孫 波，鄭光輝，高 陽(yáng)，王亞?wèn)|，洪維禮，呂 紅，張國(guó)軍，康熙雄

感染性疾病一直是全球的重大醫(yī)療負(fù)擔(dān)，2019年WHO發(fā)布的全球十大健康威脅中，有6種與感染性疾病有關(guān)，其中包括流感、抗生素耐藥、埃博拉或其他病毒、疫苗猶豫、登革熱及艾滋病。尤其是2020年，隨著新型冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)在世界范圍內(nèi)傳播，使感染性疾病的診斷和治療處在了更重要的位置[1]。目前對(duì)于感染性疾病的臨床實(shí)驗(yàn)室診斷主要基于傳統(tǒng)的診斷方法，如病原體的培養(yǎng)[2]、核酸擴(kuò)增檢測(cè)、免疫檢測(cè)[3]等。近年來(lái)，隨著新技術(shù)如16S基因測(cè)序[4]、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)[5]的臨床應(yīng)用，大大提高了實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)感染性疾病的診斷能力。但由于技術(shù)所限，許多傳統(tǒng)方法無(wú)法獲得病原體信息(如50%神經(jīng)系統(tǒng)感染無(wú)法獲取病原體[6])，故需要精密度更高、應(yīng)用更廣泛的新技術(shù)來(lái)應(yīng)對(duì)越來(lái)越復(fù)雜的感染性疾病。下一代測(cè)序(next generation sequencing，NGS)是一種可對(duì)成千上萬(wàn)到數(shù)十億個(gè)DNA片段獨(dú)立和同時(shí)進(jìn)行高通量、大規(guī)模并行測(cè)序的方法[7]。近年來(lái)，NGS已經(jīng)從研究工具轉(zhuǎn)變?yōu)榕R床實(shí)驗(yàn)室診斷方法，并且在臨床微生物實(shí)驗(yàn)室中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。這些應(yīng)用包括全基因組測(cè)序(whole genome sequencing,WGS)、下一代靶向測(cè)序(target next generation sequencing,tNGS)和宏基因組測(cè)序(metagenomics next generation sequencing,mNGS)等;而以上各種應(yīng)用由于其自身的側(cè)重點(diǎn)不同而使得操作程序有所差異[8]。其測(cè)序方法可以在不需要PCR擴(kuò)增的情況下，直接對(duì)原始DNA/RNA樣品進(jìn)行測(cè)序，對(duì)CG核苷酸沒(méi)有偏好，可以直接檢測(cè)和獲取甲基化信息。對(duì)宏基因組的研究最早可追溯到20世紀(jì)80年代，研究人員在一篇土壤微生物的研究報(bào)道中首次提出宏基因組學(xué)(metagenomics)的概念[9]。mNGS是一種可以直接從患者標(biāo)本中進(jìn)行泛核酸檢測(cè)的方法，該方法不會(huì)有選擇地放大特定靶標(biāo)序列,因?yàn)樗鼤?huì)對(duì)所有樣品中的核酸放大和并行測(cè)序,允許無(wú)差別檢測(cè)所有微生物(如細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)和真菌)、抗體、毒力因子,甚至宿主生物標(biāo)志物等[10～12]。與傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室診斷方法不同，mNGS允許直接從患者標(biāo)本進(jìn)行泛核酸檢測(cè)，而無(wú)需病原體的培養(yǎng)。此方法將樣本內(nèi)的所有核酸提取并對(duì)其進(jìn)行平行測(cè)序，包含對(duì)宿主和病原體的所有核酸進(jìn)行測(cè)序，具有直接從患者標(biāo)本進(jìn)行無(wú)假設(shè)診斷的優(yōu)勢(shì)，這種方法既可以將DNA作為測(cè)序目標(biāo)，也可將RNA作為研究對(duì)象，且針對(duì)RNA的mNGS可稱為宏轉(zhuǎn)錄組NGS[13]。此外，mNGS可以從感染源或游離DNA(cell free DNA,cfDNA)中檢測(cè)完整的微生物。cfDNA是微生物死亡裂解后過(guò)濾到血液或無(wú)菌體液中的小核酸片段，可作為遠(yuǎn)端感染部位(如肺炎時(shí)的肺部)的讀數(shù)[14,15]。了解這些方法的差異和局限性是很重要的。例如，若基于RNA的方法不包括在mNGS程序中，RNA病毒將無(wú)法被檢測(cè)到，或者基于轉(zhuǎn)錄組的分析將不能用于研究宿主的免疫反應(yīng)。已有大量的文獻(xiàn)證明，mNGS可以作為一種針對(duì)于多個(gè)系統(tǒng)感染的診斷工具，例如中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染[16]、血流感染[17]、呼吸道感染[18]、胃腸道感染[19]、假關(guān)節(jié)感染[20]、尿路感染[21]和眼部感染[22]?？设b定出的病原體包括細(xì)菌、分枝桿菌、RNA病毒、DNA病毒、酵母、絲狀真菌和寄生蟲(chóng)。在少數(shù)病例中，經(jīng)典的診斷手段仍然發(fā)揮著重要的作用，而mNGS在檢測(cè)以前治療過(guò)的患者中新的、罕見(jiàn)的、非典型病原體導(dǎo)致的感染方面特別成功，并且在多種病原體導(dǎo)致的協(xié)同感染與耐藥基因檢測(cè)方面也發(fā)揮著重要的作用。本文對(duì)mNGS在感染性疾病中的應(yīng)用進(jìn)行綜述，以求更好地支持臨床診斷。

1 mNGS作為常規(guī)臨床檢測(cè)手段的前景

有研究表明，與傳統(tǒng)的診斷相比，mNGS具有更高的敏感性，因此對(duì)mNGS的應(yīng)用前景更具有指導(dǎo)意義。一項(xiàng)針對(duì)于不同標(biāo)本來(lái)源的橫向?qū)Ρ葘?shí)驗(yàn)顯示，mNGS的總體臨床檢測(cè)敏感度和特異度分別為50.7%和85.7%，而傳統(tǒng)方法的診斷敏感度和特異度分別為35.2%和89.1%，值得注意的是，mNGS在結(jié)核桿菌、病毒、厭氧菌和真菌方面的檢測(cè)尤其突出[23]。此外，與液體培養(yǎng)相比，mNGS在鑒定假關(guān)節(jié)感染中的病原體方面顯示出更高的敏感度，可達(dá)到88%[95%置信區(qū)間(confidence interval,CI)，77.1%～94.5%]，特異度為80%(95%CI，71%～88%)[24]。越來(lái)越多快速測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，有助于將mNGS轉(zhuǎn)化為傳染病的常規(guī)診斷工具。由于微生物實(shí)驗(yàn)室目前依然采用傳統(tǒng)微生物鑒定方法，即使是自動(dòng)化的儀器依然依賴基于生長(zhǎng)的方法，需要較長(zhǎng)時(shí)間得到結(jié)果，導(dǎo)致漏診或延遲診斷以及臨床醫(yī)師通過(guò)經(jīng)驗(yàn)性地使用廣譜抗生素或抗真菌藥物的濫用。因此我們認(rèn)為mNGS可以作為一種非侵入性的替代工具，用于分析那些感染患者的容易獲得的樣本(如血液、尿液等)。我們需要更多的臨床經(jīng)驗(yàn)來(lái)支持這些新的檢測(cè)思路的實(shí)施，例如，在mNGS鑒定病原體時(shí)，需要明確哪些傳染病和這些疾病的哪些階段適合收集易于獲取的樣本等。2020年在中國(guó)發(fā)布了《中國(guó)宏基因組學(xué)第二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)感染病原體的臨床應(yīng)用專家共識(shí)》，該共識(shí)對(duì)于宏基因組學(xué)在病原菌的檢測(cè)、耐藥基因檢測(cè)、宿主免疫監(jiān)測(cè)、病原體定量、疑難罕見(jiàn)病等領(lǐng)域中推動(dòng)感染性疾病精準(zhǔn)診療的發(fā)展。

2 mNGS對(duì)于罕見(jiàn)病原體的檢測(cè)

有文獻(xiàn)報(bào)道1例罕見(jiàn)的慢性神經(jīng)鉤端螺旋體病，患者為14歲男孩，急性發(fā)作后持續(xù)數(shù)月，傳統(tǒng)的方法如腦脊液培養(yǎng)、血清學(xué)試驗(yàn)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR都未能發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致感染的病原體。特別是各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染中檢測(cè)較為罕見(jiàn)的侵入性病原體。對(duì)腦脊液樣本進(jìn)行mNGS檢測(cè)，確定了鉤端螺旋體特異性序列，隨后的血清學(xué)檢測(cè)和PCR檢測(cè)也確認(rèn)了鉤端螺旋體感染[25]。另一案例顯示，臨床醫(yī)師通過(guò)mNGS分析腦脊液樣本，診斷出1例致死性腦膜腦炎，并迅速鑒定出一種罕見(jiàn)的傳染源Balamuthia mandrillaris[26]。Ai等[27]于2017-07報(bào)道了1例由偽狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)引起的傳染性眼內(nèi)炎，結(jié)果表明，PRV可能通過(guò)與豬污染物的直接接觸而感染人類。Wylie等[28]使用mNGS發(fā)現(xiàn)痤瘡丙酸桿菌(皮膚正常菌群的一部分)是慢性腦膜炎的原因之一，與對(duì)照組相比，臨床樣本中痤瘡丙酸桿菌特異性序列數(shù)量更多，基因組覆蓋率高，治療效果也支持他們的結(jié)論。以上案例顯示，mNGS可以為罕見(jiàn)病原體提供精準(zhǔn)診斷思路，更好地解決臨床感染問(wèn)題。在神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病中，建議mNGS與常規(guī)微生物檢測(cè)聯(lián)合應(yīng)用，可提高中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的病原學(xué)診斷。

3 mNGS對(duì)于協(xié)同感染的檢測(cè)

mNGS的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它可以在一次試驗(yàn)中同時(shí)檢測(cè)到多種病原體，協(xié)同感染的患者表現(xiàn)出不同的免疫特征(對(duì)病原體攻擊的抵抗)，而且一個(gè)病原體可能在不同的患者中表現(xiàn)出毒性差異。2016年，Sardi等[29]通過(guò)mNGS檢測(cè)，在巴西2例已確診寨卡病毒感染的患者身上發(fā)現(xiàn)了寨卡和基孔肯雅病毒(Chikungunya fever，CHIKV)的協(xié)同感染。在這兩個(gè)案例中，CHIKV的結(jié)果都被特異性的RT-PCR驗(yàn)證，這強(qiáng)調(diào)了無(wú)偏倚的mNGS在鑒定協(xié)同感染方面的潛在應(yīng)用價(jià)值。在另一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)艱難梭菌可能與產(chǎn)氣梭狀芽胞桿菌和腹瀉患者糞便樣本中的4種病毒屬同時(shí)存在，雖然可以通過(guò)其他方法證實(shí)這些微生物的存在，但無(wú)法區(qū)分是哪種病原體導(dǎo)致了疾病。而對(duì)臨床醫(yī)師來(lái)說(shuō)，確定候選治療的主要藥物是一項(xiàng)挑戰(zhàn)，聯(lián)合治療是對(duì)抗協(xié)同感染的常見(jiàn)策略，但隨著mNGS技術(shù)越來(lái)越多地應(yīng)用于臨床，個(gè)別病例中可能同時(shí)檢測(cè)到更多假定的病原體。只有深入了解這些病原體的致病特性，才能解決協(xié)同感染的問(wèn)題。

4 mNGS對(duì)于耐藥基因的檢測(cè)

mNGS可以對(duì)病原體進(jìn)行耐藥基因的檢測(cè)，常規(guī)藥敏試驗(yàn)(antimicrobial susceptibility test,AST)或傳統(tǒng)耐藥基因檢測(cè)方法需要對(duì)病原菌進(jìn)行分離，耗時(shí)較長(zhǎng)且操作復(fù)雜，對(duì)不可培養(yǎng)的細(xì)菌無(wú)能為力。mNGS能夠檢測(cè)病原體的基因組(部分或全部長(zhǎng)度)，因此在整個(gè)細(xì)菌群落中對(duì)耐藥相關(guān)基因具有極大的檢測(cè)能力。2017年，一項(xiàng)研究證明，在單微生物和多微生物樣本中，經(jīng)mNGS檢測(cè)，可分別預(yù)測(cè)94.1%和76.5%的骨和關(guān)節(jié)感染病原體正確的抗生素敏感性[30]。同時(shí)mNGS在HIV耐藥基因的檢測(cè)和分型方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)[31]。

5 結(jié)語(yǔ)

mNGS在泛病原體檢測(cè)試驗(yàn)中的潛力已在許多研究和臨床背景中得到證實(shí)，其可以在不需要患者感染信息的情況下檢測(cè)不常見(jiàn)和協(xié)同感染病原體，在耐藥性預(yù)測(cè)方面具有優(yōu)勢(shì)，為危重患者或免疫缺陷患者難以診斷的感染提供新的診斷線索。隨著測(cè)序成本的持續(xù)降低，以及診斷和信息學(xué)的自動(dòng)化程度越來(lái)越高，更多的大中型實(shí)驗(yàn)室可能會(huì)實(shí)施mNGS，因?yàn)榕c一代測(cè)序替代方法相比，其成本更具競(jìng)爭(zhēng)力，而且這些方法將成為標(biāo)準(zhǔn)化方法，甚至超越使用探針或特異性PCR擴(kuò)增子的16S擴(kuò)增方法[32]。對(duì)于mNGS的臨床應(yīng)用，各種樣品類型的方法將會(huì)有更多的標(biāo)準(zhǔn)化和改進(jìn)，包括如何解釋和量化樣品中復(fù)雜微生物群(如呼吸菌群、尿液菌群)中的病原體。此外，人們很可能看到這些測(cè)試轉(zhuǎn)化為精確的醫(yī)學(xué)診斷，整合病原體、微生物組和宿主轉(zhuǎn)錄組研究[33]，以更好地定義疾病狀態(tài)。雖然在樣品處理、工作流程建立、分析管道、法規(guī)要求和結(jié)果解釋等方面還存在缺陷，然而更有效的工作流程、更低的檢測(cè)成本、更短的實(shí)驗(yàn)室周轉(zhuǎn)時(shí)間以及簡(jiǎn)化的解釋標(biāo)準(zhǔn)促使mNGS將被臨床醫(yī)師、微生物診斷專家和患者廣泛接受。因此，隨著測(cè)序技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，以及更多的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)和評(píng)估，在未來(lái)5～10年，盡管mNGS不太可能完全取代傳統(tǒng)的病原體鑒定和AST方法，但mNGS仍然有著巨大的潛力，并隨著時(shí)間的推移不斷改進(jìn)，為感染性疾病提供更強(qiáng)的診斷能力。