孟憲博,林 強(qiáng),韓士舉,梁世洋,王景杰

(空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院消化內(nèi)科,西安 710038;*通訊作者,E-mail:jingjie@fmmu.edu.cn)

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β)蛋白超家族成員,與骨和軟骨形態(tài)發(fā)生、修復(fù)相關(guān)[1]。隨著研究的進(jìn)展發(fā)現(xiàn),BMP除參與骨形態(tài)發(fā)生調(diào)節(jié)外,還參與諸多骨外組織的發(fā)育分化及功能維持[2],其中BMP4在消化道發(fā)育、組織分化和功能維持中起到重要作用[3,4]。但目前關(guān)于BMP4及其受體在不同發(fā)育階段大鼠消化道分布表達(dá)尚不清楚,對(duì)于其在不同消化道器官功能維持和分化發(fā)育的作用機(jī)制仍不明確。

前期研究表明,在胚胎消化道發(fā)育過程中,BMP4協(xié)同Hedghog通路相關(guān)蛋白參與消化道環(huán)形肌和縱行肌分化發(fā)育,且對(duì)于正常胚胎發(fā)育不可或缺[3]。除參與胚胎消化器官發(fā)育外,出生后正常消化器官穩(wěn)態(tài)的維持同樣有BMP信號(hào)的參與調(diào)節(jié),在炎癥、腫瘤和其他消化道疾病的影響下可能會(huì)產(chǎn)生BMP表達(dá)和分布異常[5-7]。有臨床研究表明,在許多消化道疾病和消化道腫瘤中,BMP4呈現(xiàn)出異常的表達(dá)水平和分布特點(diǎn)[2]。有研究報(bào)道BMP4與食管腺癌的發(fā)生密切相關(guān),且BMP4基因突變與結(jié)直腸癌的發(fā)生同樣具有很高的相關(guān)性[8]。

因此,我們推測(cè)不同發(fā)育階段大鼠消化道器官中BMP4及其受體可能有分布和表達(dá)的差異性,或與正常消化道黏膜腺體及平滑肌功能維持密切相關(guān)。

為此本研究擬通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法,研究BMP4及其受體BMPR1B在不同發(fā)育階段大鼠消化道中的表達(dá)分布情況,特別關(guān)注BMP4在不同發(fā)育階段的表達(dá)差異,進(jìn)而探討B(tài)MP4在胃腸發(fā)育調(diào)節(jié)以及胃腸疾病中的意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

5日齡、3周齡及8周齡雄性SD大鼠各6只,SPF級(jí)。5日齡大鼠體質(zhì)量10-12 g,3周齡大鼠體質(zhì)量50-60 g,8周齡大鼠體質(zhì)量250-300 g,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)2016-0011。

1.2 主要試劑、儀器

兔抗BMP4抗體(美國(guó)Abcam公司),兔抗BMPR1B抗體(美國(guó)Abcam公司),Alexa Fluor 594標(biāo)記驢抗大鼠IgG抗體(美國(guó)Jackson公司),Alexa Fluor 488標(biāo)記驢抗兔IgG抗體(美國(guó)Jackson公司),HRP酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(美國(guó)Santa Cruz公司),HRP酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體(美國(guó)Santa Cruz公司),小鼠抗GAPDH抗體(中國(guó)Servicebio);Nikon eclipse Ci熒光顯微鏡(日本NIKON公司);冷凍切片機(jī)(德國(guó)Leica公司);電泳儀和電泳槽(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.3 胃腸道組織標(biāo)本制備

用異氟烷誘導(dǎo)麻醉大鼠并維持,打開胸腔用預(yù)冷0.01 mol/L PBS溶液灌流心臟,打開腹腔觀察肝葉褪色后取胃、十二指腸及結(jié)腸用0.01 mol/L預(yù)冷PBS反復(fù)沖洗。分別將用于Western blot沖洗干凈后的胃、十二指腸和結(jié)腸組織剪碎,加入含蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液,勻漿器勻漿,冰上裂解30 min,4 ℃ 12 000 r/min離心15 min,吸取上清,用BCA法蛋白定量。用于免疫熒光的8周齡大鼠消化道組織4%多聚甲醛固定各節(jié)段消化道組織6-8 h,將固定好的組織置于25%蔗糖溶液,4 ℃浸泡過夜脫水沉底,包埋后冰凍切片機(jī)上連續(xù)切片,切片厚10 μm。

1.4 間接免疫熒光法檢測(cè)大鼠胃腸道BMP4及BMPR1B分布

將制備好的8周齡大鼠胃體、結(jié)腸升段組織冰凍切片，用含1% BSA+0.5%Triton的PBS液封閉40 min，加一抗(BMP4抗體按1 ∶100稀釋，α-SMA抗體按1 ∶200稀釋)。一抗4 ℃孵育過夜。經(jīng)PBST漂洗5 min×3次，后加二抗(Alexa Fluor 488熒光標(biāo)記二抗或，Alexa Fluor 594熒光標(biāo)記二抗均按1 ∶1 000稀釋)室溫孵育2 h，DAPI工作液室溫孵育5 min襯核。PBST漂洗后，50%緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下觀察染色后的胃體及結(jié)腸升段組織切片。

1.5 Western blot檢測(cè)大鼠胃腸道BMP4及BMPR1B相對(duì)表達(dá)水平

對(duì)5日齡、3周齡、及8周齡的大鼠用Western blot法半定量檢測(cè)胃、十二指腸、結(jié)腸組織BMP4及BMPR1B蛋白表達(dá)水平，取制備好的大鼠胃體、十二指腸及升結(jié)腸蛋白，絕對(duì)定量后用含蛋白酶及磷酸酶抑制劑的RIPA調(diào)整蛋白濃度至一致。分別加入loading buffer，金屬浴95 ℃ 10 min。對(duì)制備好的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳、常規(guī)轉(zhuǎn)膜。將轉(zhuǎn)好的PVDF膜，用TBST配制的5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，封閉后TBST洗膜10 min×3次，再加兔抗BMP4/BMPR1B抗體(按1 ∶1 000稀釋)4 ℃孵育過夜。TBST漂洗15 min×2次。加HRP酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗，室溫孵育1 h。TBST漂洗后，進(jìn)行ECL化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

Western blot條帶灰度值用Image pro plus軟件測(cè)量,并用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析,Bonferroni法進(jìn)行多個(gè)樣本均數(shù)間多重比較,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMP4陽性細(xì)胞在胃腸道的組織分布特點(diǎn)

采用間接免疫熒光方法雙標(biāo)α-SMA蛋白與BMP4蛋白,結(jié)果顯示:BMP4廣泛分布于8周齡大鼠胃及結(jié)腸全層。

胃腺體、黏膜肌層及肌層均可見大量BMP4分布,而黏膜下層未見明顯BMP4分布。相較于胃腺體,黏膜肌層及肌層BMP4分布更加廣泛,且在胃體外層縱行肌與中層環(huán)形肌交界處BMP4分布相對(duì)更加聚集(見圖1)。

A.胃體BMP4分布(紅);B.胃體平滑肌細(xì)胞(α-SMA標(biāo)記,綠);C,D.BMP4和α-SMA雙標(biāo)圖1 8周齡大鼠胃體BMP4分布特點(diǎn)Figure 1 Distribution of BMP4 in stomach of 8-week old rats

在結(jié)腸中,BMP4蛋白多在分泌后聚集于平滑肌層,黏膜層可見腺體細(xì)胞中由少量BMP4蛋白聚集,黏膜下層未見明顯染色。在結(jié)腸升段平滑肌層可見環(huán)形肌及縱行肌中廣泛分布BMP4,且在環(huán)形肌和縱行肌交界處,BMP4分布更加密集(見圖2A-D)。

A.結(jié)腸升段BMP4分布(紅);B.結(jié)腸平滑肌細(xì)胞(α-SMA標(biāo)記,綠);C,D.結(jié)腸BMP4和α-SMA雙標(biāo)圖2 8周齡大鼠結(jié)腸升段BMP4分布特點(diǎn)Figure 2 Distribution of BMP4 in ascending colon of 8-week old rats

2.2 BMPR1B陽性細(xì)胞在胃腸道的組織分布特點(diǎn)

結(jié)果顯示:BMP4蛋白受體BMPR1B在8周齡胃體和結(jié)腸升段中均有分布,且在胃體和結(jié)腸升段分布呈現(xiàn)一定的特異性。

在胃體中,共標(biāo)平滑肌α-SMA蛋白與BMPR1B可見,BMPR1B在胃體黏膜層腺體細(xì)胞中廣泛分布,黏膜下層未見明顯分布,肌層中散在分布BMPR1B。在胃體肌層中,外側(cè)縱行肌與中層環(huán)形肌交界處可見較多點(diǎn)狀分布BMPR1B(見圖3)。

在大鼠結(jié)腸升段中,雙標(biāo)α-SMA蛋白與BMPR1B可見,黏膜層和結(jié)腸肌層中有BMPR1B分布,黏膜下層未見明顯染色。黏膜層中,BMPR1B多分布在黏膜腺體細(xì)胞,黏膜肌層未見明顯分布。結(jié)腸升段平滑肌層中可見平滑肌間散在分布BMPR1B(見圖4)。

A.胃體BMPR1B陽性細(xì)胞(紅);B.胃體平滑肌細(xì)胞(α-SMA標(biāo)記,綠);C,D.胃體BMPR1B和α-SMA雙標(biāo)圖3 大鼠胃體BMPR1B分布特點(diǎn)Figure 3 Distribution of BMPR1B in stomach of rats

A.結(jié)腸BMPR1B陽性細(xì)胞(紅);B.結(jié)腸平滑肌細(xì)胞(α-SMA標(biāo)記,綠);C,D.BMPR1B和α-SMA雙標(biāo)圖4 大鼠結(jié)腸升段BMPR1B分布特點(diǎn)Figure 4 Distribution of BMPR1b in rat ascending colon

2.3 BMP4在胃腸道的時(shí)空表達(dá)特點(diǎn)

結(jié)果示BMP4在胃、十二指腸、結(jié)腸均有表達(dá)。

5日齡、3周齡與8周齡大鼠胃體中BMP4蛋白表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=23.6,P<0.05),且5日齡、3周齡大鼠胃體中BMP4表達(dá)水平分別高于8周齡(P<0.05)。5日齡和3周齡大鼠十二指腸BMP4表達(dá)水平分別高于8周齡大鼠,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而5日齡與3周齡大鼠結(jié)腸中BMP4表達(dá)水平未見明顯差異(P>0.05),但表達(dá)水平與8周齡大鼠相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=58.0,P<0.05)。

對(duì)于同一發(fā)育階段大鼠,胃、十二指腸與結(jié)腸BMP4表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F5 d=40.2,P<0.05;F3周=93.8,P<0.05;F8周=13.3,P<0.05)。在5日齡和3周齡大鼠中,胃體與十二指腸BMP4表達(dá)水平均高于結(jié)腸,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖5)。

2.4 BMPR1B在胃腸道的時(shí)空表達(dá)特點(diǎn)

結(jié)果示BMPR1B在胃、十二指腸、結(jié)腸均有表達(dá)(見圖6)。

對(duì)于不同發(fā)育階段大鼠,3周齡大鼠胃體BMPR1B表達(dá)水平高于5日齡及8周齡大鼠,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且3周齡大鼠十二指腸BMPR1B表達(dá)水平同樣高于5日齡及8周齡大鼠,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。5日齡、3周齡與8周齡大鼠結(jié)腸BMPR1B表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=45.1,P<0.05)。

對(duì)于同一發(fā)育階段大鼠不同消化道部位,3周齡與8周齡大鼠胃體BMPR1B表達(dá)水平均高于結(jié)腸,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。5日齡大鼠胃體、十二指腸與結(jié)腸BMPR1B表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=38.4,P<0.05)。

3 討論

骨形態(tài)發(fā)生蛋白屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β家族,包含20種結(jié)構(gòu)類似的蛋白[9]。在細(xì)胞增殖、分化和凋亡過程中,骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族起到至關(guān)重要的作用,如敲除BMP2/4基因?qū)τ谛∈笈咛碚f具有致死性[4,10]。BMP通過與其受體結(jié)合,形成Ⅰ/Ⅱ型絲蘇氨酸激酶受體。Ⅰ型和Ⅱ型受體結(jié)構(gòu)類似,不同的BMP蛋白較為特異地選擇結(jié)合不同類型的BMP受體。激活受體后,BMP通過經(jīng)典通路或非經(jīng)典通路磷酸化下游Smad1/5/8蛋白,參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[11],同時(shí)與其他信號(hào)通路間同樣存在交流[12,13]。

與5日齡比較,*P<0.05;與3周齡比較,△P<0.05;與胃體比較,#P<0.05;與十二指腸比較,▲P<0.05圖5 BMP4蛋白在不同發(fā)育階段大鼠胃、十二指腸、結(jié)腸的表達(dá)水平差異Figure 5 Expression of BMP4 protein in stomach, duodenum and colon of rats with different developmental stages

與5日齡比較,*P<0.05;與3周齡比較,△P<0.05;與胃體比較,#P<0.05;與十二指腸比較,▲P<0.05圖6 BMPR1B蛋白在不同發(fā)育階段大鼠胃、十二指腸、結(jié)腸的表達(dá)水平差異Figure 6 Expression of BMPR1B protein in stomach, duodenum and colon of rats with different developmental stages

臨床研究提示,骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族參與糖尿病諸多并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展[14],如促進(jìn)視網(wǎng)膜病變、心血管病變和糖尿病腎病等并發(fā)癥的發(fā)展[15-17]。BMP4在炎癥、腫瘤和其他消化道疾病發(fā)生發(fā)展的過程中,表達(dá)和分布發(fā)生特定的變化[2,5],在多種消化道及其他組織的腫瘤相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)BMP4具有促進(jìn)腫瘤發(fā)生及侵襲轉(zhuǎn)移的潛能,如肝細(xì)胞肝癌中高表達(dá)BMP4增強(qiáng)了腫瘤的侵襲性而其在胰腺癌中卻表現(xiàn)出雙相作用的特點(diǎn)[8,18]。在消化道疾病中,腸功能紊亂、內(nèi)環(huán)境平衡破壞時(shí),諸如炎癥反應(yīng)、動(dòng)力紊亂及腫瘤發(fā)生等病理狀態(tài),異常表達(dá)的BMP4對(duì)于平滑肌功能可能存在抑制性調(diào)控作用,提示其參與胃腸穩(wěn)態(tài)和動(dòng)力的維持。本研究結(jié)果提示,BMP4及其受體BMPR1B在不同發(fā)育階段大鼠的胃體、十二指腸和結(jié)腸中,廣泛表達(dá)且表達(dá)水平和分布呈現(xiàn)一定的時(shí)空差異性。在胚胎消化道形成過程中,骨形態(tài)發(fā)生蛋白作為重要調(diào)節(jié)因素參與器官分化形成,在胚胎發(fā)育不同階段,BMP4蛋白呈現(xiàn)差異性表達(dá),且參與原腸組織分化與消化道各節(jié)段形成。在小鼠胚胎早期,諸如WNTs、FGFs、NOTCH、Hedgehog通路和BMP信號(hào)通路等均參與到早期消化道形成過程中[19-22]。在這其中,BMP信號(hào)通路直接調(diào)節(jié)或者間接與其他信號(hào)通路作用,調(diào)控內(nèi)胚層的分化[17]。而BMP信號(hào)異常會(huì)導(dǎo)致許多器官發(fā)育不健全,如慢性腎病、成骨不全、骨關(guān)節(jié)炎、肺動(dòng)脈高壓、遺傳性出血性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥、Barrett食管、幼年息肉病等。大鼠出生后早期不能獨(dú)立進(jìn)食,消化道功能尚未完全成熟,隨著3周齡大鼠能夠獨(dú)立進(jìn)食,這種攝食行為的改變促使其胃體、十二指腸及結(jié)腸的功能逐漸完善成熟,與3周齡及8周齡大鼠十二指腸及結(jié)腸BMP4蛋白表達(dá)相較于5日齡大鼠差異性表達(dá)可能相關(guān)。這進(jìn)一步提示在大鼠出生后BMP4的時(shí)間差異性表達(dá)可能參與胃體、十二指腸及結(jié)腸組織功能維持及分化過程。

形態(tài)學(xué)結(jié)果提示,BMP4蛋白主要由消化道上皮及腺體細(xì)胞分泌,其受體BMPR1B主要在黏膜層,消化道肌層散在分布。BMP4的這種分泌特點(diǎn)決定其不僅作用于分泌細(xì)胞本身,也對(duì)臨近細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生影響。在胃體免疫熒光雙標(biāo)染色可見,BMPR1B在黏膜層大量分布,肌層散在分布。在結(jié)腸升段中,BMP4受體主要分布在黏膜層,平滑肌層散在分布。在胚胎腸道發(fā)育階段,BMP4協(xié)同Hedghog通路相關(guān)蛋白參與消化道環(huán)形肌和縱行肌分化,而在出生后不同階段的差異表達(dá)和分布特點(diǎn)提示BMP4參與胃體及結(jié)腸平滑肌正常功能的維持。

綜上,BMP4蛋白除在胚胎發(fā)育階段對(duì)消化道形成分化起調(diào)控作用,在大鼠出生后腸道功能完善及維持的過程中,BMP4可能也起到重要作用。BMP4不僅參與正常組織細(xì)胞功能維持和分化,也參與消化道疾病的發(fā)生發(fā)展調(diào)控,因此對(duì)其在不同發(fā)育階段大鼠消化道中的分布表達(dá)研究具有一定的臨床提示意義。本研究通過研究BMP4及其受體在大鼠不同發(fā)育階段胃腸道分布表達(dá)特點(diǎn)并結(jié)合既往研究結(jié)果,為研究胃腸炎性疾病以及胃腸道腫瘤提供新的潛在靶點(diǎn)。