田麗娜 顏瓊嫻 鄭夢莉 周傳社,3 譚支良,3

(1.中國科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點實驗室，畜禽養(yǎng)殖污染控制與資源化技術(shù)國家工程實驗室，湖南省畜禽健康養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，動物營養(yǎng)生理與代謝過程湖南省重點實驗室，長沙410125；2.中國科學院大學，北京100049；3.湖南畜禽安全生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，長沙410128)

鋅是反芻家畜必需的微量元素，參與機體多種重要的生物過程，尤其是對調(diào)節(jié)腸道免疫應(yīng)答和維持腸道內(nèi)平衡至關(guān)重要。腸道的屏障功能和免疫應(yīng)答受鋅的添加方式和腸上皮細胞的增殖等因素的影響。鋅在胃腸道屏障功能方面發(fā)揮重要作用[1]，可改善腸道屏障功能，降低腸道通透性[2]。缺鋅導(dǎo)致的腹瀉和黏膜屏障功能障礙[2-4]，可以通過補充氧化鋅(ZnO)得以改善[3]，并且有顯著的治療效果[4]。

近年來，已有少量研究探討了有機鋅和無機鋅在反芻動物體內(nèi)的有效性或相對生物利用率[5-6]。相對于無機鋅，有機鋅有更高的存留率[7]和組織濃度[8]。給腹瀉的新生犢牛飼喂氧化鋅和蛋氨酸螯合鋅(Zn-Met)可以不同程度地緩解腹瀉，并且蛋氨酸螯合鋅組的體重顯著增加[9]；有機鋅來源的蛋氨酸螯合鋅能更有效地提高羔羊[10]以及肉牛[11]的抗氧化應(yīng)激能力和抗體滴度，進而產(chǎn)生更高的細胞和體液免疫應(yīng)答。

雖然在飼糧中添加有機鋅對反芻動物腸道發(fā)育和免疫功能影響的研究不少，但是在妊娠期飼糧中添加有機鋅對子代生長期腸道發(fā)育和免疫的影響還鮮見報道。來自單胃動物的研究發(fā)現(xiàn)，從妊娠第80天至分娩后第14天，在母豬飼糧中添加40 mg/kg的蛋氨酸螯合鋅，增加了斷奶仔豬空腸的黏膜厚度和絨毛高度/隱窩深度，同時提高了母乳中鋅的含量[12]。因此，本試驗通過研究妊娠期母羊飼糧中添加不同鋅源對母羊和羔羊體液免疫及羔羊腸道組織形態(tài)、黏膜免疫功能的影響，旨在為妊娠期反芻家畜飼糧中鋅的補飼方式提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

選取體重(38.1±9.7) kg、胎次(第2～3胎)相近的懷雙羔湘東黑山羊21只，隨機分為3組，每組7個重復(fù)，每個重復(fù)1只羊。各組分別在基礎(chǔ)飼糧中添加60 mg/kg的硫酸鋅(ZnSO4)、蛋氨酸螯合鋅(鋅含量16%)和甘氨酸螯合鋅(Zn-Gly，鋅含量29%)?；A(chǔ)飼糧中鋅含量為22 mg/kg，各試驗飼糧中鋅含量均為82 mg/kg。其中，蛋氨酸螯合鋅螯合強度為2∶1，甘氨酸螯合鋅螯合強度為1∶1。

飼糧參照NRC(2004)妊娠期母羊營養(yǎng)需要量進行配制。試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。預(yù)試期7 d，正試期45 d(妊娠第106天至分娩結(jié)束)。產(chǎn)羔后所有泌乳母羊均飼喂相同的飼糧，不再添加鋅，以消除鋅對哺乳期母羊及后代生長發(fā)育的影響。羔羊出生后第60天斷奶，第100天進行屠宰。泌乳母羊和斷奶羔羊飼糧組成及營養(yǎng)水平見表2。

表1 試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎(chǔ))

續(xù)表1項目Items硫酸鋅組ZnSO4 group蛋氨酸螯合鋅組Zn-Met group甘氨酸螯合鋅組Zn-Gly group粗蛋白質(zhì) CP 17.7617.7617.76粗脂肪 EE2.502.502.50酸性洗滌纖維 ADF29.3029.3029.30中性洗滌纖維 NDF45.4245.4245.42粗灰分 Ash10.4710.4710.47鋅 Zn/(mg/kg)82.0082.0082.00

表2 泌乳母羊和斷奶羔羊飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎(chǔ))

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗在湖南省瀏陽市高坪鎮(zhèn)(遠豐黑山羊養(yǎng)殖場)進行。試驗期間，妊娠母羊單籠飼喂。產(chǎn)羔后，將泌乳母羊和羔羊分開飼養(yǎng)，哺乳時將羔羊放在泌乳山羊的羊圈內(nèi)，哺乳期喂相同飼糧，分別于每天08:00和18:00飼喂，限制飼養(yǎng)，飼糧無剩余，自由飲水。按養(yǎng)殖場的常規(guī)方法對懷孕母羊和分娩期間的羊羔進行免疫接種和消毒。羔羊出生和屠宰時稱重并記錄。

1.3 營養(yǎng)成分分析

采集具有代表性的飼糧和糞樣，依照中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準——《肉羊飼養(yǎng)標準》(NY/T 816—2004)[14]中的方法測定其中營養(yǎng)成分含量。能量使用全自動氧彈量熱儀(PARR-6400，美國Parr Instrument公司)測定，粗蛋白質(zhì)(CP)含量采用全自動凱氏定氮儀(KDY-9830，北京瑞邦興業(yè)科技有限公司)測定，粗脂肪(EE)含量采用全自動脂肪分析儀(ANKOMXT15i，美國ANKOM Technology公司)測定，中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)含量采用自動纖維分析儀(FT12，德國Gerhardt公司)測定。

1.4 樣品收集與保存

在母羊產(chǎn)前第10天及羔羊出生后的第30、60和100天，利用真空采血管[加入含乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝劑]從頸靜脈采血大約10 mL，室溫靜置30 min，4 ℃、3 000 r/min離心15 min，取血漿，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

羔羊宰殺后采集1 cm×1 cm的空腸中段和回腸中段腸段，生理鹽水清洗后，放入裝有30 mL 4%福爾馬林的離心管中，常溫保存，用于腸道組織形態(tài)學觀察；采集2 cm×2 cm的空腸中段和回腸中段腸段，用蓋玻片刮取腸黏膜，用錫箔紙包好投入液氮速凍后放入-80 ℃冰箱保存，用于腸道黏膜免疫球蛋白和細胞因子含量檢測。

1.5 指標測定

1.5.1 血漿和腸道黏膜中免疫球蛋白和細胞因子含量的測定

分別在母羊產(chǎn)前第10天及羔羊出生后的第30、60和100天對血漿中細胞因子[(白細胞介素-2(IL-2)、白細胞介素-4(IL-4)、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-22(IL-22)、白細胞介素-23(IL-23)]和免疫球蛋白[(免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)]以及腸道黏膜中細胞因子(IL-4、IL-6、IL-22、IL-23)和免疫球蛋白[分泌型免疫球蛋白A(sIgA)、IgG、IgM]含量進行測定。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法，試劑盒購自江蘇雨桐生物科技有限公司。將組織勻漿樣本離心后取上清進行測定，在酶標包被板上標準品準確加樣50 μL，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，然后再加待測樣品10 μL(樣品最終稀釋度為5倍)。將樣品加于酶標板孔底部，混勻后用封板膜封板置37 ℃溫箱中溫育30 min，洗滌后拍干，加入酶標試劑50 μL，經(jīng)過孵育和洗滌后加入顯色劑進行顯色15 min后加入終止液。以空白調(diào)零，450 nm波長依序測量各孔的吸光度(OD)值。使用多功能酶標儀(Infinite M200 PRO，奧地利Tecan公司)進行測量。

1.5.2 腸道組織切片制作和組織形態(tài)學觀察

將空腸和回腸固定樣品截取大小不超過5 mm×5 mm，厚度為2 mm左右，然后依次放入75%、80%、90%、100%、100%的乙醇中進行脫水處理；在乙醇與二甲苯(1∶1)混合液浸沒放置2 h，浸入二甲苯中2次，每次10 min，直至透明；分別在二甲苯和石蠟(1∶1)混合液和2杯石蠟中各放置1 h后，將組織樣放入包埋盒中進行包埋；用旋轉(zhuǎn)切片機從每個切片上切出5 μm厚的橫切面。將切片置于聚賴氨酸涂層的載玻片上，然后采用蘇木精-伊紅染色法制作成切片后，在光學顯微鏡下觀察腸道組織形態(tài)，用顯微鏡(Leica MD-4000B，德國Leica Microsystems公司)觀察并拍照，每張切片隨機選取3個視野，對3處視野并用LeicaQwin圖像分析系統(tǒng)進行分析。圖像由Motic Images Plus 6.0軟件進行測量和計算小腸絨毛高度、隱窩深度、絨毛寬度及絨毛高度/隱窩深度。

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用SPSS 18.0軟件進行單因子方差分析(one-way ANOVA)，并采用LSD法進行多重比較，結(jié)果用平均值±標準誤(mean±SE)表示，以P<0.05為差異顯著性判斷標準。

2 結(jié) 果

2.1 飼糧中添加不同鋅源對妊娠母羊采食量的影響

由表3可知，飼糧中添加不同鋅源對妊娠母羊采食量無顯著影響(P>0.05)。

2.2 飼糧中添加不同鋅源對妊娠母羊產(chǎn)前第10天血漿細胞因子和免疫球蛋白含量的影響

由表4可知，妊娠母羊產(chǎn)前第10天，甘氨酸螯合鋅組血漿IL-6和IL-8含量顯著高于硫酸鋅組和蛋氨酸螯合鋅組(P<0.05)。各組之間血漿IL-4、IL-10、IL-22、IL-23、IgA、IgG和IgM含量差異不顯著(P>0.05)。

2.3 妊娠母羊飼糧中添加不同鋅源對不同發(fā)育階段羔羊血清細胞因子和免疫球蛋白含量的影響

由表5可知，羔羊出生后第30天，蛋氨酸螯合鋅組血漿IgG含量顯著高于甘氨酸螯合鋅組(P<0.05)，各組之間血漿IL-4、IL-6、IL-22、IL-23、IL-2、IgA和IgM含量差異不顯著(P>0.05)。羔羊出生后第60天，硫酸鋅組和蛋氨酸螯合鋅組血漿IL-4含量顯著高于甘氨酸螯合鋅組(P<0.05)，蛋氨酸螯合鋅組血漿IL-6、IL-22含量顯著高于硫酸鋅組和甘氨酸螯合鋅組(P<0.05)，甘氨酸螯合鋅組血漿IgG含量顯著高于蛋氨酸螯合鋅組和硫酸鋅組(P<0.05)，各組之間血漿IL-2、IL-23、IgA和IgM含量差異不顯著(P>0.05)。羔羊出生后第100天，各組之間血漿細胞因子和免疫球蛋白含量均差異不顯著(P>0.05)。

表3 飼糧中添加不同鋅源對妊娠母羊采食量的影響

表4 飼糧中添加不同鋅源對妊娠母羊產(chǎn)前第10天血漿細胞因子和免疫球蛋白含量的影響

表5 妊娠母羊飼糧中添加不同鋅源對不同發(fā)育階段羔羊血漿細胞因子和免疫球蛋白含量的影響

續(xù)表5項目Items硫酸鋅組ZnSO4 group蛋氨酸螯合鋅組Zn-Met group 甘氨酸螯合鋅組Zn-Gly groupP值P-value白細胞介素-6 IL-6/(pg/mL)159.60±37.27125.89±16.03108.97±8.830.311白細胞介素-23 IL-23/(pg/mL)197.41±13.77252.17±43.95223.33±21.570.439白細胞介素-22 IL-22/(pg/mL)746.51±51.42941.45±131.48793.06±46.390.637免疫球蛋白A IgA/(μg/mL)195.76±26.99245.99±46.76195.29±36.850.567免疫球蛋白G IgG/(μg/mL)252.27±10.88ab288.68±15.90a239.16±8.66b0.037免疫球蛋白M IgM/(mg/mL)1.63±0.151.79±0.201.37±0.110.182第60天 Day 60白細胞介素-2 IL-2/(pg/mL)758.05±150.101 095.99±168.06913.52±117.160.329白細胞介素-4 IL-4/(pg/mL)43.81±3.51a40.05±9.14a31.63±1.24b0.045白細胞介素-6 IL-6/(pg/mL)135.52±4.24b175.57±22.88a110.26±3.74b0.003白細胞介素-23 IL-23/(pg/mL)210.05±11.67275.40±35.70220.26±11.980.067白細胞介素-22 IL-22/(pg/mL)895.66±105.79b1 257.65±197.00a734.31±33.77b0.018免疫球蛋白A IgA/(μg/mL)152.31±13.26141.44±9.38162.44±8.360.423免疫球蛋白G IgG/(μg/mL)224.41±6.89b219.98±8.00b279.32±11.61a0.001免疫球蛋白M IgM/(mg/mL)1.11±0.101.27±1.031.25±0.140.636第100天 Day 100白細胞介素-2 IL-2/(pg/mL)988.52±174.02915.98±183.001 270.47±110.540.352白細胞介素-4 IL-4/(pg/mL)36.95±3.3930.64±1.0435.25±2.110.293白細胞介素-6 IL-6/(pg/mL)121.57±9.8699.68±17.24112.07±3.360.384白細胞介素-23 IL-23/(pg/mL)121.57±9.8699.68±17.24112.07±3.360.384白細胞介素-22 IL-22/(pg/mL)735.37±37.47582.28±100.05782.64±38.370.074免疫球蛋白A IgA/(μg/mL)155.66±9.98131.54±28.26164.49±13.180.410免疫球蛋白G IgG/(μg/mL)226.09±13.13252.87±2.31255.51±6.190.090免疫球蛋白M IgM/(mg/mL)1.56±0.161.31±0.271.36±0.120.624

2.4 妊娠母羊飼糧中添加不同鋅源對羔羊腸道組織形態(tài)的影響

由表6可知，各組之間羔羊空腸和回腸的絨毛寬度、絨毛高度、隱窩深度和絨毛高度/隱窩深度無顯著差異(P>0.05)。

表6 妊娠母羊飼糧中添加不同鋅源對羔羊腸道組織形態(tài)的影響

2.5 妊娠母羊飼糧中添加不同鋅源對羔羊腸道黏膜免疫球蛋白和細胞因子含量的影響

由表7可知，蛋氨酸螯合鋅組和甘氨酸螯合鋅組空腸黏膜IL-6、IL-22、IL-23和IgG含量顯著高于硫酸鋅組(P<0.05)，甘氨酸螯合鋅組空腸黏膜IL-4含量顯著高于硫酸鋅組和蛋氨酸螯合鋅組(P<0.05)，蛋氨酸螯合鋅組空腸黏膜sIgA含量顯著高于硫酸鋅組和甘氨酸螯合鋅組(P<0.05)。各組之間空腸黏膜IgM含量無顯著差異(P>0.05)。

蛋氨酸螯合鋅組和甘氨酸螯合鋅組回腸黏膜IL-4、IL-6、IL-23、IgM和IgG含量顯著高于硫酸鋅組(P<0.05)，蛋氨酸螯合鋅組回腸黏膜sIgA含量顯著高于硫酸鋅組和甘氨酸螯合鋅組(P<0.05)，且蛋氨酸螯合鋅組回腸黏膜IgM和sIgA含量顯著高于甘氨酸螯合鋅組(P<0.05)。各組回間空腸黏膜IL-22含量無顯著差異(P>0.05)。

表7 妊娠母羊飼糧中添加不同鋅源對羔羊腸道黏膜免疫球蛋白和細胞因子含量的影響

3 討 論

腸道是機體最大的免疫系統(tǒng)，也是營養(yǎng)物質(zhì)進行消化吸收的重要場所，斷奶和固體進食等額外刺激均會對羔羊腸道產(chǎn)生刺激，進而引起應(yīng)激反應(yīng)[15]，導(dǎo)致腹瀉，影響羔羊腸道發(fā)育，降低免疫力。腸道免疫功能主要通過腸黏膜機械屏障、化學屏障、生物屏障和免疫屏障體現(xiàn)。其中，最重要的是機械屏障和免疫屏障，免疫球蛋白和細胞因子的含量能夠反映腸道免疫屏障功能。截止到目前，在妊娠反芻家畜飼糧中添加不同形態(tài)鋅對羔羊腸道黏膜免疫屏障的影響研究報道相對較少。

本試驗中，妊娠母羊產(chǎn)前第10天，甘氨酸螯合鋅組母羊血漿IL-6和IL-8含量增加，表明甘氨酸螯合鋅激活了母羊體內(nèi)的巨噬細胞，巨噬細胞可以通過T輔助細胞激活B細胞，產(chǎn)生響應(yīng)[16]。

免疫球蛋白是反映機體免疫功能的重要指標，主要包括IgG、IgM和IgA。IgA是外分泌體液中的主要抗體，是機體免疫中不可缺少的。本研究發(fā)現(xiàn)，羔羊出生后第30天，蛋氨酸螯合鋅組血漿IgG含量高于另外2組，而血液中含量最多的免疫球蛋白就是IgG，作為血液中的重要抗體，IgG能夠阻止抗原穿過黏膜進入組織中，起到保護腸道黏膜的作用[17]。因此可推測，妊娠母羊飼糧中添加蛋氨酸螯合鋅可以提高1月齡羔羊的被動免疫功能。研究表明，在第21天斷奶的羔羊，斷奶應(yīng)激在之后21 d仍存在[18]。在羔羊出生后第60天斷奶，可能會產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，易造成免疫功能降低，誘發(fā)疾病。然而本研究發(fā)現(xiàn)，羔羊出生后第60天，蛋氨酸螯合鋅和硫酸鋅組血漿IL-4含量高于甘氨酸螯合鋅組，甘氨酸螯合鋅組和硫酸鋅組血漿IL-6和IL-22含量高于蛋氨酸螯合鋅組，且甘氨酸螯合鋅組血漿IgG含量最高。IL-4是典型的多效性抗炎細胞因子[19-20]，抑制IgA分泌，誘導(dǎo)活化B細胞產(chǎn)生IgG和IgM[21-22]，由此可見，有機鋅添加顯著提高了斷奶羔羊的抗炎因子和免疫球蛋白IgG的分泌，改善機體的體液免疫和被動免疫。羔羊出生后第100天，各組血漿細胞因子和免疫球蛋白含量無顯著差異，可能與羔羊體內(nèi)免疫系統(tǒng)已經(jīng)完善有關(guān)。

腸道免疫屏障主要由腸黏膜上皮構(gòu)成，可阻止腸腔內(nèi)細菌和毒素的入侵。腸絨毛高度的增加能夠使小腸吸收營養(yǎng)物質(zhì)的面積增大，隱窩深度反映上皮細胞的生成率，絨毛高度/隱窩深度則綜合反映小腸的功能狀態(tài)。本研究中，母羊妊娠期飼糧中添加不同鋅源對羔羊空腸和回腸絨毛高度和隱窩深度無顯著影響，這與已有研究結(jié)果[23]一致；但是在羔羊空腸中，蛋氨酸螯合鋅組的絨毛高度/隱窩深度低于硫酸鋅組，表明蛋氨酸螯合鋅并不利于促進羔羊空腸的消化吸收。

通過測定羔羊腸道黏膜中免疫球蛋白和免疫因子含量發(fā)現(xiàn)，甘氨酸螯合鋅組空腸黏膜IL-4含量顯著高于硫酸鋅組和蛋氨酸螯合鋅組，甘氨酸螯合鋅組和蛋氨酸螯合鋅組回腸黏膜IL-4含量顯著高于硫酸鋅組，說明在妊娠母羊飼糧中添加有機鋅能夠提高腸道抗炎因子的分泌量，起到抗炎的作用，更有利于羔羊腸道健康。已有研究發(fā)現(xiàn)，微生物在腸道早期定植過程中易誘發(fā)炎癥的發(fā)生。IL-22和IL-23作為功能性連接的細胞因子，二者構(gòu)成一個涉及腸道淋巴細胞的通路，并且在缺乏適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的動物腸上皮細胞中產(chǎn)生抑制炎癥的作用[24]，IL-22[25]和IL-23[26]在腸黏膜固有層中高表達，有助于形成成熟的共生菌群并且維持組織穩(wěn)態(tài)。在小鼠炎癥性腸病的研究中，發(fā)現(xiàn)在腸道感染時，IL-23通過誘導(dǎo)IL-6等細胞因子的分泌來引發(fā)腸道炎癥[27]。本試驗中，甘氨酸螯合鋅組和蛋氨酸螯合鋅組空腸黏膜IL-6、IL-22和IL-23含量顯著高于硫酸鋅組，且蛋氨酸螯合鋅組空腸黏膜IL-22含量高于甘氨酸螯合鋅組；甘氨酸螯合鋅組和蛋氨酸螯合鋅組回腸黏膜IL-6和IL-23含量均顯著高于硫酸鋅組，且蛋氨酸螯合鋅組回腸黏膜IL-22含量高于甘氨酸螯合鋅組。以上結(jié)果表明，妊娠期添加有機鋅相對于無機鋅更有利于羔羊維持腸黏膜共生菌群的穩(wěn)定，抑制炎癥的發(fā)生，并且蛋氨酸螯合鋅優(yōu)于甘氨酸螯合鋅。

腸道淋巴細胞分泌的sIgA是腸道黏膜免疫的主要抗體，其覆蓋在腸道黏膜表面，保護腸道免受病毒微生物的攻擊，對激活黏膜免疫和維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)有著重要作用，腸腔中的sIgA可以與相應(yīng)抗原結(jié)合，抑制細菌增殖和中和毒素，保護腸道黏膜[28]。IgG和IgM是由腸道黏膜上皮細胞分泌的免疫球蛋白，在炎癥反應(yīng)的發(fā)病機制中起到保護腸道黏膜的作用。免疫球蛋白含量與羔羊腸道健康直接相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，在羔羊空腸黏膜中，蛋氨酸螯合鋅組的sIgA含量顯著高于硫酸鋅組和甘氨酸螯合鋅組，IgM含量也高于高于硫酸鋅組和甘氨酸螯合鋅組，而蛋氨酸螯合鋅組和甘氨酸螯合鋅組的IgG含量顯著高于硫酸鋅組；在羔羊回腸黏膜中，蛋氨酸螯合鋅組和甘氨酸螯合鋅組的IgM和IgG含量顯著高于硫酸鋅組，蛋氨酸螯合鋅組的sIgA含量顯著高于硫酸鋅組和甘氨酸螯合鋅組，進一步說明了有機鋅改善腸道黏膜免疫功能優(yōu)于硫酸鋅，且蛋氨酸螯合鋅稍優(yōu)于甘氨酸螯合鋅，這與之前的眾多研究結(jié)果[6,11,29]一致，而蛋氨酸螯合鋅組與甘氨酸螯合鋅組的差異可能是由于有機鋅螯合強度不同導(dǎo)致的[30-31]。

4 結(jié) 論

妊娠母羊飼糧中添加蛋氨酸螯合鋅和甘氨酸螯合鋅能夠改善羔羊體液免疫和腸道黏膜免疫功能，且蛋氨酸螯合鋅優(yōu)于甘氨酸螯合鋅。