印辰宇,季愛平,季海明,劉藝春,楊海峰

(1江蘇省泰興市人民醫(yī)院神經(jīng)外科,泰興 225400;2華中科技大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院神經(jīng)外科;*通訊作者,E-mail:hfwhstongji2016@126.com)

顱內(nèi)動脈瘤主要發(fā)生在顱內(nèi)動脈分叉部位,是動脈血管壁由于血管平滑肌細(xì)胞凋亡引起的瘤樣凸起[1,2]。動脈瘤破裂是蛛網(wǎng)膜下腔出血的主要病因,患者死亡率較高且預(yù)后較差[3,4]。探究動脈瘤的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制,對預(yù)防和治療動脈瘤至關(guān)重要。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一類長度超過200個核苷酸的無編碼功能的單鏈RNA,近年來動脈瘤的分子研究發(fā)現(xiàn)lncRNA與動脈瘤的發(fā)病密切相關(guān)[5]。lncRNA通過調(diào)節(jié)基因表達(dá),影響血管平滑肌細(xì)胞的功能,介導(dǎo)動脈瘤的發(fā)生和發(fā)展[6]。同時,血清中特異性表達(dá)的lncRNA可作為動脈瘤形成的分子標(biāo)志物[7]。LINC01359為lncRNA之一,存在于人血清中,可能成為肝癌非侵襲的標(biāo)志物[8]。然而,LINC01359與動脈瘤的關(guān)系尚不清楚。本研究旨在分析LINC01359在動脈瘤患者血清中的表達(dá)水平,探究LINC01359對血管平滑肌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及可能的分子調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株和試劑

人血管平滑肌細(xì)胞(HVSMC)購自中國科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。含有si-LINC01359序列的人重組慢病毒載體MCS-CMV-si、空載病毒MCS-CMV、LINC01359野生型及突變型重組雙熒光素酶報告載體(LINC01359-WT、LINC01359-Mut)、miR-504-5p模擬物及對照物,購自上海吉凱生物技術(shù)有限公司。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國GIBOCO公司。雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒和MTS試劑盒購自美國Promega公司。實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)試劑盒購于日本Takara公司。Annexin Ⅴ/7-AAD雙染法檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。一抗(Bak、β-actin、Caspase-9、Bcl-xL和Bcl-w)購于美國Abcam公司。

1.2 臨床資料

納入2019年7月至2021年4月間江蘇省泰興市人民醫(yī)院神經(jīng)外科診治的顱內(nèi)動脈瘤患者40例,其中男27例,女13例,年齡43-73歲,平均(61.35±15.52)歲;同期收集40例本醫(yī)院體檢中心無顱內(nèi)動脈瘤者為健康組,其中男21例,女19例,年齡48-79歲,平均(66.18±12.56)。顱內(nèi)動脈瘤患者均經(jīng)數(shù)字減影血管造影確診。本研究經(jīng)本醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn),患者和健康體檢者均簽署知情同意書。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和慢病毒感染

常規(guī)復(fù)蘇HVSMC細(xì)胞,用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)(37 ℃、5% CO2)。將對數(shù)生長期的HVSMC細(xì)胞接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板,設(shè)置感染復(fù)數(shù)(MOI=80),分別感染重組慢病毒載體MCS-CMV-si(si-LINC01359組)或空載病毒MCS-CMV(空白對照組)。感染后96 h,熒光顯微鏡評估轉(zhuǎn)染效率。

1.4 qRT-PCR檢測LINC01359和miR-504-5p的表達(dá)水平

TRIzol法提取血清或者細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。建立qRT-PCR反應(yīng)體系,循環(huán)擴(kuò)增30次。引物序列如下,miR-504-5p正向:5′-TCTACACAGGTTGGGATCGG-3′,反向:5′-CGGGACAAGTGCAATACCATA-3′;U6正向:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,反向:5′-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。GAPDH正向:5′-GTCATCCCTGAGCTGAACGG-3′,反向:5′-CCACCTGGTGCTCAGTGTAG-3′;LINC01359正向:5′-TGGCTATTTCAGGTCCCTTG-3′,反向:5′-TGAGCTGAGATCATGCAACC-3′。LINC01359表達(dá)水平以GAPDH為內(nèi)參,miR-504-5p表達(dá)水平以U6為內(nèi)參。所得循環(huán)值經(jīng)2-ΔΔCt法計算LINC01359和miR-504-5p表達(dá)水平。

1.5 MTS法檢測細(xì)胞活力

取空白對照組和si-LINC01359組對數(shù)生長期HVSMC細(xì)胞,以約5×103個細(xì)胞/孔接種于96孔板,每組5個平行復(fù)孔。加入30 μl/孔的MTS試劑,培養(yǎng)箱內(nèi)靜置3 h,調(diào)節(jié)酶標(biāo)儀波長為490 nm,讀取每孔光密度(OD)值,取平均值。分別在24,48,72,96 h用MTS法檢測細(xì)胞活力。

1.6 Annexin Ⅴ/7-AAD雙染法檢測細(xì)胞凋亡率

胰蛋白酶消化收集空白對照組和si-LINC01359組對數(shù)生長期的HVSMC細(xì)胞,PBS溶液洗3次,加入150 μl結(jié)合緩沖液重懸,加入10 μl Annexin Ⅴ-PE溶液混勻,加入10 μl 7-AAD溶液混勻,避光孵育20 min。加入200 μl結(jié)合緩沖液,采用流式細(xì)胞儀分析空白對照組和si-LINC01359組細(xì)胞凋亡變化。

1.7 生物信息學(xué)方法和雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烆A(yù)測和驗證LINC01359的靶基因

通過生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫Starbase預(yù)測LINC01359的潛在作用靶點(diǎn)。分別轉(zhuǎn)染LINC01359-WT、LINC01359-Mut與miR-504-5p模擬物或miR-504-5p對照物至HVSMC細(xì)朎,共轉(zhuǎn)染48 h。通過雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測每組HVSMC細(xì)胞的相對熒光素酶活性。

1.8 Western blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白含量

通過細(xì)胞裂解液提取空白對照組和si-LINC01359組對數(shù)生長期細(xì)胞總蛋白,每組取30 μg體系在十二烷基聚丙烯酰胺凝膠中電泳,硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)膜,在6%脫脂牛奶中封閉3 h。以1 ∶2 000的比例稀釋一抗,4 ℃孵育16 h,在37 ℃下二抗(1 ∶7 000稀釋比例)孵育3 h。采用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑顯影,在凝膠成像儀中成像并拍照。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 動脈瘤患者血清中LINC01359表達(dá)水平

qRT-PCR結(jié)果顯示,動脈瘤患者和健康組血清中LINC01359相對表達(dá)分別為7.76±1.17和0.95±0.27,動脈瘤患者血清LINC01359表達(dá)水平較健康對照顯著升高(P<0.01,見圖1)。

與健康組比較,**P<0.01圖1 動脈瘤組患者和健康組血清中LINC01359的相對表達(dá)Figure 1 The relative expression of LINC01359 in the serum of patients with aneurysm and healthy controls

2.2 重組慢病毒載體在HVSMC細(xì)胞中的綠色熒光蛋白表達(dá)及感染效率

將重組慢病毒載體感染HVSMC細(xì)胞,熒光顯微鏡下觀察每組細(xì)胞的熒光表達(dá),綠色熒光代表感染成功(見圖2)?？瞻讓φ战M和si-LINC01359組培養(yǎng)基中LINC01359相對表達(dá)分別為5.53±0.37和1.09±0.15,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),說明構(gòu)建的重組慢病毒載體MCS-CMV-si能夠抑制LINC01359表達(dá)。

圖2 空白對照組和si-LINC01359組熒光檢測Figure 2 Fluorescence staining in blank control group and si-LINC01359 group

2.3 低表達(dá)LINC01359對HVSMC細(xì)胞增殖的影響

MTS法結(jié)果顯示,各組HVSMC細(xì)胞在處理后48,72,96 h,si-LINC01359組的OD值明顯低于空白對照組(P<0.05,見圖3),說明低表達(dá)LINC01359能夠有效抑制HVSMC細(xì)胞的增殖。

2.4 低表達(dá)LINC01359對細(xì)胞凋亡率的影響

流式細(xì)胞儀檢測HVSMC細(xì)胞凋亡率顯示,si-LINC01359組和空白對照組HVSMC細(xì)胞凋亡率分別為(21.86±4.97)%和(54.18±4.96)%,si-LINC01359組較空白對照組細(xì)胞凋亡率明顯減低(P<0.01,見圖4)。

與空白對照組相比,*P<0.05,**P<0.01圖3 MTS法檢測各組HVSMC細(xì)胞增殖率的改變Figure 3 Proliferation rate of HVSMCs in each group detected by MTS method

圖4 Annexin Ⅴ/7-AAD雙染法檢測各組細(xì)胞凋亡率Figure 4 Apoptosis rate in each group detected by Annexin Ⅴ/7-AAD double staining method

2.5 LINC01359靶基因分析和雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?/h3>

通過生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫Starbase分析顯示LINC01359的潛在靶基因可能是miR-504-5p(見圖5)。雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示,共轉(zhuǎn)染LINC01359-WT和miR-504-5p模擬物的細(xì)胞相對熒光素酶活性較共轉(zhuǎn)染LINC01359-WT和miR-504-5p對照物的相對熒光素酶活性降低(0.29±0.03vs1.07±0.17,P<0.01),而共轉(zhuǎn)染LINC01359-Mut和miR-504-5p模擬物的細(xì)胞相對熒光素酶活性較共轉(zhuǎn)染LINC01359-Mut和miR-504-5p對照物的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(1.10±0.16vs1.03±0.10,P>0.05)。

圖5 LINC01359與miR-504-5p的結(jié)合位點(diǎn)Figure 5 The binding site of LINC01359 and miR-504-5p

2.6 低表達(dá)LINC01359對HVSMC細(xì)胞中miR-504-5p表達(dá)的影響

qRT-PCR結(jié)果顯示,si-LINC01359組HVSMC細(xì)胞miR-504-5p相對水平高達(dá)6.26±0.81,而空白對照組HVSMC細(xì)胞miR-504-5p相對表達(dá)僅1.03±0.27,即低表達(dá)LINC01359可上調(diào)HVSMC細(xì)胞miR-504-5p相對表達(dá)(P<0.01)。

2.7 低表達(dá)LINC01359對凋亡相關(guān)蛋白含量的影響

Western blot結(jié)果顯示,與空白對照組相比,低表達(dá)LINC01359的細(xì)胞中抗凋亡因子Bcl-xL和Bcl-w蛋白表達(dá)增多,促凋亡因子Bak和Caspase-9蛋白表達(dá)降低(見圖6)。

圖6 Western blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)Figure 6 Expression of apoptosis-related proteins detected by Western blot

3 討論

血管平滑肌細(xì)胞是構(gòu)成血管壁的主要細(xì)胞,在維持血管的張力和調(diào)節(jié)血管的重塑方面發(fā)揮重要作用[9]。血管平滑肌細(xì)胞的凋亡,引起血管內(nèi)皮功能破壞,是動脈瘤形成的關(guān)鍵因素[10]。lncRNA表達(dá)異常是介導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞功能障礙,誘發(fā)動脈瘤發(fā)病的關(guān)鍵因子[11]。Xu等[12]研究發(fā)現(xiàn),顱內(nèi)動脈瘤患者的血液中l(wèi)ncRNA HIF1A-AS1表達(dá)水平上調(diào),其表達(dá)水平與顱內(nèi)動脈瘤呈正相關(guān),lncRNA HIF1A-AS1過表達(dá)抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖。Man等[13]研究發(fā)現(xiàn),血清lncRNA GASL1表達(dá)下調(diào)可有效區(qū)分顱內(nèi)動脈瘤患者與健康志愿者,lncRNA GASL1過表達(dá)促進(jìn)人血管平滑肌細(xì)胞增殖并下調(diào)轉(zhuǎn)化生長因子-β1的表達(dá)。最近研究表明,LINC01359在肝癌患者血清中表達(dá)顯著上調(diào),是肝癌診斷和進(jìn)展的生物標(biāo)志物[8]。但LINC01359是否能夠影響動脈瘤的形成并不明確。

本研究結(jié)果顯示,動脈瘤患者血清中LINC01359表達(dá)明顯高于健康體檢者,LINC01359可能成為動脈瘤的血清標(biāo)志物,其在動脈瘤的形成過程中可能發(fā)揮負(fù)面效應(yīng)。血管平滑肌細(xì)胞的增殖與凋亡的平衡對維持血管內(nèi)皮功能的穩(wěn)定具有重要意義,調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞的增殖和凋亡是研究動脈瘤預(yù)防、診療和預(yù)后的有效方法[14,15]。本研究通過慢病毒感染敲低LINC01359表達(dá),LINC01359低表達(dá)能夠有效抑制HVSMC細(xì)胞的凋亡并促進(jìn)其增殖。lncRNA通過與靶基因微小RNA(miRNA)結(jié)合配對,負(fù)向調(diào)控靶基因miRNA的表達(dá),參與血管平滑肌細(xì)胞的凋亡、增殖等活動[16,17]。本研究通過Starbase數(shù)據(jù)庫預(yù)測,LINC01359的靶基因miRNA可能是miR-504-5p。雙熒光素素酶報告基因證實LINC01359可結(jié)合配對miR-504-5p。已有的研究[18]發(fā)現(xiàn),miR-504-5p在動脈瘤患者的血管平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)降低,miR-504-5p過表達(dá)顯著上調(diào)抗凋亡因子的表達(dá)、下調(diào)促凋亡因子的表達(dá),發(fā)揮明顯的抗凋亡作用,同時miR-504-5p可促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的增殖。本研究顯示,抑制LINC01359表達(dá)后,miR-504-5p的表達(dá)顯著增加,表明LINC01359通過調(diào)節(jié)miR-504-5p表達(dá)發(fā)揮作用。本研究Wes-tern blot顯示,低表達(dá)LINC01359的細(xì)胞中抗凋亡因子Bcl-xL和Bcl-w蛋白表達(dá)增多,促凋亡因子Bak和Caspase-9蛋白表達(dá)降低,進(jìn)一步證實了HVSMC細(xì)胞中LINC01359的抗凋亡作用。

綜上所述,本研究證實動脈瘤患者血清中LINC01359表達(dá)顯著升高,LINC01359高表達(dá)與動脈瘤的形成密切相關(guān)。敲低LINC01359通過有效提高miR-504-5p的表達(dá)水平,促進(jìn)HVSMC細(xì)胞的增殖并抑制HVSMC細(xì)胞的凋亡發(fā)生。LINC01359在血管平滑肌細(xì)胞中的功能研究為動脈瘤的發(fā)生機(jī)制研究提供了新的思路。