李 煜，黃美山，程琳琳

（無(wú)限極（營(yíng)口）有限公司，遼寧營(yíng)口 115000）

維生素B2又稱核黃素，作為營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑或者是功能調(diào)節(jié)因子被廣泛用于保健食品和藥品當(dāng)中[1]。因此，客觀、科學(xué)、準(zhǔn)確、高效地測(cè)定維生素B2含量對(duì)政府監(jiān)督管理和企業(yè)質(zhì)量控制都有非常重要的意義。

目前，國(guó)標(biāo)采用的高效液相色譜-熒光檢測(cè)法[2]，前處理煩瑣、檢測(cè)周期長(zhǎng)、成本高，不適用于基質(zhì)相對(duì)簡(jiǎn)單的保健食品。中國(guó)藥典采用的高效液相色譜-紫外檢測(cè)法[3]，前處理簡(jiǎn)單，但適用于成分單一的維生素B2片，對(duì)于添加多種維生素和礦物質(zhì)的保健食品，其分析效果并不理想。另外，近年來(lái)也有高效液相色譜-紫外檢測(cè)法測(cè)定維生素B2含量的相關(guān)文獻(xiàn)[4-14]，由于維生素B2在反相色譜柱上的保留能力較差，文獻(xiàn)中大多在流動(dòng)相中加入離子對(duì)試劑以改善峰形和分離度，但使用離子對(duì)試劑后平衡時(shí)間長(zhǎng)且對(duì)色譜柱傷害大。

本文建立了一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、靈敏的高效液相色譜-紫外檢測(cè)法，流動(dòng)相不加入離子對(duì)試劑，適用于保健食品中維生素B2的定量檢測(cè)，顯著提高效率、降低成本。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

e2695高效液相色譜儀，配紫外檢測(cè)器（美國(guó)Waters公司）；SQP分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；FE28 pH計(jì)（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；KQ-500VDB型超聲波振蕩器（昆山市超聲儀器有限公司）。

乙腈（色譜純，德國(guó)Merck公司）；三水磷酸氫二鉀（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；冰乙酸（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；維生素B2標(biāo)準(zhǔn)品（CAS號(hào)83-88-5，純度：96.8%，美國(guó)CATO公司，批號(hào)：CCFD200001-1901）。

本試驗(yàn)中的多種維生素礦物質(zhì)片由無(wú)限極（營(yíng)口）有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18（4.6 mm×150 mm，2.7 μm）；流速：0.8 mL/min；柱溫：25 ；檢測(cè)波長(zhǎng)：268 nm；進(jìn)樣體積：5 μL；流動(dòng)相A：乙腈；流動(dòng)相B：25 mmol/L磷酸氫二鉀溶液（用磷酸調(diào)至pH 5.0～7.0），梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

（1）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確稱取10 mg維生素B2，置于100 mL棕色容量瓶中，加入0.012 mol/L鹽酸溶液，50 水浴超聲溶解后定容，混勻。在4 下可保存2個(gè)月。該標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的濃度為100 μg/mL。

（2）標(biāo)準(zhǔn)系列工作液。分別吸取維生素B2標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ) 備 液 1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、5.00 mL和8.00 mL，用水定容至10 mL，臨用前現(xiàn)配。該標(biāo)準(zhǔn)系列濃度分別為10.0 μg/mL、20.0 μg/mL、30.0 μg/mL、50.0 μg/mL 和 80.0 μg/mL。

1.2.3 樣品前處理

稱取均質(zhì)后的試樣0.5 g（精確至0.001 g）于25 mL容量瓶中，加入1%冰乙酸-5%乙腈水溶液適量，65 水浴超聲使試樣充分勻散（約2 min），繼續(xù)加入1%冰乙酸-5%乙腈水溶液至接近刻度線，65水浴超聲（功率500 W、頻率45 kHz）至提取完全（約30 min），冷卻至室溫，加1%冰乙酸-5%乙腈水溶液定容至刻度，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，即得。

1.2.4 方法學(xué)考察

（1）線性關(guān)系試驗(yàn)。將標(biāo)準(zhǔn)系列工作液注入高效液相色譜儀，測(cè)定維生素B2的峰面積。

（2）回收率試驗(yàn)。取已知含量的同一批樣品9份，取樣量減半，按1.5∶1、1∶1、0.5∶1左右加入標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)添加水平各3份樣品，前處理后上機(jī)測(cè)定。

（3）重復(fù)性試驗(yàn)。相同操作者、相同測(cè)量系統(tǒng)、相同操作條件、相同地點(diǎn)，并在短時(shí)間內(nèi)對(duì)3種不同濃度（各6份），共18份樣品進(jìn)行測(cè)定。

（4）中間精密度試驗(yàn)。不同日期、不同分析人員、不同儀器，對(duì)同一批樣品各進(jìn)行6次平行測(cè)定。

（5）檢出限和定量限試驗(yàn)。先上機(jī)測(cè)定試劑空白，測(cè)出噪音值，再上機(jī)測(cè)定已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)響應(yīng)值將標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋。以3倍信噪比時(shí)的濃度作為檢出限；以10倍信噪比時(shí)的濃度作為定量限，取6份空白樣品，加入定量限濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，前處理后上機(jī)測(cè)定。

（6）穩(wěn)定性試驗(yàn)。取同一批樣品前處理后，分別放置0 h、6 h、12 h、24 h、36 h和48 h后上機(jī)測(cè)定。

（7）樣品測(cè)定。選擇不同濃度的6份樣品，前處理后上機(jī)測(cè)定。同時(shí)使用GB 5009.85—2016第一法進(jìn)行維生素B2的測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶液的選擇

取同一批樣品，分別用25 mmol/L磷酸氫二鉀溶液（pH 7.0）、0.01 mol/L氫氧化鈉溶液、0.02 mol/L氫氧化鈉溶液、1%冰乙酸-5%乙腈水溶液對(duì)樣品進(jìn)行提取，4份樣品溶液同時(shí)上機(jī)測(cè)定。結(jié)果表明，1%冰乙酸-5%乙腈水溶液提取后的樣品溶液含量最高，因此選擇其作為提取溶液。

2.2 水浴溫度的選擇

取同一批樣品，分別用25 、45 、65 水浴超聲提取，3份樣品溶液同時(shí)上機(jī)測(cè)定。結(jié)果表明，65 水浴超聲提取的樣品溶液含量最高且接近理論值，因此選擇其作為水浴溫度。

2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

取同一批樣品前處理后，分別選擇200 nm、220 nm、268 nm、280 nm和444 nm進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，268 nm下目標(biāo)峰面積最大，因此選擇其為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.4 線性關(guān)系試驗(yàn)

以標(biāo)準(zhǔn)系列工作液的峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程：Y=28 500X+46 900，R=0.999 572。結(jié)果表明，維生素B2在10～80 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.5 回收率試驗(yàn)

由表2可知，樣品的回收率為90.1%～100.4%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

表2 樣品的回收率結(jié)果表

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

由表3可知，3種不同濃度樣品的RSD分別為0.74%、1.13%、1.85%（n=6）。表明該方法重復(fù)性良好。

表3 重復(fù)性（n=6）

2.7 中間精密度試驗(yàn)

由表4可知，2位人員對(duì)同一批樣品檢測(cè)的RSD為2.58%（n=12）。表明該方法中間精密度良好。

表4 中間精密度（n=12）

2.8 檢出限和定量限試驗(yàn)

標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋到3倍信噪比時(shí)的濃度為0.52 μg/mL，因此檢出限為0.52 μg/mL；標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋到10倍信噪比時(shí)的濃度為3.0 μg/mL，因此定量限為3.0 μg/mL。當(dāng)定容體積為20 mL時(shí)，定量限為0.06 mg。取6份空白樣品，加入0.06 mg維生素B2，對(duì)加標(biāo)樣品進(jìn)行測(cè)定，其回收率為86.7%～90.0%，RSD為1.59%（n=6），表明該定量限的準(zhǔn)確度和精密度良好。樣品回收率和重復(fù)性結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 定量限濃度下的樣品回收率和重復(fù)性結(jié)果（n=6）

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

樣品溶液放置0～48 h測(cè)定結(jié)果的RSD為0.75%（n=6）。表明樣品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 不同放置時(shí)長(zhǎng)的樣品溶液結(jié)果（n=6）

2.10 樣品測(cè)定

由表7可知，取不同濃度的6份樣品，使用本文建立的HPLC-UV方法和國(guó)標(biāo)法分別測(cè)定維生素B2，維生素B2含量的相對(duì)平均偏差均在允許范圍內(nèi) （≤10%）。表明本文建立方法穩(wěn)定可靠。

表7 不同方法測(cè)定的維生素B2含量結(jié)果

3 結(jié)論與討論

本文建立的高效液相色譜法，其線性、準(zhǔn)確度、精密度、穩(wěn)定性等均符合中國(guó)藥典四部9101[15]的要求，該方法操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定可靠，可以作為保健食品中維生素B2的測(cè)定方法。試樣前處理時(shí)，水浴溫度對(duì)結(jié)果影響較大，建議使用帶加熱控溫功能的超聲波振蕩器；對(duì)于成分復(fù)雜、不易提取的試樣，可將超聲時(shí)長(zhǎng)由30 min延長(zhǎng)至60 min；定容后可靜置1～2 h再吸取上清液過(guò)0.45 μm濾膜，過(guò)濾性更好。