曾棋平,吳坤林,陳錦珊 (中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇九醫(yī)院/廈門大學附屬東南醫(yī)院藥劑科,福建 漳州363000)
紫茶生長于非洲肯尼亞海拔1 500~2 000 m的地區(qū),主要成分為多酚類物質(zhì)?,F(xiàn)代藥理研究表明,天然植物中的多酚具有抗腫瘤[1]、抗氧化[2]、抗菌[3]、抗衰老[4]等功效。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),紫茶提取物中多酚的純度不高,直接影響相關(guān)制劑的開發(fā)。近年來,大孔吸附樹脂的應用越來越廣泛,尤其是在天然藥物有效成分分離和純化方面具有顯著優(yōu)勢[5-8]。本實驗以紫茶為研究對象,探索大孔吸附樹脂對紫茶總多酚的純化工藝,以期制備出純度較高的紫茶總多酚,為其進一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。
UV-2550 型 紫 外 分 光 光 度 計(日 本 島 津);AUX220 型電子分析天平(精度:0.1 mg,日本島津);HH-2 數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇金壇市友聯(lián)儀器研究所)。KQ-500B 型超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)。
肯尼亞紫茶(批號:20181030,火烈鳥茶葉有限公司);沒食子酸對照品(批號:110831-201605,中國食品藥品檢定研究院);鐵氰化鉀(溫州市化學用料廠);ADS-17、D101、D301、AB-8、X-5 型大孔吸附樹脂(安徽三星樹脂科技有限公司);氯化鐵、鹽酸、乙醇等試劑(西隴科學股份有限公司),以上試劑均為分析純,水為純化水。5 種大孔吸附樹脂的物理參數(shù)詳見表1。
表1 5 種型號大孔吸附樹脂物理參數(shù)
2.1.1 對照品溶液的制備
精密稱取干燥至恒重的沒食子酸對照品28.4 mg,置于100 ml 量瓶中,加純化水溶解并稀釋至刻度,搖勻制備成母液。精密吸取1 ml 母液置10 ml 量瓶中,加純化水稀釋至刻度,配制成濃度為28.4 μg/ml的對照品溶液,置于冰箱中2~8 ℃避光保存。
2.1.2 供試品溶液的制備
稱取紫茶粉末5.0 g,置于圓底燒瓶中,加入50%乙醇500 ml,加熱回流提取30 min,放冷至室溫,將藥液濾過除去沉淀,濾液用50%乙醇補足減失的重量并稀釋至500 ml。精密吸取1 ml 稀釋液,置于100 ml 量瓶中,加水稀釋至刻度,即得。
2.1.3 線性關(guān)系及方法學考察
分別精密吸取濃度為28.4 μg/ml 的沒食子酸對照品溶液0.2、0.3、0.5、0.8、1.0 和1.2 ml 于25 ml量瓶中,依次加入0.1 mol/L FeCl3溶液1.0 ml、1%K3[Fe(CN)6]溶液2.0 ml 和0.1 mol/L HCl 溶液0.5 ml,用純化水稀釋至刻度,搖勻,于室溫下避光放置60 min。以相應試劑為空白,在775 nm 處測定吸光度。以沒食子酸質(zhì)量濃度(X,μg/ml)為橫坐標,以吸光度(Y)為縱坐標,繪制標準曲線,得回歸方程:Y=0.769 9X+0.027 3(r=0.999 7),表明沒食子酸濃度在0.227~1.363 μg/ml 范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。方法學考察結(jié)果表明,專屬性良好,平均回收率為100.28%,RSD 為2.09%;精密度和重復性試驗的RSD 小于3%。顯示本方法準確可靠。
取5 種不同型號的大孔吸附樹脂在95%乙醇中浸泡24 h,使其充分溶脹,將浸泡后的樹脂裝柱,用95%乙醇以5 ml/min 的體積流量沖洗,直至流出液澄清,之后用2 倍體積的4%鹽酸溶液浸泡3 h,用純化水以5 ml/min 的體積流量沖洗至中性,再用2 倍體積的5%氫氧化鈉溶液浸泡3 h,用純化水以5 ml/min 的體積流量沖洗至中性,最后用95%乙醇浸泡保存,臨用時以5 ml/min 體積流量的純化水沖洗至中性。
2.3.1 大孔吸附樹脂的篩選
取預處理后的ADS-17、D101、D301、AB-8、X-5 型大孔吸附樹脂約1 g,精密稱定,共5 份,置于50 ml 具塞磨口錐形瓶中。加入質(zhì)量濃度為50 μg/ml(以多酚含量計)的紫茶總多酚提取液20 ml,在30 ℃水浴的條件下振蕩吸附24 h。吸附結(jié)束后,濾過,取續(xù)濾液按照“2.1”項下方法測定總多酚的含量,計算各樹脂在30 ℃下對紫茶總多酚的吸附量和吸附率。然后,將上述吸附飽和的大孔樹脂取出,用純化水清洗后,分別加入70%乙醇20 ml,在30 ℃水浴的條件下振蕩24 h,進行靜態(tài)解吸,計算其解吸率,結(jié)果見表2。計算公式如下:
吸附量=(C0-C1)V1/M
吸附率=(C0-C1)/C0
解吸量= C2V2/M
解吸率=C2V2/[(C0-C1)V]
其中,C0、C1為吸附前和吸附后吸附液中多酚的質(zhì)量濃度,C2為解吸附后多酚的質(zhì)量濃度,V1和V2分別為吸附液和解吸液體積,M 為大孔樹脂的質(zhì)量。
由表2 結(jié)果可知,大孔樹脂D301 對紫茶總多酚具有較強的吸附效果,其吸附率達到100%,其余4 種樹脂的吸附率從高到低依次是X-5、AB-8、D101、ADS-17。由此可見,不同類型的樹脂對紫茶總多酚的吸附性能各不相同。這可能是由于樹脂的內(nèi)部結(jié)構(gòu)、分子極性以及多酚的溶解度等對樹脂吸附多酚能力的影響。多酚由于分子中酚羥基的存在,其分子極性較低,因而在與極性較弱或者非極性的樹脂進行吸附時效果更好。采用50%的乙醇進行解吸,可以看出5 種樹脂的解吸率差異較大,AB-8 樹脂的解吸效果最好,解吸率達86.73%,X-5 樹脂次之。綜合紫茶總多酚提取液的靜態(tài)吸附和解吸試驗,AB-8 型樹脂和X-5 型樹脂對紫茶總多酚的吸附效果和解吸效果均較好,而AB-8 型樹脂價格相對低廉,從節(jié)省成本的角度考慮,優(yōu)先采用AB-8 型樹脂對其進行純化。
表2 不同類型大孔樹脂對紫茶總多酚的靜態(tài)吸附率和解吸率
2.3.2 靜態(tài)吸附和解吸曲線的繪制
取預處理后的AB-8 型大孔吸附樹脂約1 g,精密稱定,共15 份,分別置于50 ml 具塞磨口錐形瓶中,加入質(zhì)量濃度為50 μg/ml 的紫茶總多酚提取液20 ml,在25 ℃水浴的條件下振蕩吸附12 h,每隔一段時間取出1 個磨口錐形瓶,測定其總多酚的質(zhì)量濃度,計算對應時間的吸附率,繪制靜態(tài)吸附動力學曲線。然后,采用靜態(tài)解吸試驗的方法處理已吸附結(jié)束的樹脂,進行靜態(tài)解吸動力學試驗,同樣每隔一段時間取出1 個磨口錐形瓶,測定其總多酚的質(zhì)量濃度,計算對應時間的解吸率,繪制靜態(tài)解吸動力學曲線,結(jié)果見圖1。
圖1 AB-8 樹脂靜態(tài)吸附與解吸動力學曲線
由圖1 可知,在測定的時間點內(nèi),AB-8 型大孔吸附樹脂對紫茶總多酚的吸附量隨著時間的延長而逐漸增多,經(jīng)過2.5 h 以后,樹脂對紫茶總多酚的吸附量趨于平衡,對應的吸附率為88.27%。在0~5 h 內(nèi),樹脂的解吸率呈上升趨勢,并在4 h 達到最大值84.86%,在隨后的時間里,解吸率隨著時間的延長變化不大。
2.3.3 吸附液pH 值對吸附率的影響
取預處理好的AB-8 型大孔吸附樹脂1 g,精密稱定,共7 份,分別置于50 ml 具塞磨口錐形瓶中,分別加入質(zhì)量濃度為50 μg/ml 并用0.1 mol/L 的鹽酸和0.1 mol/L 的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 值為2、3、4、5、6、7、8 的紫茶總多酚提取液,在30 ℃水浴的條件下振蕩吸附2.5 h,測定吸附液中紫茶總多酚的質(zhì)量濃度,計算吸附率,結(jié)果見表3。
表3 pH 值對紫茶總多酚吸附率和解吸率的影響
由表3 可知,吸附液pH 值對紫茶總多酚的吸附率有較大影響。在pH 值為2 時,AB-8 型大孔吸附樹脂對此質(zhì)量濃度下的紫茶總多酚吸附率達89.79%。因此,確定上樣液的pH 值為2。
2.4.1 泄露曲線的繪制
取預處理后的AB-8 型樹脂10 g,精密稱定,室溫下將質(zhì)量濃度為250.0 μg/ml(調(diào)至pH 為2)的紫茶總多酚提取液(供試品溶液用水稀釋)以1.0 ml/min體積流量濕法加至樹脂柱中,分段收集流出液,流出液每20 ml 收集1 份,測定吸光度,計算對應的總多酚含量,繪制泄露曲線。當流出液中總多酚的質(zhì)量濃度達到上樣液質(zhì)量濃度的1/10,達到泄露點,認為此時為最佳上柱體積,結(jié)果見圖2。在第2 份流出液時,紫茶總多酚已經(jīng)開始泄露,在第3 份流出液中,總多酚的質(zhì)量濃度為26.5 μg/ml,達到上樣液質(zhì)量濃度的1/10,因此選擇上柱體積為60 ml,即3 BV。
圖2 紫茶總多酚在AB-8 大孔樹脂上的泄露曲線
2.4.2 上樣液質(zhì)量濃度的影響
取預處理好的AB-8 型樹脂10 g,精密稱定,裝入1.5 cm×20 cm 的層析柱中,共5 份,分別加入質(zhì)量濃度為250、375、500、625、750、1 000 μg/ml 的上樣液(pH 為2)各60 ml(3 BV),以1.0 ml/min 的流速上柱,收集流出液,按“2. 1”項下方法測定總多酚含量,計算各質(zhì)量濃度下的吸附率,確定最佳上樣質(zhì)量濃度。結(jié)果顯示,各上樣質(zhì)量濃度下的吸附率分別為74.50%、77.56%、69.77%、60.59%、56.73%、43.61%。由此可見,上樣液質(zhì)量濃度對大孔吸附樹脂吸附性能有顯著影響,在考察范圍內(nèi)吸附率總體呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。當質(zhì)量濃度小于375 μg/ml 時,隨著上樣液質(zhì)量濃度增加,動態(tài)吸附率呈現(xiàn)上升的趨勢;分析原因可能是在此較低的濃度范圍內(nèi),紫茶多酚有較大的機會與大孔樹脂的內(nèi)表面接觸,進而加速擴散至樹脂孔道內(nèi),形成吸附作用。而當質(zhì)量濃度大于375 μg/ml 時,隨著質(zhì)量濃度繼續(xù)增加,位于孔道內(nèi)的紫茶總多酚分子的擴散運動受到抑制,導致樹脂對多酚的吸附能力降低。因此,選擇上樣液質(zhì)量濃度為375 μg/ml。
2.4.3 上樣液體積流量的影響
取預處理的AB-8 型大孔吸附樹脂10 g,精密稱定,以濕法上柱法裝入1.5 cm ×20 cm 的層析柱中,共4 份,輕敲柱壁,使柱內(nèi)樹脂平衡,打開下端閥門,控制體積流量使柱內(nèi)純化水流出,在液面距樹脂1 cm 時,將紫茶總多酚上樣液(質(zhì)量濃度為375 μg/ml,pH 為2,上樣量為3 BV)分別以1.0、2.0、3.0、4.0 ml/min 的體積流量上柱,同時收集下端流出液,測定吸光度,計算吸附率,確定最佳上樣體積流量。結(jié)果顯示,吸附率分別為79.37%、79.78%、72.73%、64.73%,當上樣體積流量為2.0 ml/min時,AB-8 型大孔吸附樹脂對紫茶總多酚的吸附率最大,故選擇上樣體積流量為2.0 ml/min。
2.4.4 徑高比對動態(tài)吸附性能的影響
取預處理的AB-8 型大孔吸附樹脂10 g,精密稱定,以濕法上柱法裝入1.5 cm ×40 cm 的層析柱中,分別設(shè)置徑高比(柱直徑與樹脂填充高度比值)為1∶6、1∶9、1∶12、1∶15,將紫茶總多酚上樣液(質(zhì)量濃度為375 μg/ml,pH 為2)分別以2.0 ml/min的體積流量上柱,對應的藥液上樣量分別為3、4.5、6、9 BV,收集下端流出液,測定吸光度,計算吸附率,確定最佳徑高比。結(jié)果顯示,吸附率分別為79.81%、78.37%、76.73%、68.54%。徑高比1∶6和1∶9 對吸附率影響不大。此后,在考察范圍內(nèi),隨著徑高比值的降低,吸附率也呈現(xiàn)下降的趨勢,可能是由于樹脂層過高導致上樣液穿透能力差所致。
2.4.5 洗脫劑體積分數(shù)的影響
取預處理后的AB-8 型大孔吸附樹脂10 g,精密稱定,共5 份,以濕法緩慢裝入1.5 cm×20 cm 的層析柱(徑高比為1∶6,下同),將質(zhì)量濃度為375 μg/ml上樣液(調(diào)節(jié)pH 為2)3 BV 以2.0 ml/min 的體積流量通過樹脂柱,待吸附飽和后,分別用純化水及25%、50%、75%、90%乙醇溶液各3 BV 以1.0 ml/min 的流速進行洗脫,收集洗脫液,測定其吸光度,計算解吸率,確定最佳洗脫劑體積分數(shù)。結(jié)果:解吸率分別為17.52%、62.96%、91.04%、81.41%、84.67%,由此可見,50%乙醇對紫茶總多酚的解吸作用最強,故選擇洗脫劑的體積分數(shù)為50%。
2.4.6 洗脫劑用量的影響
取預處理后的AB-8 型大孔吸附樹脂10 g,精密稱定,以濕法緩慢裝入1.5 cm×20 cm 的層析柱中,將375 μg/ml 的上樣液(pH 為2)3 BV 以2 ml/min的體積流量通過樹脂柱,待吸附飽和后,用50%乙醇以1.0 ml/min 的流速進行洗脫,洗脫溶劑用量分別為1、2、3、4、5 BV,收集洗脫液,測定其吸光度,計算洗脫率,確定最佳洗脫劑用量。結(jié)果:解吸率分別為54.68%、83.37%、90.29%、91.48%、91.45%,表明當50%乙醇用量在1~3 BV 時,隨著用量的增加,對紫茶總多酚的解吸率呈上升的趨勢,隨后繼續(xù)增加洗脫劑的用量,解吸率不再增加,表明此時樹脂上吸附的總多酚已被充分洗脫,沒有必要再增加洗脫劑的用量,故確定洗脫劑的用量為4 BV。
2.4.7 洗脫劑體積流量對洗脫效果的影響
取預處理后的AB-8 型大孔吸附樹脂約10 g,精密稱定,以濕法緩慢裝入1.5 cm×20 cm 的層析柱中,將375 μg/ml 上樣液(pH 為2)3 BV 以2.0 ml/min 的體積流量通過樹脂柱,待吸附飽和后,用50%乙醇溶液4 BV 分別以1.0、2.0、4.0、6.0 ml/min的體積流量進行洗脫,計算解吸率,確定最佳體積流量。結(jié)果:對應的解吸率分別為92.47%、93.76%、91.97%、85.18%,表明紫茶總多酚的洗脫率隨著洗脫體積流量的加大先升高后減小,故選擇最佳洗脫體積流量為2 ml/min。
稱取4 份預處理后的大孔吸附樹脂約10 g,精密稱定,以濕法緩慢裝入1.5 cm×20 cm 層析柱中(徑高比為1∶6),將紫茶提取物預先用石油醚(60~90 ℃)除去脂溶性色素,參考“2.1.2”項下方法加水稀釋以制備濃度為375 μg/ml(pH 為2)的紫茶總多酚溶液3 BV(總多酚質(zhì)量為22.5 mg,質(zhì)量分數(shù)40.2%,干膏56.0 mg),并以2 ml/min 體積流量上樣,待吸附飽和后,先用3 BV 水去除雜質(zhì),然后用50%乙醇溶液4 BV 以2 ml/min 的體積流量洗脫,分別收集洗脫液,按照紫茶總多酚定量測定方法,計算總多酚洗脫量及洗脫率,再將洗脫液水浴蒸干,低溫烘至恒重,計算干膏的量;精密稱取干膏適量,測定總多酚的含量。結(jié)果見表4。
表4 純化工藝驗證結(jié)果
由純化工藝驗證結(jié)果可見,經(jīng)過4 次驗證試驗,50%乙醇洗脫條件下總多酚的平均洗脫率為92.5%,紫茶總多酚干膏量由56.0 mg 減少至平均29.9 mg,質(zhì)量分數(shù)從40.2%升至平均69.8%,表明建立的純化工藝對紫茶總多酚有較好的分離、純化效果。
大孔吸附樹脂是一種具有多孔立體結(jié)構(gòu)和選擇性吸附功能的高分子材料,目前已廣泛應用于中藥的活性成分如黃酮、皂苷、生物堿及多酚等成分的分離與純化。其中,目前采用大孔樹脂對多酚類成分進行純化的有天麻總多酚[9]、白簕葉總多酚[10]、過崗龍總多酚[11]、茶梗中茶多酚[12]等,這都提示了大孔樹脂精制多酚類有效成分的可行性。影響大孔樹脂的分離純化有多方面的因素,在選擇合適的大孔樹脂時,應綜合考慮各種影響因素,如樹脂的極性、比表面積以及上樣液的質(zhì)量濃度、洗脫液濃度等,以獲得最佳的分離效果。在利用大孔樹脂純化時,應盡量濾去上樣液中的沉淀,這樣既能提高總多酚的純化率,也能提高樹脂的使用壽命。本研究中的樣品采用50%乙醇提取后用純化水進行稀釋,當樣品溶于水中時,由于多酚類物質(zhì)能被大孔樹脂吸附,而色素及多糖等物質(zhì)不能吸附而被洗脫掉。而在改為乙醇洗脫時,樹脂的吸附效果減弱,被吸附的多酚能被乙醇洗脫。
本研究通過對5 種不同型號的大孔吸附樹脂的吸附和解吸進行考察,確定了AB-8 型大孔吸附樹脂純化紫茶總多酚的最佳工藝條件,為該產(chǎn)品的進一步開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。