楊湘黔 崔京春* 曾詩嫻 成 麗 張珂彬 胡曉紅 鮑雅靜

(1.大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，大連116600;2.大連民族大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，大連116600)

豆粕是大豆加工的副產(chǎn)物，因富含多種營養(yǎng)物質(zhì)，是目前使用最廣泛的植物性蛋白質(zhì)飼料原料，但因豆粕中含有抗?fàn)I養(yǎng)因子影響了動物對飼糧的消化吸收和利用[1-3]。解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)是一種廣泛被用于開發(fā)微生物飼料添加劑的革蘭氏陽性芽孢桿菌[4-5]，它能夠產(chǎn)生蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶、脂肪酶等多種酶類，并能產(chǎn)生對動物病原菌中的大腸桿菌、梭狀芽孢桿菌、沙門氏菌等具有較強的抑制能力的物質(zhì)[6-8]。研究表明，利用解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵豆粕不僅可以降低豆粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子含量，且可提高動物對豆粕飼料的消化吸收率[9-12]。解淀粉芽孢桿菌在發(fā)酵豆粕飼料中的數(shù)量是影響豆粕發(fā)酵效果的關(guān)鍵因素之一，而由于用于發(fā)酵的豆粕為未滅菌原料，在進行接種菌的數(shù)量檢測時會因自身帶有的微生物的干擾，造成常用的微生物數(shù)量檢測平板活菌計數(shù)法計數(shù)不準(zhǔn)或者難以計數(shù)，并且由于該方法檢測周期通常長達(dá)2～3 d，無法實現(xiàn)對豆粕發(fā)酵生產(chǎn)過程的即時監(jiān)控[13-16]。

近幾年，基于DNA水平上的微生物數(shù)量檢測分子生物學(xué)方法越來越多，包括常規(guī)PCR技術(shù)、變性梯度凝膠電泳技術(shù)、實時熒光定量PCR技術(shù)等[17-22]。其中，實時熒光定量PCR技術(shù)具有特異性強、靈敏度高、操作時間短的特點，且由于在檢測過程中均為閉管操作不會造成因污染而出現(xiàn)的假陽性結(jié)果[23-24]。DNA解旋酶A亞基(gyrA)基因是細(xì)菌DNA促旋酶上的1個亞基，該基因是枯草群中鑒定、分類的重要工具，因此，采用該基因可準(zhǔn)確地區(qū)分枯草菌群中的近緣種[25]。

本研究擬建立基于解淀粉芽孢桿菌gyrA基因保守區(qū)設(shè)計引物、探針的實時熒光定量PCR方法，預(yù)期該方法可以達(dá)到種間特異，檢出敏感度可滿足監(jiān)控解淀粉芽孢桿菌在不同豆粕發(fā)酵時期中的數(shù)量的要求，可以解決解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵豆粕過程品質(zhì)監(jiān)控的瓶頸難題，并為解決以未滅菌生產(chǎn)原料發(fā)酵生產(chǎn)過程監(jiān)控提供了有益的借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗菌種

本研究所選菌種為芽孢桿菌4株(解淀粉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌)，非芽孢桿菌5株，其中包括乳酸桿菌2株(副干酪乳桿菌、植物乳桿菌)，金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、大腸桿菌各1株。

1.1.2 試劑

dNTP、rTaq酶、10×Buffer、瓊脂糖、6×Loading Buffer、2000 bp Marker、pMD18-T載體、TaKaRa Premix EX TaqTM購于寶生物工程(大連)有限公司；4S Green染料、IPTG即用型溶液、X-Gal即用型溶液、氨芐青霉素鈉、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、Ezup柱式土壤DNA抽提試劑盒購于生工生物工程(上海)股份有限公司；TE緩沖液購于北京索萊寶科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種培養(yǎng)

乳酸菌接種至MRS肉湯，其他菌株接種至牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，37 ℃過夜培養(yǎng)。

1.2.2 菌種DNA的提取

純菌液DNA的提?。阂愿倪M的水煮法提取純菌液DNA[26]，具體為：取過夜培養(yǎng)的菌液1 mL于1.5 mL離心管中，離心，棄上清并加入500 μL TE緩沖液，重懸菌體，99～100 ℃水浴15 min后離心，取上清作為DNA模板，-20 ℃保存，備用。

豆粕及發(fā)酵豆粕樣品中DNA的提?。悍Q取豆粕樣品300 mg，采用試劑盒提取其DNA，具體操作步驟詳見生工生物(上海)股份有限公司的Ezup柱式土壤DNA抽提試劑盒說明書。

1.2.3 特異性引物及探針的設(shè)計

在NCBI中的GenBank數(shù)據(jù)庫中下載35株芽孢桿菌屬的gyrA基因及16S rRNA基因全序列，利用DNAMAN軟件對下載的序列進行比對，找出解淀粉芽孢桿菌的保守區(qū)，然后使用IDT引物設(shè)計軟件進行引物、探針的設(shè)計，并對設(shè)計出的引物的退火溫度、二聚體、發(fā)夾結(jié)構(gòu)及探針的退火溫度進行檢測，從中篩選出1個正向引物、1個反向引物、1個探針(表1)。采用NCBI上的Primer-Blast Tool的引物比對軟件從理論上確認(rèn)引物、探針特異性，并由寶生物大連有限公司進行合成。該探針5’端由FAM基團(報告基團)修飾，3’端由TAMRA基團(淬滅基團)修飾。

1.2.4 常規(guī)PCR驗證引物特異性及篩選

以1.2.2純菌液中提取的10株菌的DNA為模板，以表1設(shè)計的引物進行常規(guī)PCR反應(yīng)。以50 μL體系進行PCR擴增，其中包括10×Buffer(Mg2+free)5 μL，dNTP Mixture 4 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，rTaq酶0.5 μL，無菌水補足至50 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸1 min，終延伸72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物采用2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.2.5 實時熒光定量PCR方法的建立及特異性檢測

實時熒光定量PCR反應(yīng)體系：總體積為20 μL，其中包括premix EX TaqTM12.5 μL，上、下游引物(0.2 μmol/L)各0.5 μL，探針(0.2 μmol/L)0.8 μL，DNA模板2 μL，雙蒸水補足至20 μL。

實時熒光定量PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 30 s，變性95 ℃ 5 s，退火60 ℃ 34 s。特異性檢測：以1.2.2純菌液中所提取的10株菌的DNA作為模版，采用所建立的實時熒光定量PCR方法進行特異性驗證。

表1 引物、探針序列

1.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及靈敏性、重復(fù)性驗證

pMD18T-gyrA基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建：以解淀粉芽孢桿菌KCA基因組為模版及引物gyrA1-F/gyrA1-R進行擴增獲得目的片段(115 bp)，將其與pMD18-T載體連接，連接后的產(chǎn)物進行PCR和測序驗證。驗證正確后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α細(xì)胞中，然后采用SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒提取重組質(zhì)粒，通過核酸微量測定儀測定其濃度并通過公式換算成拷貝數(shù)。公式如下：

式中：X為重組質(zhì)粒的所測濃度；N為重組質(zhì)粒的堿基數(shù)。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：以洗脫緩沖液TE將標(biāo)準(zhǔn)品pMD18T-gyrA進行10倍稀釋后作為模板進行實時熒光定量PCR反應(yīng)。以拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。擴增效率(E)計算公式為：

E=10-1/slope-1×100。

每個稀釋度重復(fù)3次，以無菌水為陰性對照。

靈敏性驗證：重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品靈敏度檢測是將標(biāo)準(zhǔn)品pMD18T-gyrA進行10倍梯度稀釋并稀釋成6個梯度，以作為實時熒光定量PCR的模版，不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)3次檢測；菌液靈敏度檢測是將KCA菌原菌液進行10倍梯度稀釋，分別提取各個稀釋度菌液的基因組DNA，最后進行實時熒光定量PCR反應(yīng)。

重復(fù)性驗證：用5個稀釋度的pMD18T-gyrA標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值變異系數(shù)(CV)評價該方法的重復(fù)性。組內(nèi)重復(fù)性驗證分別以5個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品作為模板進行實時熒光定量PCR反應(yīng)，每個稀釋度重復(fù)3次，并以KCA菌的DNA和無菌水作為陽性對照和陰性對照。組間重復(fù)性驗證以上述5個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品作為模板分3次進行實時熒光定量PCR反應(yīng)，以KCA菌的DNA和無菌水作為陽性和陰性對照。

1.2.7 抗干擾驗證

核酸水平抗干擾檢測：分別提取108、103CFU/mL菌液量的解淀粉芽孢桿菌KCA基因組DNA，分別加入108CFU/mL菌液量的副干酪乳桿菌rg-1(Lactobacillusparacaseirg-1)所提取的DNA，以純的解淀粉芽孢桿菌KCA的基因組DNA為對照進行實時熒光定量PCR檢測，重復(fù)3次。

豆粕樣品對接種菌吸附干擾的檢測：取6 g滅菌的豆粕樣品分別添加4 mL解淀粉芽孢桿菌KCA的不同稀釋度菌液，靜置10 min后加入20 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)，顛倒2～3次后斜面振蕩15 min，靜置5 min后吸取上清，3 000×g離心6 min，棄上清，加入2 mL TE Buffer后提取基因組DNA；同時提取2 mL不同稀釋度純菌液的基因組DNA作為對照，并進行實時熒光定量PCR檢測。每個稀釋度檢測3次。

1.2.8 發(fā)酵豆粕中解淀粉芽孢桿菌數(shù)量的檢測

解淀粉芽孢桿菌KCA培養(yǎng)至108～109CFU/mL，以4%的接種量接種至水分含量為40%～45%的豆粕中，室溫發(fā)酵0、1、2、3、5 d；取樣根據(jù)1.2.2所提供的豆粕中DNA提取方法提取細(xì)菌DNA，利用所建立的實時熒光定量PCR方法進行檢測。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 7.00軟件進行統(tǒng)計分析及作圖。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性驗證

2.1.1 常規(guī)PCR法驗證、特異性引物篩選

以gyrA及16S rRNA基因為靶標(biāo)設(shè)計出的3對引物進行常規(guī)PCR擴增，由表2可知，只有引物對gyrA1-F/gyrA1-R擴增解淀粉芽孢桿菌KCA，采用gyrA2-F/gyrA2-R可同時擴增解淀粉芽孢桿菌KCA及地衣芽孢桿菌KCB；采用引物對16S rRNA-F/16S rRNA-R可將芽孢桿菌屬內(nèi)的菌株擴增出條帶(164 bp)。這表明引物對gyrA1-F/gyrA1-R能特異性擴增解淀粉芽孢桿菌，因此選用gyrA1-F/gyrA1-R作為本研究建立實時熒光定量PCR方法的特異性引物對。

2.1.2 實時熒光定量PCR方法特異性的驗證

利用引物對gyrA1-F/gyrA1-R及探針gyrA1進行實時熒光定量PCR反應(yīng)，KCA菌在22～24個循環(huán)處出現(xiàn)擴增曲線，而其他4株芽孢桿菌、5株非芽孢桿菌及陰性對照則在35個循環(huán)后出現(xiàn)擴增曲線(圖1)。這表明本研究所建立的方法對于KCA菌有較強的特異性。

表2 不同引物特異性檢測

～分別為解淀粉芽孢桿菌KCA、4株芽孢桿菌、5株非芽孢桿菌屬及陰性對照。

2.2 pMD18T-gyrA標(biāo)準(zhǔn)品的制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以KCA菌基因組DNA為模版，以引物對gyrA1-F/gyrA1-R進行常規(guī)PCR擴增，獲得115 bp大小的片段(圖2)，結(jié)果與預(yù)期相符。將擴增產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18T-gyrA。構(gòu)建后的質(zhì)粒經(jīng)酶切、測序驗證正確后，使用核酸微量測定儀測定其濃度(結(jié)果未給出)，并計算出其拷貝數(shù)為5.74×1010copies/μL，以此作為所建立的實時熒光定量PCR方法的標(biāo)準(zhǔn)品。

M為DNA Marker (2 000 bp)；泳道1～3為gyrA1-F/gyrA1-R引物對的擴增產(chǎn)物；泳道4為陰性對照。

將標(biāo)準(zhǔn)品pMD18T-gyrA進行10倍梯度稀釋，分別以各個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品作為模板進行實時熒光定量PCR反應(yīng)，獲得的擴增曲線規(guī)律較好，各稀釋度之間的擴增Ct值相差在2～3個循環(huán)之間(圖3)；以不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對數(shù)為X軸、Ct值為Y軸建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，該曲線的斜率為-3.468，擴增效率為0.94，截距為41.86，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 3(圖4)，表明標(biāo)準(zhǔn)品濃度在5.74×107～5.74×102copies/μL有較好的線性關(guān)系。

2.3 實時熒光定量PCR方法的靈敏性及重復(fù)性檢測

2.3.1 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的靈敏度檢測

以102～107copies/μL各個稀釋度標(biāo)準(zhǔn)品pMD18T-gyrA為模板，利用所建立的方法進行檢測。結(jié)果表明，該方法最小檢出量為5.74×102copies/μL(表3)。

2.3.2 菌液靈敏度檢測

將KCA菌的原菌液(4.0×108CFU/mL)進行10倍梯度稀釋，從107～102各稀釋度提取核酸作為模板，并進行實時熒光定量PCR反應(yīng)。由表4可知，該方法的菌液最小檢出限為103CFU/mL。

2.3.3 重復(fù)性檢測

以不同稀釋度的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pMD18T-gyrA測定3次，組內(nèi)重復(fù)Ct值的變異系數(shù)介于0.76%～3.27%，標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)介于0.10～0.55，組間重復(fù)Ct值的變異系數(shù)介于0.34%～1.88%，SD介于0.07～0.62，均在可接受范圍內(nèi)，證明建立的實時熒光定量PCR方法組內(nèi)和組間重復(fù)較好。

圖3 不同稀釋度標(biāo)準(zhǔn)品的擴增曲線

圖4 實時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 實時熒光定量PCR方法的抗干擾驗證

2.4.1 核酸水平抗干擾檢測

由表5可知，從108和103CFU/mL菌液濃度

的KCA菌所提取的核酸中分別加入108CFU/mL的副干酪乳桿菌rg-1核酸提取物時(核酸濃度為6.7 ng/μL)，KCA純菌液的Ct值均不受影響，且與無rg-1干擾下的KCA純菌液的Ct值無顯著差異(P>0.05)。

2.4.2 豆粕對檢測方法的干擾

由表6可知，純菌液最低檢測限為103CFU/mL，其中同等濃度下的純菌液與豆粕的混合物的最低檢出限為104～105CFU/mL，3次重復(fù)結(jié)果均比純菌液檢測限低1～2個梯度，表明以此方法檢測發(fā)酵豆粕中目的菌的檢測值比實際含量低10～100倍。

表3 實時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)品的靈敏度

2.5 發(fā)酵豆粕樣品的實時熒光定量PCR檢測結(jié)果

分別提取0、1、2、3、5 d的發(fā)酵豆粕樣品基因組DNA作為模板，利用gyrA1-F/gyrA1-R引物對進行常規(guī)PCR檢測。如圖5所示，不同發(fā)酵天數(shù)的豆粕提取的DNA均有擴增條帶，且隨著發(fā)酵時間延長，條帶越清晰，表明豆粕樣品中的細(xì)菌DNA均提出。

表4 實時熒光定量PCR檢測KCA菌液樣品的靈敏度

表5 核酸水平抗干擾檢測

表6 豆粕對接種菌KCA檢測的干擾

實時熒光定量PCR方法檢測結(jié)果表明(表7)，發(fā)酵0 d解淀粉芽孢桿菌數(shù)量為9.33×105copies/g(理論接種菌量為1.0×106CFU/mL)，發(fā)酵5 d時，解淀粉芽孢桿菌的數(shù)量為4.16×108copies/g，此時的該菌的數(shù)量是發(fā)酵初期的1 000倍，說明本研究建立的實時熒光定量PCR方法能定量檢測發(fā)酵豆粕中的解淀粉芽孢桿菌。

3 討 論

解淀粉芽孢桿菌屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)，是枯草芽孢桿菌近緣種群的芽孢桿菌，該菌群中主要被用于微生物添加劑生產(chǎn)的近緣菌還有枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)[27-28]。細(xì)菌的16S rDNA序列素有“細(xì)菌化石”之稱，已成為細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育分析的金標(biāo)準(zhǔn)。有研究表明，采用16S rDNA可以區(qū)分芽孢桿菌屬內(nèi)的菌種，但難以區(qū)分枯草近緣種群中的各類芽孢桿菌[29-30]。因此近幾年采用細(xì)菌解旋酶gyrA基因進行細(xì)菌分類、鑒定頗受關(guān)注，Chun等[31]曾用gyrA基因設(shè)計枯草芽孢桿菌近緣種群的引物進行序列分析，表明gyrA基因能夠區(qū)分枯草近緣種群中的芽孢桿菌。本研究針對解淀粉芽孢桿菌16S rRNA基因及gyrA基因的保守區(qū)設(shè)計了引物，常規(guī)PCR檢測結(jié)果表明以gyrA基因設(shè)計出的引物進行擴增獲得了良好的種間特異性，可將目的菌與近緣菌區(qū)別，而針對16S rRNA基因設(shè)計出的引物只能達(dá)到屬間特異，這與曹鳳明等[32]描述一致。

利用實時熒光定量PCR方法進行微生物的數(shù)量檢測已在發(fā)酵領(lǐng)域得到較好的應(yīng)用。Yong等[33]研究了固體發(fā)酵機制中產(chǎn)聚c-谷氨酸的解淀粉芽孢桿菌生長規(guī)律，并與活菌計數(shù)進行對比，表明建立的實時熒光定量PCR方法與活菌計數(shù)無顯著差異；夏雪娟等[34]利用實時熒光定量PCR方法檢測麻竹腌制過程中乳酸球菌的動態(tài)變化，結(jié)果表明隨著腌制時間的延長，乳酸球菌數(shù)量逐漸升高，在14 d達(dá)到峰值(4.63×108copies/μL)，相比于0 d(2.41×102copies/μL)增加了6個數(shù)量級。這些研究結(jié)果均表明，實時熒光定量PCR可以定量檢測發(fā)酵過程中優(yōu)勢菌或接種菌的生長變化。本研究成功設(shè)計了可特異性檢測解淀粉芽孢桿菌KCA的引物，并利用此引物擴增的產(chǎn)物構(gòu)建的重組質(zhì)粒，建立了標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立了定量檢測豆粕發(fā)酵過程中解淀粉芽孢桿菌KCA的實時熒光定量PCR的方法。該方法的標(biāo)準(zhǔn)品在5.74×107～5.74×102copies/μL有較好的線性關(guān)系，核酸水平最低檢測限在102 copies/μL，純菌液水平在103CFU/mL，說明該方法的靈敏性很好。此外，發(fā)酵豆粕的原料為未滅菌狀態(tài)，從檢樣中提取細(xì)菌基因組DNA時通常為混菌的DNA，進行核酸水平、菌體水平抗干擾檢測結(jié)果均表明所建立的方法抗干擾能力強，添加干擾菌核酸并不影響檢測值。

M為DNA Marker (2 000 bp)；泳道1為陰性對照；泳道2、3、4、5、6分別為發(fā)酵0、1、2、3、5 d豆粕樣品。

表7 不同發(fā)酵時間的豆粕中解淀粉芽孢桿菌的數(shù)量檢測

在實際發(fā)酵生產(chǎn)中，豆粕為干燥的粉末狀，加菌發(fā)酵時會對目標(biāo)菌造成吸附，從而導(dǎo)致在提取細(xì)菌DNA時會有殘留，為了探討豆粕類固體基質(zhì)對樣品中DNA檢測的影響，本研究還進行了豆粕的抗干擾驗證試驗，結(jié)果表明豆粕中目的菌的定量檢測限為104～105CFU/mL，比純菌液的高10～100倍，說明豆粕類固體基質(zhì)對接種菌的DNA水平數(shù)量檢測有干擾，但因發(fā)酵豆粕時是以108～109CFU/mL的菌液、4%的接種量進行的，接種之初豆粕樣品中目的菌的含量至少在106CFU/mL，檢測基線比所建立方法高出1～2個數(shù)量級以上，不影響該方法在實際檢測中的應(yīng)用。實際檢測結(jié)果表明，不同發(fā)酵時期的豆粕中的解淀粉芽孢桿菌數(shù)量均發(fā)生變化，發(fā)酵初期(0 d)，解淀粉芽孢桿菌的數(shù)量為9.33×105copies/g，發(fā)酵至5 d，解淀粉芽孢桿菌的數(shù)量為4.16×108copies/g，是接種初期的1 000倍。同時表明解淀粉芽孢桿菌的數(shù)量隨著發(fā)酵天數(shù)的延長而增加，進而降低豆粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子含量，提高營養(yǎng)物質(zhì)消化利用率，這與王梅等[35]描述一致。以上結(jié)果證明本研究建立的解淀粉芽孢桿菌的實時熒光定量PCR的方法可良好地應(yīng)用于豆粕發(fā)酵過程中解淀粉芽孢桿菌的定量檢測。

4 結(jié) 論

本研究針對發(fā)酵豆粕中接種菌建立了特異性實時熒光定量PCR方法，可相對準(zhǔn)確檢測接種菌在發(fā)酵豆粕中不同時期的數(shù)量變化，解決了以豆粕等未滅菌生產(chǎn)原料進行固體發(fā)酵過程中監(jiān)控接種菌生長情況難的瓶頸問題，為發(fā)酵豆粕生產(chǎn)企業(yè)進行生產(chǎn)過程品質(zhì)監(jiān)控提供了新的科學(xué)的技術(shù)手段。