min，用磷酸鹽緩沖液洗滌3遍，在一潔凈載玻片中央滴加15 μL菌懸液，將蓋玻片扣在其上，輕壓后置于共聚焦顯微鏡下觀察。并分別進(jìn)行目標(biāo)蛋白與細(xì)胞核和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的共定位觀察。

細(xì)胞核染色：使用終濃度為0.6 μg/mL的DAPI熒光染料對(duì)樣品進(jìn)行避光染色15 min，用磷酸鹽緩沖液洗滌除去染液后進(jìn)行熒光顯微鏡觀察。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)染色：取少量ER-Tracker Red染料按照1∶1 000的比例加入到ER-Tracker Red稀釋液中制成工作液，使用前于37℃水浴鍋預(yù)溫育。工作液與待觀察樣品按1∶1的比例混合，37℃孵育25 min后，用磷酸鹽緩沖液洗滌去除染料，隨后置于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.8 RT-qPCR反應(yīng)分析基因mRNA水平 總RNA的提取及cDNA的合成參照1.2.2的方法。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析P. expansum在不同發(fā)育階段、不同培養(yǎng)基狀態(tài)以及黑暗和藍(lán)光培養(yǎng)條件下的erg4的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。以β-tubulin（GenBank accession number：AF003248.1）作為內(nèi)參基因。PCR反應(yīng)體系為 20 μL，包含 ：10 μL TB Green Premix Ex Taq II，0.8 μL 正向引物（10 μmon/L），0.8 μL 反向引物（10 μmol/L），0.4 μL ROX Reference Dye II，2 μL cDNA，6 μL ddH2O。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?：95℃預(yù)變性 30 s，95℃變性5 s，60℃ 34 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。通過(guò)相對(duì)定量方法2-ΔΔCt［20］比較目的基因的表達(dá)量差異。每個(gè)樣品均設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.9 孢子懸浮液的配制 參照Tahir等［21］的方法并做修改。P. expansum在PDA培養(yǎng)基上25℃恒溫培養(yǎng)5 d后，用無(wú)菌水收集孢子，經(jīng)4層紗布過(guò)濾后得到孢子懸浮液，通過(guò)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后用無(wú)菌水調(diào)整濃度為1×106spores/mL備用。

1.2.10 不同發(fā)育階段erg4A、erg4B和erg4C的表達(dá) 取500 μL P. expansum孢子懸浮液接種到100 mL CY（3 g/L NaNO3，1g/L K2HPO4·3H2O，0.5 g/L KCl，0.5 g/L MgSO4·7H2O，0.01 g/L FeSO4·7H2O，30 g/L Surose，5 g/L Yeast Extract，pH 5.2）液體培養(yǎng)基中，于25℃，200 r/min條件下培養(yǎng)。分別于0 h、14 h和3 d后收集孢子、萌發(fā)的孢子和菌絲，于液氮中速凍，保存至-80℃超低溫冰箱待用。

1.2.11 固體和液體培養(yǎng)下erg4A、erg4B和erg4C的表達(dá) 將玻璃紙高溫滅菌后鋪在CYA固體平板上，接種2.5 μL的P. expansum孢子懸浮液于平板中央，25℃培養(yǎng)3 d后收集菌絲保存至-80℃超低溫冰箱待用。接種500 μL的P. expansum孢子懸浮液于100 mL CY液體培養(yǎng)基中，于25℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)3 d，用4層滅菌紗布過(guò)濾收集菌絲，再用無(wú)菌水沖洗3遍，將菌絲于液氮中速凍，保存至-80℃超低溫冰箱待用。

1.2.12 黑暗和藍(lán)光培養(yǎng)條件下erg4A、erg4B和erg4C的表達(dá) 將玻璃紙高溫滅菌后鋪在PDA平板上，接種2.5 μL的P. expansum孢子懸浮液，于25℃培養(yǎng)24 h，然后將玻璃紙連同菌絲一起轉(zhuǎn)移至裝有CY液體培養(yǎng)基的24孔板中，分別置于黑暗和藍(lán)光（光照強(qiáng)度在1 600 Lux）條件下，于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，收集菌絲，液氮速凍后保存至-80℃超低溫冰箱待用。

1.2.13 erg4A、erg4B和erg4C基因的RT-qPCR引物設(shè)計(jì) 根據(jù)克隆得到的erg4A、erg4B和erg4C 的cDNA序列，使用Primer Express software 3.0（Applied Biosystems）軟件設(shè)計(jì)RT-q PCR引物，引物序列見(jiàn)表4。

表4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Table 4 Primers for real-time fluorescent quantitative PCR

1.2.14 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，采用軟件Origin 8.0（Northampton，MA，USA）作圖；SPSS20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，應(yīng)用單因素方差分析（One-way ANOVA）和鄧肯氏（Duncan’s）差異分析，在P=0.05水平上檢測(cè)差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 erg4A、erg4B和erg4C的CDS區(qū)克隆

以P. expansum cDNA為模板，利用CDS克隆引物erg4A-F/R、erg4B-F/R及erg4C-F/R對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得清晰明亮的單條帶（圖1）。

圖1 erg4A、erg4B和erg4C的全長(zhǎng)CDS克隆Fig. 1 Full-length CDS cloning of erg4A，erg4B and erg4C

2.2 erg4A、erg4B和erg4C的基因結(jié)構(gòu)及序列信息

基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，erg4A基因全長(zhǎng)為1 476 bp，編碼491個(gè)氨基酸，不含內(nèi)含子；erg4B基因全長(zhǎng)為1 619 bp，編碼496個(gè)氨基酸，含有大小分別為51 bp和77 bp的2個(gè)內(nèi)含子；erg4C基因全長(zhǎng)為1 762 bp，編碼531個(gè)氨基酸，含有大小分別為51 bp、56 bp和59 bp 的3個(gè)內(nèi)含子（圖2）。開(kāi)放閱讀框的預(yù)測(cè)結(jié)果表明，erg4A一共有14個(gè)ORF，最長(zhǎng)的ORF長(zhǎng)度是1 476 nt，位于正義鏈，讀碼框?yàn)?；erg4B一共有12個(gè)ORF，最長(zhǎng)的ORF長(zhǎng)度是873 nt，位于正義鏈，讀碼框?yàn)?；erg4C一共有13個(gè)ORF，最長(zhǎng)的ORF長(zhǎng)度是1 473 nt，位于正義鏈，讀碼框?yàn)?。

圖2 erg4A、erg4B及erg4C的基因結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 2 Genetic structures of erg4A，erg4B and erg4C

2.3 Erg4A、Erg4B和Erg4C蛋白跨膜螺旋

跨膜螺旋預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，Erg4A和Erg4C蛋白均包含9個(gè)跨膜螺旋、5個(gè)膜內(nèi)結(jié)構(gòu)和5個(gè)膜外結(jié)構(gòu)；Erg4B僅有7個(gè)跨膜螺旋、4個(gè)膜內(nèi)結(jié)構(gòu)和4個(gè)膜外結(jié)構(gòu)（圖3）。這些跨膜螺旋表明Erg4A、Erg4B和Erg4C是典型的膜蛋白，對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)功能的發(fā)揮具有重要作用，3個(gè)蛋白均定位于細(xì)胞質(zhì)膜或具有膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器上。

圖3 Erg4A、Erg4B和Erg4C的跨膜螺旋Fig. 3 Transmembrane helices of Erg4A，Erg4B and Erg4C

2.4 Erg4A、Erg4B和Erg4C蛋白的親疏水性

蛋白的親疏水性分析結(jié)果表明，Erg4A、Erg4B及Erg4C 3條蛋白序列均存在明確的親疏水區(qū)域，且疏水區(qū)域明顯多于親水區(qū)域。整條肽鏈表現(xiàn)出疏水性，通常蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)為疏水區(qū)，這與利用TMHMM對(duì)蛋白跨膜螺旋結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果相吻合。其中，erg4A基因編碼蛋白氨基酸序列第165位氨基酸疏水性最強(qiáng)（3.078），第11位氨基酸為親水性最強(qiáng)（-2.978）。erg4B基因編碼蛋白氨基酸序列第36位氨基酸疏水性最強(qiáng)（2.933），第467位氨基酸為親水性最強(qiáng)（-3.133），erg4C基因編碼蛋白氨基酸序列第396位氨基酸疏水性最強(qiáng)（2.767），第415位氨基酸為親水性最強(qiáng)（-3.178）。同時(shí)，Erg4A、Erg4B和Erg4C蛋白分別有9個(gè)、7個(gè)和9個(gè)疏水區(qū)（圖 4）。

圖4 Erg4A、Erg4B和Erg4C蛋白親疏水性Fig. 4 Hydrophilicity/Hydrophobicity of Erg4A，Erg4B and Erg4C protein

2.5 GFP融合表達(dá)菌株的PCR鑒定及形態(tài)觀察

將傳代培養(yǎng)的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子提取基因組DNA，以此為模板進(jìn)行PCR驗(yàn)證，用特異性引物Erg4-GFPF/R和載體引物CX1/CX2對(duì)Erg4A-GFP轉(zhuǎn)化子進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)其條帶大小為1 500 bp左右，且野生型無(wú)條帶出現(xiàn)，與預(yù)期結(jié)果相同（條帶預(yù)期大小1 476 bp）；用特異性引物Erg4B-GFP-F/R和載體引物CX1/CX2對(duì)Erg4B-GFP轉(zhuǎn)化子進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)其條帶大小為1 700 bp左右，且野生型無(wú)條帶出現(xiàn)，與預(yù)期結(jié)果相同（條帶預(yù)期大小1 619 bp）；用特異性引物Erg4C-GFP-F/R和載體引物CX1/CX2對(duì)Erg4CGFP轉(zhuǎn)化子進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)其條帶大小為1 800 bp左右，且野生型無(wú)條帶出現(xiàn)，與預(yù)期結(jié)果相同（條帶預(yù)期大小1 762 bp）（圖5）。以上結(jié)果表明GFP融合表達(dá)菌株構(gòu)建成功。對(duì)GFP融合表達(dá)菌株的生長(zhǎng)狀況進(jìn)行觀察后發(fā)現(xiàn)，熒光標(biāo)記菌株菌落表型與野生型基本一致（圖6）。

圖5 GFP融合表達(dá)菌株P(guān)CR驗(yàn)證Fig. 5 GFP fusion expression strain verified by PCR

圖6 野生型與熒光標(biāo)記菌株erg4A-GFP、erg4B-GFP及erg4C-GFP的菌落形態(tài)比較Fig. 6 Comparison of colony morphologies of erg4A-GFP，erg4B-GFP and erg4C-GFP in wild type and fluoresence labelled strains

2.6 Erg4A、Erg4B和Erg4C的亞細(xì)胞定位觀察

在激光共聚焦顯微鏡下觀察各蛋白的綠色熒光蛋白信號(hào)結(jié)果（圖7）顯示，3個(gè)融合表達(dá)蛋白GFP的綠色熒光均在細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)圓圈形的分布。

圖7 融合表達(dá)蛋白GFP的綠色熒光分布Fig. 7 Distribution of green fluorescence of GFP fusion expression protein

為進(jìn)一步明確這3個(gè)蛋白的亞細(xì)胞定位，通過(guò)DAPI和ER-Tracker Red染色，進(jìn)行細(xì)胞核與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和GFP融合蛋白的共定位結(jié)果顯示，Erg4A、Erg4B和Erg4C均定位在菌絲細(xì)胞內(nèi)許多圓圈結(jié)構(gòu)上，且DAPI核染色顯示這些圓圈結(jié)構(gòu)均存在于細(xì)胞核的外圍，因此初步判定該結(jié)構(gòu)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。為進(jìn)一步確認(rèn)定位結(jié)果，我們用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)紅色熒光探針染色，共定位結(jié)果顯示融合蛋白與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分布一致。因此，我們認(rèn)為ErgA、ErgB及ErgC蛋白具有相同的亞細(xì)胞定位，均定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上（圖8-9）。

圖8 DAPI核染色與GFP的共定位Fig. 8 Colocalization of DAPI nuclear staining with GFP

2.7 不同發(fā)育階段erg4A、erg4B和erg4C的表達(dá)差異

如圖10所示，在孢子階段、孢子萌發(fā)階段以及成熟菌絲階段，erg4A的表達(dá)量無(wú)明顯變化，但erg4B和erg4C的表達(dá)量均顯著上升，其中erg4B的上升幅度更為明顯。erg4B在孢子階段的表達(dá)量分別高出 erg4A和erg4C 29.5倍和3.1倍（P＜0.05），在孢子萌發(fā)階段的表達(dá)量分別高出erg4A和erg4C 72.9倍和1.4倍（P＜0.05），在成熟菌絲階段的表達(dá)量分別高出erg4A和erg4C 83.6倍和1.72倍（P＜0.05）。

圖10 擴(kuò)展青霉中erg4A、erg4B和erg4C在孢子階段、孢子萌發(fā)階段以及成熟菌絲階段的相對(duì)表達(dá)量Fig. 10 Relative expressions of erg4A，erg4B and erg4C in the spore，germinated spore and mycelium stages in P. expansum

圖9 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)紅色熒光探針染色與GFP的共定位Fig. 9 Colocalization of endoplasmic reticulum red fluorescent probe with GFP

2.8 CY固體和液體培養(yǎng)條件下erg4A、erg4B和erg4C的表達(dá)差異

如圖11所示，erg4A在CY固體和液體培養(yǎng)條件下的相對(duì)表達(dá)量未見(jiàn)顯著差異，但erg4B和erg4C在液體培養(yǎng)條件下的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于固體培養(yǎng)，分別高出 4.96倍和 1.6倍（P＜0.05）（圖 11）。由此表明，erg4B和erg4C的表達(dá)均受培養(yǎng)基狀態(tài)的影響。

圖11 擴(kuò)展青霉中erg4A、erg4B和erg4C在CY固體和液體培養(yǎng)條件下的相對(duì)表達(dá)量Fig. 11 Relative expressions of erg4A，erg4B and erg4C in P. expansum in Czapek yeast extract solid medium and Czapek yeast extract liquid medium

2.9 黑暗和藍(lán)光條件下erg4A、erg4B和erg4C的表達(dá)差異

erg4A和erg4B在藍(lán)光條件下的表達(dá)量均顯著高于黑暗條件，分別高出5.6倍和6.4倍（P＜0.05），雖然erg4C在在藍(lán)光條件下的表達(dá)量略高于黑暗，但無(wú)顯著差異（圖12）。由此表明，erg4A和erg4B對(duì)藍(lán)光信號(hào)響應(yīng)積極，erg4C對(duì)藍(lán)光信號(hào)不敏感。

圖12 擴(kuò)展青霉中erg4A、erg4B和erg4C在黑暗和藍(lán)光條件下的相對(duì)表達(dá)量Fig. 12 Relative expressions of erg4A，erg4B and erg4C in P. expansum in dark and blue condition

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，P. expansum中同時(shí)存在3個(gè)erg4基因，分別命名為erg4A、erg4B和erg4C。其中，erg4A基因編碼491個(gè)氨基酸；erg4B基因編碼496個(gè)氨基酸；erg4C基因編碼531個(gè)氨基酸，這些同源基因的存在可能是絲狀真菌在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中為了適應(yīng)環(huán)境變化、調(diào)節(jié)細(xì)胞膜流動(dòng)性和通透性等功能表現(xiàn)出的一種適應(yīng)機(jī)制［22］。Erg4A與Erg4B的氨基酸序列相似性為21.86%，Erg4B與Erg4C的氨基酸序列相似性為19.93%，而Erg4A與Erg4C的氨基酸序列相似性高達(dá)55.87%。由此可知，Erg4A與Erg4C的同源性較高，預(yù)示Erg4A與Erg4C可能存在功能互補(bǔ)現(xiàn)象。Erg4A和Erg4C各含有9個(gè)跨膜螺旋，而Erg4B僅含有7個(gè)跨膜螺旋，推測(cè)這3種蛋白可能定位于質(zhì)膜。先前的研究表明，S. cerevisiae的 Erg4僅含有7個(gè)跨膜螺旋［23］，A. fumigatus的Erg4A和Erg4B均含有9個(gè)跨膜螺旋［18］，推測(cè)P.expansum的Erg4B與S. cerevisiae的Erg4可能具有類似的功能，而Erg4A和Erg4C與A. fumigatus的Erg4A和Erg4B功能類似。由于P. expansum的Erg4A、Erg4B和Erg4C均表現(xiàn)出疏水性，可能定位于質(zhì)膜的磷脂雙分子層。

本研究觀察到，融合表達(dá)蛋白Erg4A-GFP、Erg4B-GFP和Erg4C-GFP的綠色熒光均在細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)圓形結(jié)構(gòu)，DAPI核染色顯示這些環(huán)狀結(jié)構(gòu)均位于細(xì)胞核的外圍，且與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)紅色熒光探針染色的熒光信號(hào)完全吻合，該結(jié)果與Erg4A、Erg4B及Erg4C具有多個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域以及表現(xiàn)出疏水性的結(jié)果基本一致。對(duì)S. cerevisiae的研究發(fā)現(xiàn)，麥角甾醇在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上經(jīng)一系列酶促反應(yīng)合成后轉(zhuǎn)運(yùn)至質(zhì)膜等部位發(fā)揮其功能［23］。S. cerevisiae中許多與麥角甾醇合成相關(guān)的蛋白主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，如Erg1和Erg4［11，23］。此外，通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)記蛋白Erg11對(duì)A. fumigatus中Erg4A和Erg4B進(jìn)行了紅色熒光標(biāo)記發(fā)現(xiàn)，這兩種蛋白也定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上［18］。因此，我們觀察到的P.expansum的Erg4A、Erg4B和Erg4C蛋白均定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結(jié)果與前人在S. cerevisiae和A. fumigatus上報(bào)道的結(jié)果基本一致。

本研究中發(fā)現(xiàn)，在孢子階段、孢子萌發(fā)階段以及成熟菌絲階段，erg4A的表達(dá)量無(wú)明顯變化，但erg4B和erg4C的表達(dá)量均顯著上升，其中erg4B的上升幅度更為明顯。這可能是由于Erg4A與Erg4C具有相似的蛋白結(jié)構(gòu)和相同的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位，在催化麥角甾醇合成方面存在功能互補(bǔ)。即當(dāng)某個(gè)erg4基因低表達(dá)時(shí)，另一同源基因的表達(dá)量就會(huì)相應(yīng)升高以彌補(bǔ)對(duì)菌株造成的損害［24］。推測(cè)在正常情況下，這3個(gè)基因同時(shí)發(fā)揮作用，erg4B功能更為明顯。這種互補(bǔ)機(jī)制可使菌株免受因一種基因突變給菌株帶來(lái)的傷害，在提高P. expansum的生存適應(yīng)性方面具有積極的功能。還有研究發(fā)現(xiàn)桑黃菌（Phellinus linteus）中erg24的表達(dá)在培養(yǎng)前期和中期無(wú)顯著變化，但在培養(yǎng)后期迅速升高，其原因是培養(yǎng)后期培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分減少，有害次生代謝產(chǎn)物大量累積，導(dǎo)致細(xì)胞受到損害，而麥角甾醇能夠維持細(xì)胞形態(tài)和膜結(jié)構(gòu)的完整性［25］。因此，推測(cè)P. expansum中erg4B和erg4C在3個(gè)階段的高表達(dá)可能與適應(yīng)培養(yǎng)基中有害次生代謝產(chǎn)物的自我保護(hù)有關(guān)。至于是否存在該機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

麥角甾醇生物合成是一個(gè)需氧的過(guò)程，每合成一分子的麥角甾醇需要消耗12分子的O2［26］。本研究發(fā)現(xiàn)，erg4A在CY固體和液體培養(yǎng)條件下的表達(dá)量沒(méi)有顯著差異，而erg4B和erg4C在CY液體培養(yǎng)條件下的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于固體培養(yǎng)條件。該結(jié)果與前人發(fā)現(xiàn)的麥角甾醇生物合成需氧的結(jié)果類似。由于液體培養(yǎng)條件下O2供應(yīng)充足，可保證麥角甾醇順利合成［22］。至于O2條件如何調(diào)控P.expansum中erg4A、erg4B和erg4C的表達(dá)差異尚有待進(jìn)一步揭示。藍(lán)光是調(diào)控絲狀真菌生長(zhǎng)發(fā)育最重要的環(huán)境信號(hào)分子［27］。已有研究發(fā)現(xiàn)，藍(lán)光可以調(diào)控深綠木霉（Trichoderma atroviride）細(xì)胞膜的瞬時(shí)電位和ATP在細(xì)胞內(nèi)的積累［28］，表明藍(lán)光參與深綠木霉的能量供應(yīng)。本研究觀察到，erg4A和erg4B在藍(lán)光條件下的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于黑暗條件，而erg4C在藍(lán)光和黑暗條件下沒(méi)有顯著差異，表明erg4A和erg4B的表達(dá)受到藍(lán)光信號(hào)的調(diào)控，推測(cè)Erg4A和Erg4B存在可響應(yīng)藍(lán)光信號(hào)的感光結(jié)構(gòu)域，至于Erg4A和Erg4B是否存在響應(yīng)藍(lán)光信號(hào)的感光結(jié)構(gòu)域尚有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)生物信息學(xué)手段分析了擴(kuò)展青霉中erg4A、erg4B和erg4C的基因結(jié)構(gòu)、跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域和親疏水性。Erg4A、Erg4B及Erg4C三個(gè)蛋白均定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。erg4B和erg4C的表達(dá)受擴(kuò)展青霉不同生長(zhǎng)發(fā)育階段以及培養(yǎng)基狀態(tài)的影響，erg4A和erg4B的表達(dá)受藍(lán)光信號(hào)的調(diào)控。