楊梓瑩，曾 瑩，劉虹虹，覃 藍(lán)

（梧州市食品藥品檢驗(yàn)所，廣西梧州 543002）

金黃色葡萄球菌是一種常見(jiàn)的食源性致病微生物，在人們?nèi)粘Ｉ钪须S處可見(jiàn)，如空氣、水、灰塵及人和動(dòng)物的排泄物中等。在一定的條件下，金黃色葡萄球菌會(huì)產(chǎn)生腸毒素，引起食物中毒。食品在空氣中暴露的時(shí)間越久，受到金黃色葡萄球菌的污染概率就越高。金黃色葡萄球菌污染食品的途徑一般有以下幾點(diǎn)：①食品加工相關(guān)人員或銷(xiāo)售人員攜帶有細(xì)菌，造成人為的食品污染；②食品在加工前已經(jīng)帶菌，或在加工過(guò)程中受到了二次污染，產(chǎn)生了腸毒素；③熟食制品在運(yùn)輸過(guò)程中包裝破損，受到外界的污染；④供食用的禽畜局部化膿時(shí)，對(duì)肉體其他部位的污染。因此，食品中金黃色葡萄球菌的計(jì)數(shù)檢測(cè)對(duì)防控由金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒具有一定的重要性。

目前我國(guó)對(duì)食品中金黃色葡萄球菌計(jì)數(shù)檢測(cè)主要有2種方法：①《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》（GB 4789.10—2016）第二法 金黃色葡萄球菌平板計(jì)數(shù)法；②《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》（GB 4789.10—2016）第三法 金黃色葡萄球菌MPN計(jì)數(shù)法[1-2]。其中第二法Baird-Parker平板計(jì)數(shù)是最常用的。本研究中采用的TEMPO/STA，是一種可快速檢測(cè)食品中金黃色葡萄球菌的計(jì)數(shù)方法，使用TEMPO全自動(dòng)微生物定量檢測(cè)儀，其原理是將待檢的樣品和培養(yǎng)基按比例混勻后，通過(guò)TEMPO填充器傳輸?shù)?種不同規(guī)格的48孔卡片中?？ㄆ瑑?nèi)的培養(yǎng)基含有pH熒光指示劑，pH值達(dá)到中性時(shí)能夠產(chǎn)生被TEMPO讀數(shù)器檢測(cè)到的熒光信號(hào)[2-4]。在培養(yǎng)的過(guò)程中金黃色葡萄球菌會(huì)分解培養(yǎng)基，使培養(yǎng)基因?yàn)樘妓衔锎x而酸化，pH值數(shù)值的下降會(huì)讓熒光信號(hào)消失，得到陽(yáng)性結(jié)果。按照MPN方法的原理，TEMPO系統(tǒng)根據(jù)陽(yáng)性孔的數(shù)目和大小來(lái)推算出原始樣本中的金黃色葡萄球菌數(shù)，以CFU/g（mL）報(bào)告[5]。

本研究通過(guò)同時(shí)采用TEMPO/STA法和Baird-Parker平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)食品中金黃色葡萄球菌，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行比較分析，旨在探求一種高效快速的檢驗(yàn)檢測(cè)方法，在縮短檢驗(yàn)檢測(cè)周期的同時(shí)降低人為因素影響，又適用于微生物實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)要求，對(duì)食品中金黃色葡萄球菌的快速檢測(cè)提供一定的參考意見(jiàn)。

1 材料與方法

1.1 試劑與培養(yǎng)基

TEMPO金黃色葡萄球菌計(jì)數(shù)卡，biomerieux SA；TEMPO金黃色葡萄球菌培養(yǎng)基，biomerieux SA；Baird-Parker瓊脂、亞碲酸鉀卵黃增菌液、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB），廣東環(huán)凱微生物科技有 限 公 司；BioBallRe-Hydration Fluid，biomerieux SA；氯化鈉，廣東光華科技股份有限公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株

BioBall金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，NCTC 10788 10E8 x10），購(gòu)于biomerieux SA；表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）CMCC（B）26069，購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.3 設(shè)備

全自動(dòng)壓力滅菌器，山東新華醫(yī)療器械股份有限公司；智能生化培養(yǎng)箱，上海比朗儀器制造有限公司；拍擊式均質(zhì)器，天津市恒奧科技發(fā)展有限公司；漩渦混合器，美國(guó)Thermo Fisher；重量稀釋儀，biomerieux SA；TEMPO充填器、TEMPO讀數(shù)器，biomerieux SA。

1.4 樣品類(lèi)型

本研究選取了114個(gè)食品樣品，樣品種類(lèi)包括熟肉制品、糕點(diǎn)、方便食品、調(diào)味品及其他類(lèi)（包含飲料、果凍等樣品），以代表各類(lèi)食品樣品。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 樣品制備

標(biāo)準(zhǔn)菌株菌懸液制備。（a）陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)菌株菌懸液：將標(biāo)準(zhǔn)菌株BioBall金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureusNCTC 10788用BioBall Re-Hydration Fluid復(fù)蘇后，無(wú)菌操作制成10倍遞增稀釋的菌懸液。（b）陰性標(biāo)準(zhǔn)菌株菌懸液：將標(biāo)準(zhǔn)菌株表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）CMCC（B）26069 用TSB復(fù)活后，無(wú)菌操作制成10倍遞增的菌懸液。

將上述制備的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)菌株菌懸液和陰性標(biāo)準(zhǔn)菌株菌懸液分別加入自然樣品制備的1∶10供試液中，分別作為陽(yáng)性樣品菌懸液和陰性樣品菌懸液。

1.5.2 自然樣品制備

樣品制備按照GB 4789.10—2016[1]方法。無(wú)菌操作取25 g（mL）樣品于無(wú)菌過(guò)濾袋中，加入225 mL生理鹽水，拍擊均質(zhì)，制成1∶10供試液，再依次稀釋成10倍遞增稀釋液，同時(shí)用于Baird-Parker平板計(jì)數(shù)法和TEMPO/STA法的測(cè)定。

1.5.3 樣品檢測(cè)

（1）Baird-Parker平板計(jì)數(shù)法[1]。選擇適合樣品稀釋度的陽(yáng)性菌懸液、陰性樣品菌懸液和自然樣品供試液，吸取1 mL，以0.3 mL、0.3 mL和0.4 mL接種量分別加入3塊Baird-Parker平板中，然后用無(wú)菌L棒涂布均勻，置于培養(yǎng)箱內(nèi)，（36 ±1） 培養(yǎng)（48±2） h。

（2）TEMPO/STA法。向TEMPO金黃色葡萄球菌卡片培養(yǎng)基里加入3.0 mL或3.9 mL滅菌水溶解干粉培養(yǎng)基，精確加入1.0 mL或0.1 mL 比例1∶10標(biāo)準(zhǔn)菌株菌懸液和自然樣品供試液，充分混勻，將樣品制成1∶40（計(jì)數(shù)范圍為10～4.9×104CFU/g）或 1∶ 400（計(jì)數(shù)范圍為 10～ 4.9×105CFU/g）的TEMPO/STA測(cè)試卡。將制備好的TEMPO/STA培養(yǎng)卡放進(jìn)培養(yǎng)箱內(nèi)，（36±1） 培養(yǎng)24 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株的添加試驗(yàn)

2.1.1 陽(yáng)性樣品的添加試驗(yàn)

將1.5.1制備的陽(yáng)性樣品菌懸液同時(shí)采用TEMPO/STA法和Baird-Parker平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行檢測(cè)，將檢測(cè)結(jié)果作差異性比較，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，2種方法對(duì)添加標(biāo)準(zhǔn)菌株的陽(yáng)性樣品的檢測(cè)結(jié)果經(jīng)t檢驗(yàn)無(wú)明顯差異。

表1 2種方法對(duì)陽(yáng)性樣品添加試驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果

2.1.2 陰性樣品的添加試驗(yàn)

將1.5.1制備的陰樣品菌懸液同時(shí)采用TEMPO/STA法和Baird-Parker平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行檢測(cè)，將檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行差異性比較，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，2種方法對(duì)添加標(biāo)準(zhǔn)菌株的陰性樣品的檢測(cè)結(jié)果一致，說(shuō)明TEMPO/STA法的高準(zhǔn)確度以及高特異性，降低了檢驗(yàn)過(guò)程中食品中金黃色葡萄球菌出現(xiàn)假陽(yáng)性或者假陰性的風(fēng)險(xiǎn)。

表2 2種方法對(duì)陰性樣品添加試驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果

2.2 自然樣品的檢測(cè)試驗(yàn)

將1.5.2制備的自然樣品供試液用TEMPO/STA法和Baird-Parker平板計(jì)數(shù)法同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)比較，將檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行符合率比較，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 2種方法檢測(cè)自然樣品的符合率

由表3可知，TEMPO/STA法和Baird-Parker平板計(jì)數(shù)法對(duì)自然樣品的檢測(cè)在檢測(cè)結(jié)果上總符合率達(dá)到96.5%，說(shuō)明這2種方法之間無(wú)顯著性差異。114個(gè)自然樣品中僅有4個(gè)樣品的檢測(cè)結(jié)果不一致，這可能是由于：①pH值的影響；②樣品顏色過(guò)深影響讀數(shù)器結(jié)果判定；③樣品油脂過(guò)多。

3 討論

目前GB 4789.10—2016是我國(guó)對(duì)食品中金黃色葡萄球菌定量檢測(cè)的主要方法，實(shí)驗(yàn)的基本操作流程為樣品的無(wú)菌取樣、均質(zhì)和稀釋?zhuān)坎计桨澹囵B(yǎng)，確證計(jì)數(shù)。微生物基本操作方法需要花費(fèi)大量的實(shí)驗(yàn)人員和實(shí)驗(yàn)耗材，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的人為操作誤差也會(huì)比較大，而且在挑選可疑菌落并確證過(guò)程中，依賴的是實(shí)驗(yàn)人員專(zhuān)業(yè)知識(shí)的判斷，易產(chǎn)生主觀上的錯(cuò)判或者漏判，因此會(huì)增加或者降低試驗(yàn)結(jié)果確證的不確定性，導(dǎo)致最終結(jié)果報(bào)告存在誤差。

TEMPO/STA法是一種全新的基于MPN原理的全自動(dòng)微生物定量檢測(cè)法，與傳統(tǒng)的MPN計(jì)數(shù)檢驗(yàn)方法相比有著顯著優(yōu)勢(shì)，單個(gè)稀釋級(jí)的重復(fù)管數(shù)為16個(gè)，總管數(shù)48個(gè)，結(jié)果精密度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的9管法MPN值測(cè)定法。相比傳統(tǒng)的金黃色葡萄球菌定量檢測(cè)方法，TEMPO/STA法具有全面自動(dòng)化的特點(diǎn)，加樣填充、讀數(shù)均由儀器完成，簡(jiǎn)化了手工操作步驟的同時(shí)也降低了不同實(shí)驗(yàn)人員因?yàn)椴僮魇炀毘潭群蛯?shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)不同而導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)誤差，提高了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度。TEMPO/STA法還具有縮短檢測(cè)周期、減少人為因素影響的優(yōu)點(diǎn)，并且每張TEMPO/STA測(cè)試卡面都有唯一的條形碼，可確保檢測(cè)結(jié)果的獨(dú)立性和可溯源性。

本研究采用TEMPO/STA法和Baird-Parker平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)114個(gè)不同類(lèi)型的自然樣品中的金黃色葡萄球菌，雖然2種方法的檢測(cè)原理不同，但檢測(cè)結(jié)果顯示符合率高達(dá)96.5%，說(shuō)明這2種檢測(cè)方法之間不存在顯著性差異。

4 結(jié)論

TEMPO/STA法作為一種全新的全自動(dòng)微生物定量檢測(cè)法，其檢測(cè)結(jié)果與Baird-Parker平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)結(jié)果符合率達(dá)96.5%，且實(shí)驗(yàn)過(guò)程操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度高，能保證檢測(cè)結(jié)果的唯一性和溯源性，可廣泛應(yīng)用于食品中金黃色葡萄球菌的檢測(cè)。