楊瑞鋒，陳紅松，魯鳳民

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染引起的慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)是我國肝硬化和肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的主要病因。自20世紀90年代起我國開展HBV疫苗新生兒普種以來，我國一般人群的HBV表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)陽性率已降到5%左右，但由于既往感染者眾多，現(xiàn)有慢性HBV感染者仍有8 000萬人[1]。目前，我國每年CHB死亡人數(shù)超過30.8萬，而診斷率僅為19%，治療率僅為10%～11%，達成世界衛(wèi)生組織提出2030年“全面消除病毒性肝炎作為重大公共安全威脅”的目標仍任重而道遠[2]。當前，治療CHB以恩替卡韋(entecavir,ETV)、替諾福韋(tenofovir disoproxil fumarate,TDF)和丙酚替諾福韋(tenofovir alafenamide,TAF)等一線核苷(酸)類似物[nucleos(t)ide analog,NUC]為主，可強效抑制病毒復制，阻滯CHB向肝硬化和HCC發(fā)展，但在啟動治療、療效監(jiān)測及停藥判定等方面，均存在一定困難或爭議。

1 對HBV低病毒載量血癥(low-level viremia,LLV)的關注：進一步增加對HBV DNA試劑靈敏度的要求

LLV一般定義為血清HBV DNA持續(xù)或間歇高于最低檢測限(limit of detection,LOD)，同時<2 000國際單位(international unit,IU)/ml。有兩種不同類型的LLV被關注，一是處于HBV感染自然病程免疫控制期的患者，即e抗原(hepatitis B e antigen，HBeAg)陰性的非活動性HBsAg攜帶狀態(tài)。有數(shù)據(jù)顯示，處于“非活動性”攜帶狀態(tài)的患者其HCC風險依然存在。如最近一項來自韓國的隨訪中位數(shù)為5.1年的回顧性研究[3]顯示，代償期肝硬化患者5年HCC發(fā)生率為13.7%(19/139)，而非肝硬化組HCC發(fā)生率也高達2.0%(17/867)。我國慢性HBV感染者基數(shù)依然龐大，并且隨感染者年齡逐漸增加，肝硬化、肝癌風險逐年增高。為進一步通過抗病毒治療減少終末期肝病及肝癌的發(fā)生，我國《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》擴大了CHB的治療適應證[4]。降低抗病毒治療的“門檻”，不僅僅是一個科學問題，也關乎感染者的遠期健康和國家的醫(yī)療負荷。當前更多被討論的LLV狀態(tài)，則指CHB患者接受NUC治療但未取得完全病毒學應答的情形。當今即使在接受強效NUC治療的CHB患者中，LLV的情形也非罕見。日本Ogawa等[5]報道，經(jīng)ETV治療2年的CHB患者，仍有19.9%(38/191)處于LLV。我國Sun等[6]納入239例CHB患者，其中163例在基線時有明顯肝纖維化，經(jīng)ETV治療78周后，30%的患者仍可檢測到低水平HBV DNA。NUC治療中的LLV是預后不良的預測因素。TDF治療78周時血清HBV DNA可檢出(多在20～200 IU/ml之間)和飲酒是基線Ishak≥3分患者肝纖維化進展的兩個促進因素，表明持續(xù)、低水平的HBV DNA仍會促進肝纖維化進展[6]。NUC治療中的LLV還會增加罹患HCC的風險，韓國Kim等[7]納入875例接受ETV單藥治療的CHB患者，隨訪中位數(shù)為4.5年。LLV組和持續(xù)性病毒學應答組5年進展為HCC的風險比為1.98(14.3% vs 7.5%，P=0.015)，且風險集中于肝硬化患者。當接受ETV或TDF治療的CHB患者出現(xiàn)LLV時該如何處理，是當下臨床關心的問題：是繼續(xù)堅持治療，還是換用或聯(lián)合另一種NUC或長效干擾素；如需調(diào)整，如何確定調(diào)整的時機；調(diào)整后，病毒學應答率可提高多少；對患者的長期預后有多大改善。已有一些研究嘗試回答這些問題，如Ogawa等[5]在一項多中心、回顧性隊列研究中，連續(xù)納入313例日本CHB患者，經(jīng)ETV單藥(n=191)或NUC聯(lián)合治療(n=122)至少2年，其中ETV治療組34例維持LLV狀態(tài)，NUC聯(lián)合治療組9例仍維持LLV狀態(tài)。之后，所有受試者換為TAF治療，48周后，ETV經(jīng)治組和NUC聯(lián)合經(jīng)治組分別有97.1%(33/34)和77.8%(7/9)患者獲得完全病毒學應答，提示換用TAF可能有助于LLV問題的解決。此外，藥物用量、服藥方式和患者的依從性等現(xiàn)實因素也可能造成間歇性LLV，也應納入考量[8～10]。例如，有學者通過觀察TDF治療8年的CHB患者隊列(n=641)，發(fā)現(xiàn)病毒學突破或DNA閃現(xiàn)(blip)事件41次，平均DNA水平1 356拷貝/ml；其中71%(29/41)與患者依從性欠佳有關，繼續(xù)用藥都能獲得病毒學抑制，也未發(fā)現(xiàn)TDF相關耐藥突變。Liu等[10]傾向于認為，只要TDF治療時間足夠長，LLV并不至于觸發(fā)治療方案的改變。不過，該研究受試者為歐美人群，宿主和HBV基因型與亞洲均不同。未來需要更多的前瞻性、隨機雙盲對照臨床試驗，進一步明確如何更科學地管理LLV，以及解決LLV能使患者有多少現(xiàn)實獲益等重要問題。目前各大指南對HBV DNA檢測靈敏度(或稱LOD)都提出了更高要求(見表1)。目前，國內(nèi)外主流的HBV DNA定量試劑靈敏度可達到1～2 log10IU/ml或以下，且結果重復性較好[11]，超敏試劑將有助于臨床更早發(fā)現(xiàn)LLV。進一步說，病毒載量極低、接近檢測試劑LOD的LLV也應引起重視。Kim等[7]認為，間歇性、極低載量LLV同樣會導致不良預后。Sun等[6]發(fā)現(xiàn)，基線有肝纖維化、經(jīng)TDF治療的患者，即使HBV DNA“轉(zhuǎn)陰”(<20 IU/ml)，仍有6.3%的患者肝纖維化出現(xiàn)進展。對此可能的解釋是，作者使用的LOD和線性范圍低限均為20 IU/ml，靈敏度仍未達到美國肝病學會(AASLD)推薦的檢測靈敏度(5～10 IU/ml)，且研究者沒有區(qū)分HBV DNA“未檢測到”和“<20 IU/ml”線性檢測下限兩種結果模式，后者表示有PCR擴增曲線、仍有痕量DNA存在，只是無法準確定量(見圖1)。這樣一來，那些被判斷為DNA“陰性”的肝纖維化進展患者，實際上外周血可能仍存在痕量HBV DNA，即處于極低病毒載量的LLV狀態(tài)。據(jù)此我們建議，在LLV日益引起關注的當下，檢驗報告應增加對超敏HBV DNA試劑各種結果模式的備注，以幫助臨床醫(yī)師，尤其肝病科醫(yī)師，清楚辨析這些復雜的結果模式(見圖1)。從檢驗方法學角度分析，LLV風險和危害被不斷強調(diào)的當下，臨床診治對HBV DNA檢測下限的要求似乎“進無止境”，但我們究竟需要多么靈敏的HBV DNA檢測試劑？最近一項來自歐洲的獻血者和受血者的隨訪研究證實，抗-HBc陽性的隱匿性HBV感染(occult hepatitis B virus infection,OBI)的獻血者血液中含有0.15 IU/ml的HBV DNA，即可導致受血者感染[12]，而當前主流的HBV DNA定性或定量試劑，都遠遠達不到這個靈敏度要求。借鑒到臨床肝病診治的實踐中，我們還需待進一步明確極低病毒載量HBV感染者的自然轉(zhuǎn)歸，以及通過更強效NUC治療方案解決LLV后患者的真實獲益。此外，片面強調(diào)試劑的靈敏度會導致污染產(chǎn)生的低值陽性結果被誤當做LLV，從而給CHB的診治帶來困擾。PCR產(chǎn)物污染像一把懸于核酸檢測實驗室的“達摩克利劍”——一次充分反應的PCR可產(chǎn)生多達1012拷貝的DNA片段，將其投入標準的奧林匹克游泳池稀釋，再從中取出和反應體系相同體積的水，其中仍含有400拷貝的DNA片段，足以偽裝成LLV的假象[13]。面對LLV結果，應從臨床和檢驗方法學兩個角度辯證看待，如有必要，需動態(tài)監(jiān)測(見圖2)。此外，我們還需認識到，大部分國產(chǎn)試劑屬于開放性試劑，可靈活適應于不同的核酸提取平臺和PCR儀。但由此產(chǎn)生的問題是，操作過程及結果分析等步驟，易受操作者主觀因素影響，結果偏倚較大，這是既往報道的、國產(chǎn)試劑和進口封閉性試劑性能有差距的重要原因。新型冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)感染疫情客觀上促進了核酸檢測人員的培養(yǎng)和場地、設備在醫(yī)療機構的完善，全自動、封閉式的提取和擴增平臺以及結果自動定量算法的建立[14]，都可進一步減輕操作負擔，減少人為干擾，提高檢測靈敏度、準確度和重復性，應成為未來幾年國產(chǎn)核酸檢測的發(fā)展方向。

表1 最新指南中對HBV DNA檢測靈敏度的要求

圖1 超敏HBV DNA定量結果報告模式及對應的解釋

圖2 從臨床和檢驗方法學角度科學解讀和管理間歇性LLV

2 預測NUC治療停藥：HBV pgRNA有潛在價值

近年來，我國NUC藥品價格迅速降低，大大減輕了CHB患者長期服藥的經(jīng)濟負擔，但長期服藥仍面臨藥物副作用、依從性、精神壓力等挑戰(zhàn)。各指南均推薦了NUC停藥標準(見表2)。HBsAg的消失和(或)血清學轉(zhuǎn)換是CHB功能性治愈的可靠標志，但現(xiàn)有治療方案僅能使少數(shù)患者達到這一“理想終點”，因此HBsAg作為預測停藥標志物，受眾有限。近年來，新標志物如HBV前基因組RNA(pregenomic RNA,pgRNA)和核心相關抗原(hepatitis B core-related antigen,HBcrAg)等被陸續(xù)報道用于預測NUC治療停藥。pgRNA和HBcrAg均可反映cccDNA活性[18,19]，且血清中兩標志物水平也存在正相關[20]。在NUC治療中，兩個標志物的消失晚于HBV DNA而又早于HBsAg，因此，作為預測停藥標志物，理論上兼具靈敏性和特異性(見圖3)。Wang等[21]最早將pgRNA檢測用于停藥后復發(fā)風險研究，發(fā)現(xiàn)若停藥時血清pgRNA陽性，則100%(21/21)停藥后24周出現(xiàn)病毒學復發(fā)；若停藥時pgRNA測不到，則復發(fā)率僅為25%(3/12)。Fan等[22]納入127例HBeAg陽性、接受替比夫定聯(lián)合阿德福韋或替比夫定單藥治療的CHB患者作為實驗組，這些患者獲得HBeAg血清學轉(zhuǎn)換后停藥并隨訪4年。以停藥時血清HBV DNA和pgRNA作為臨床復發(fā)[HBV DNA>2 000 IU/ml，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine transaminase,ALT)≥2倍正常值上限]的預測指標，DNA和RNA“雙陰性”患者復發(fā)率為8%(2/25)，而DNA和(或)RNA陽性患者的復發(fā)率為31.4%(32/102，P=0.02)；此外，納入40例HBeAg陽性、接受ETV或TDF治療的患者作為驗證組，HBeAg血清學轉(zhuǎn)換后停止治療并隨訪5.5年，DNA和RNA“雙陰性”患者復發(fā)率為15.4%(2/13)，而DNA和(或)RNA陽性患者的復發(fā)率為33.3%(9/27，P=0.29)。Liu等[23]納入30例HBeAg陽性(n=17)和陰性(n=13)且符合一定停藥指征的CHB患者，隨訪2年，同樣發(fā)現(xiàn)pgRNA有停藥預測價值，相比停藥時血清pgRNA“陽性”患者，pgRNA“陰性”患者的臨床復發(fā)率更低(38.27% vs 17.50%，P=0.042)。從方法學角度看，HBV pgRNA的檢測技術壁壘較低，技術原理與丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)、人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)或SARS-CoV-2 RNA類似，已有基于實時熒光定量PCR原理的科研用試劑，LOD為50拷貝/ml，線性范圍為100～1×109拷貝/ml，不同試劑的定量結果也有一定的可比性[24]，但目前尚無國際標準品，也無獲得國家食品藥品監(jiān)督管理局批準注冊的試劑。值得注意的是，考慮到RNA提取純化過程中HBV DNA殘留可能會導致RNA水平被高估，從臨床意義和技術特點兩方面考慮，我們不建議將HBV pgRNA試劑用于HBV DNA高值陽性樣本的檢測；如確有必需，可考慮采用基于核酸依賴序列擴增(nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)技術的pgRNA檢測方法，可特異性擴增RNA而非雙鏈DNA[25]。總結新近的pgRNA指導停藥研究可發(fā)現(xiàn)，即使停藥時HBV pgRNA“轉(zhuǎn)陰”，仍有一定概率復發(fā)，提示我們兩點：第一，各研究所使用的pgRNA檢測方法不同，靈敏度也不盡相同，pgRNA“轉(zhuǎn)陰”患者，實際上可能是試劑LOD之下的低RNA載量患者。第二，pgRNA單獨(或與HBcrAg等指標并聯(lián))使用時，“陽性預測價值”(positive predictive value,PPV)更大，即“陽性”則提示有較高的復發(fā)風險，患者應繼續(xù)規(guī)范用藥；檢測結果“陰性”提示復發(fā)風險較低，但并非小到可以忽略，需綜合判斷。

表2 不同指南推薦的CHB患者停藥標準[4,12,13]

圖3 血清HBV DNA、RNA及HBcrAg、HBsAg在抗病毒治療過程中的動態(tài)變化[26]

3 NUC抗病毒治療：對HBV DNA、pgRNA定量試劑結果有影響

對于未經(jīng)NUC治療的CHB患者，外周血病毒核酸以Dane顆粒包裹的松弛環(huán)狀DNA(relaxed-circular DNA,rcDNA)為主，還有7%～20%的雙鏈線性DNA(duplex-linear DNA,dlDNA)[27]，現(xiàn)有的商品化試劑可檢測兩者，而不能區(qū)分是rcDNA還是dlDNA。不同HBV DNA試劑定量結果差異，主要源于引物或探針設計區(qū)域病毒突變造成的擴增效率降低，為避免這種情況，大多數(shù)HBV DNA試劑采用簡并引物或探針。而在NUC治療下，逆轉(zhuǎn)錄過程因NUC插入使rcDNA形成被抑制，血清HBV DNA主要由3′末端殘缺的不完整的負鏈DNA片段構成。臨床HBV DNA檢測時，位于5′端最先被逆轉(zhuǎn)錄出的X片段最易被檢測到，位于3′端的PreC/C基因序列則最早消失。與此相反，pgRNA片段位于3′端的X區(qū)的序列最易被丟失，而5′端的序列更易被保留。不同品牌HBV DNA和pgRNA定量試劑，針對不同的區(qū)域設計引物和探針[28]，檢測NUC治療患者血清，結果會有差異(見圖4)。我們回顧性檢測10例接受替比夫定治療的CHB患者系列血清中的HBV DNA和RNA，發(fā)現(xiàn)rcDNA在治療開始后最先消失，前C/C、S和X區(qū)基因片段依次消失；而出現(xiàn)病毒學反彈的患者，X區(qū)DNA首先出現(xiàn)[29]。由此可見，NUC治療會對HBV DNA和pgRNA檢測造成影響，如有必要，可像SARS-CoV-2或HIV RNA檢測試劑一樣，采用針對≥2個目標基因的引物和探針，以避免漏檢或低估病毒載量。此外，在pgRNA引物和探針區(qū)域的選擇上，還需考慮NUC治療下pgRNA剪接變異體的問題[30,31]。

圖4 NUC治療造成HBV DNA和RNA片段順次消失，從而影響不同品牌HBV DNA和pgRNA定量試劑結果

4 CHB診治現(xiàn)狀對檢測方法的需求：定性標志物追求“定量”，而定量標志物則追求“超敏”

HBV的血清學和分子生物學標志物眾多，大部分已實現(xiàn)定量化檢測(見表3)，同時，定量標志物又有進一步提高靈敏度的需求[32]。然而HBV診治的新舊標志物眾多，研究結論也有不盡相同甚至矛盾之處，反映出當前我們對HBV的復制和病理機制仍然了解不足，CHB的治療仍然欠缺有效根除病毒的手段，cccDNA潛伏、NUC需長期治療、部分治療的患者肝硬化和肝癌仍在潛滋暗長，這些都是我們無法回避的痛點和難點。推廣HBsAg定量、開發(fā)抗-HBc、HBcrAg和HBV pgRNA等新型定量標志物，苛求HBV DNA高靈敏度及準確性，仍是當前治療水平下、在根治性治療方法問世之前，實現(xiàn)CHB精準治療所需。

表3 HBV定量標志物的臨床診治價值及應用前景

續(xù)表3

5 結語

理論研究有助于新標志物應用于臨床，而現(xiàn)實世界中，可能面臨新技術難度大，可及性差，或新試劑性能缺乏全面評價，不同實驗室結果變異大、PCR攜帶污染或氣溶膠污染造成假陽性DNA/pgRNA結果等現(xiàn)實問題，提示我們有必要在理論和實踐之間尋找平衡。不過，即使如此，我們?nèi)孕鑼ρ邪l(fā)新標志物、不斷提高現(xiàn)有標志物檢測性能保持熱情，以不斷促進我們對HBV這一“狡猾”的病毒特性的理解。以“功能性治愈”甚至“根治”為目標的新藥研發(fā)，也需要納入這些標志物以評價有效性[33]。此外，從人類病毒學研究的歷史看，HBV的血清學和分子生物學標志物的研發(fā)和應用經(jīng)驗，也可為其他病毒或新發(fā)病毒的診治提供有益借鑒。