孫平勇 張武漢 張 莉 舒 服 何 強(qiáng) 彭志榮 鄧華鳳,3,*

水稻氮高效、耐冷基因功能標(biāo)記的開(kāi)發(fā)及其利用

孫平勇1張武漢1張 莉2舒 服1何 強(qiáng)1彭志榮1鄧華鳳1,3,*

1湖南雜交水稻研究中心雜交水稻國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 湖南長(zhǎng)沙 410125;2湖南省核農(nóng)學(xué)與航天育種研究所, 湖南長(zhǎng)沙 410125;3湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 湖南長(zhǎng)沙 410125

通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇(molecular marker-assisted selection, MAS)培育氮高效水稻品種是減少氮肥使用量、發(fā)展綠色農(nóng)業(yè)和可持續(xù)農(nóng)業(yè)的一個(gè)重要途經(jīng)。水稻基因編碼生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子蛋白, 編碼區(qū)第487和488堿基由TC變異為AA, 導(dǎo)致絲氨酸突變?yōu)橘嚢彼? 使得水稻具有氮高效利用、高產(chǎn)和耐冷的特性。為了提高基因在育種中的選擇效率, 本研究根據(jù)功能SNP (single nucleotide polymorphism)位點(diǎn)設(shè)計(jì)和篩選出等位基因特異PCR (polymerase chain reaction)功能標(biāo)記PF+DMR+PR和PF+XMR+PR。利用此功能標(biāo)記對(duì)不同品種(品系)和川大粒/巨穗稻的F2群體進(jìn)行基因型檢測(cè), 結(jié)合測(cè)序分析驗(yàn)證, 能準(zhǔn)確快速鑒定的純合顯性、純合隱性和雜合基因型, 且具有操作簡(jiǎn)單、成本低的特點(diǎn)。本研究開(kāi)發(fā)的功能標(biāo)記為通過(guò)MAS方法利用基因培育氮高效、高產(chǎn)和耐冷水稻新品種提供了技術(shù)支撐。

水稻; 氮高效利用; 耐冷;基因; 等位基因特異性PCR

2020年5月, 世界實(shí)時(shí)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示全球人口已達(dá)77.85億。按照每年1億的增長(zhǎng)速度, 到2050年, 全球人口總數(shù)將接近100億。據(jù)預(yù)測(cè), 到本世紀(jì)中葉全世界的農(nóng)業(yè)水平要比2005年提高60%~120%才能養(yǎng)活100億人口。水稻是最重要的糧食作物之一, 稻谷的增產(chǎn)與穩(wěn)產(chǎn)對(duì)我國(guó)乃至世界的糧食安全至關(guān)重要。適量的氮肥使用對(duì)于提高水稻產(chǎn)量和改善稻米品質(zhì)起著重要作用。然而, 近年來(lái)我國(guó)在追求水稻高產(chǎn)過(guò)程中, 過(guò)量施用氮肥及氮肥利用率低已成為普遍現(xiàn)象[1-2]。這不僅增加水稻生產(chǎn)成本, 影響稻米品質(zhì), 而且對(duì)生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重的影響。因此, 提高水稻的氮利用率刻不容緩。研究表明, 不同施氮水平下, 氮高效水稻“庫(kù)”大、“源”足、“流”暢, 其庫(kù)容量和產(chǎn)量均明顯高于氮低效水稻[3]。因此, 挖掘水稻氮高效基因并通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇(molecular marker- assisted selection, MAS)培育氮高效水稻品種是發(fā)展綠色、高效和可持續(xù)發(fā)展農(nóng)業(yè)的一個(gè)重要途經(jīng)[4]。

近年來(lái), 隨著測(cè)序技術(shù)、基因編輯和功能基因組學(xué)的飛快發(fā)展, 加速了水稻氮吸收與調(diào)控基因的克隆及其分子機(jī)理的解析。目前,[5]、[6]、[7]、[8]、[9]、[10-11]、[12]、[13]、[14]、[15]、[15]等參與氮吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)的基因被成功克隆。其中,是氮高效利用的一個(gè)關(guān)鍵基因, 通過(guò)平衡生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子與生長(zhǎng)抑制因子之間的關(guān)系, 可以同時(shí)增加“綠色革命”水稻品種的氮利用效率和產(chǎn)量[13]。是一個(gè)多效基因, 本團(tuán)隊(duì)最先將粒形基因/精細(xì)定位在水稻第2染色體33 kb的區(qū)間[16]。后來(lái)發(fā)現(xiàn)水稻基因編碼區(qū)序列全長(zhǎng)1185 bp, 有5個(gè)外顯子。第3外顯子的SNP3位點(diǎn)由TC突變?yōu)锳A, 導(dǎo)致絲氨酸變異為賴氨酸, 使得水稻籽粒落粒性降低、產(chǎn)量增加、氮利用率提高和苗期耐冷性增強(qiáng)。此突變正好位于的調(diào)控結(jié)合部位, 為功能位點(diǎn)[13,17-22]。

為了通過(guò)MAS方法培育氮高效、耐冷和高產(chǎn)水稻新品種, 加快育種進(jìn)程, 本研究根據(jù)基因功能位點(diǎn)的堿基差異, 設(shè)計(jì)了2組功能標(biāo)記。進(jìn)一步利用該標(biāo)記對(duì)水稻種質(zhì)資源和川大粒/巨穗稻F2群體的基因進(jìn)行了鑒定, 結(jié)合測(cè)序數(shù)據(jù)證明了該功能標(biāo)記只需通過(guò)PCR (polymerase chain reaction)擴(kuò)增和瓊脂糖電泳即可快速準(zhǔn)確鑒定出純合型、雜合型和純合型3種基因型。本研究開(kāi)發(fā)的功能標(biāo)記為基因的分子育種奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試水稻材料包括攜帶功能基因的對(duì)照品種川大粒與近等基因系NIL-, 不攜帶功能基因的對(duì)照品種巨穗稻與NIL-, 不同來(lái)源的20個(gè)品種資源, 以及川大粒/巨穗稻的F2群體22個(gè)單株。所有材料均于2019年正季種植于湖南雜交水稻研究中心試驗(yàn)田。供試引物: 與共分離的分子標(biāo)記GL2-11-F: 5′-GAGAAAGCCATTAGTG CA-3′, GL2-11-R: 5′-TCTACCAAACCAAAACAA-3′[16]。

1.2 OsGRF4基因功能標(biāo)記的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)基因序列和功能位點(diǎn)的差異, 通過(guò)Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)了6條引物。引物序列為PF: 5′-CTGTGAACCAACACCCTG-3′, PR: 5′-CGGC AATAGCAGGGTAAA-3′, DR: 5′-CGTTTCCACAG GCTTTCTTTT-3′, XR: 5′-CGTTTCCACAGGCTTT CTTGA-3′, DMR: 5′-CGTTTCCACAGGCTTTCTT T-3′, XMR: 5′-CGTTTCCACAGGCTTTCTGA-3′, 其中下劃線的堿基C是人為引入的錯(cuò)配堿基。引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 DNA提取、PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)

取水稻幼苗期葉片, CTAB法提取基因組DNA。利用T3 Super Mix體系(北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增: 98℃預(yù)變性2 min; 98℃變性10 s、57℃復(fù)性10 s、72℃延伸10 s, 35個(gè)循環(huán); 72℃延伸2 min; 4℃冷卻, 反應(yīng)產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠上100 V電泳40 min; 染色后于凝膠成像系統(tǒng)下觀察分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 OsGRF4基因功能標(biāo)記的開(kāi)發(fā)策略

根據(jù)基因功能位點(diǎn)SNP3 (TC-AA)的突變?cè)O(shè)計(jì)功能標(biāo)記, 總共開(kāi)發(fā)了6條引物。首先, 設(shè)計(jì)一對(duì)外引物PF和PR用作參考對(duì)照, 無(wú)論是哪種基因型都能擴(kuò)增出488 bp的條帶, 其擴(kuò)增產(chǎn)物包含SNP3位點(diǎn); 再根據(jù)SNP3的多態(tài)性設(shè)計(jì)2條反向內(nèi)引物DR和XR, 其3′端分別對(duì)應(yīng)堿基AA和TC, DR與基因完全匹配, XR與完全匹配; 此外, 為了增強(qiáng)PCR擴(kuò)增的特異性, 分別在引物DR和XR的3′端第4位人為引入錯(cuò)配堿基C, 設(shè)計(jì)了引物DMR和XMR。根據(jù)設(shè)計(jì)引物的原理進(jìn)行預(yù)測(cè): 如果含有基因, 引物組合PF、DR (或DMR)和PR則能擴(kuò)增出488 bp和370 bp兩條目的帶, 而PF、XR (或XMR)和PR組合則只能擴(kuò)增出488 bp的目的帶; 如果含有等位基因, 引物組合PF、DR (或DMR)和PR只能擴(kuò)增出488 bp的目的帶, PF、XR (或XMR)和PR組合能擴(kuò)增出488 bp和370 bp兩條目的帶; 假如是雜合型, PF、DR (或DMR)和PR組合以及PF、XR (或XMR)和PR組合均能擴(kuò)出370 bp和488 bp兩條目標(biāo)帶(圖1)。因此, 利用2種引物組合通過(guò)2次PCR擴(kuò)增就可以區(qū)分2種純合和1種雜合基因型。

SNP3為功能性多態(tài)位點(diǎn), PF和PR為外引物, DR和XR為反向內(nèi)引物, 分別與堿基AA和TC匹配。分別在DR和XR的3′端引入錯(cuò)配堿基C開(kāi)發(fā)了DMR和XMR。箭頭表示擴(kuò)增方向。

SNP3 indicates functional polymorphic sites; PF and PR are outer primers; DR and XR are reverse inner primers, which matching the bases AA and TC, respectively. A mismatch base C was introduced in the 3′ end of DR and XR to develop DMR and XMR. The arrows indicate amplification direction of the primers.

2.2 OsGRF4基因功能標(biāo)記的篩選和驗(yàn)證

為了篩選最優(yōu)的功能標(biāo)記, 以川大粒(攜帶功能基因)和巨穗稻(攜帶)的DNA為模板, 通過(guò)不同引物組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增。圖2所示, PF+PR引物在川大粒和巨穗稻中均能擴(kuò)出488 bp的目標(biāo)帶(泳道1和泳道2); PF+DR或PF+DMR在川大粒中能擴(kuò)出370 bp的目標(biāo)帶(泳道3和泳道11), 而在巨穗稻中擴(kuò)不出(泳道4和泳道12); PF+XR或PF+XMR在巨穗稻中能擴(kuò)出370的目標(biāo)帶(泳道6和泳道14), PF+XR在川大粒中能擴(kuò)出淡淡的目的帶(泳道5, 理論上應(yīng)該擴(kuò)不出), 而PF+XMR在川大粒中擴(kuò)不出(泳道13), 因此PF+XMR優(yōu)于PF+XR組合; PF+DR+PR或PF+DMR+PR組合在川大粒中能擴(kuò)出370 bp和488 bp的兩條目標(biāo)帶(泳道7和泳道15), 而在巨穗稻中只能擴(kuò)出一條488 bp的帶(泳道8和泳道16); PF+XR+PR或PF+XMR+PR在巨穗稻中能擴(kuò)出370 bp和488 bp的兩條目標(biāo)帶(泳道10和泳道18), 但是PF+XMR+PR的擴(kuò)增效果要優(yōu)于PF+XR+PR, 2種組合在川大粒中均只能擴(kuò)出一條488 bp的帶(泳道9和泳道17)。因此, 確定PF+DMR+PR和PF+XMR+PR為最優(yōu)的功能標(biāo)記組合。

單數(shù)泳道為川大粒; 雙數(shù)泳道為巨穗稻; M: 100 bp marker; 1, 2: PF+PR; 3, 4: PF+DR; 5, 6: PF+XR; 7, 8: PF+DR+PR; 9, 10: PF+XR+PR; 11, 12: PF+DMR; 13, 14: PF+XMR; 15, 16: PF+DMR+PR; 17, 18: PF+XMR+PR.

The singular lane is ‘Chuandali’, the dual lane is ‘Jusuidao’. M: 100 bp marker; 1, 2: PF+PR; 3, 4: PF+DR; 5, 6: PF+XR; 7, 8: PF+DR+PR; 9, 10: PF+XR+PR; 11, 12: PF+DMR; 13, 14: PF+XMR; 15, 16: PF+DMR+PR; 17, 18: PF+XMR+PR.

2.3 功能標(biāo)記對(duì)不同品種OsGRF4基因型的鑒定

以川大粒、巨穗稻以及近等基因系NIL-和NIL-為對(duì)照, 利用設(shè)計(jì)的功能標(biāo)記對(duì)20份不同來(lái)源的種質(zhì)資源進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示: 川大粒與NIL-的擴(kuò)增結(jié)果一致, 巨穗稻與NIL-的結(jié)果一致。當(dāng)以PF+DMR+PR組合進(jìn)行擴(kuò)增時(shí), 20份資源均只能得到1條488 bp的目標(biāo)帶(圖3-A); 當(dāng)以PF+XMR+PR組合進(jìn)行擴(kuò)增時(shí), 20份資源均能擴(kuò)出370 bp和488 bp兩條目標(biāo)帶(圖3-B)。說(shuō)明這些品種均不含有功能基因, 這與文獻(xiàn)報(bào)道的突變位點(diǎn)為稀有變異一致[19,21]。此外, 功能標(biāo)記PF+DMR+PR和PF+XMR+PR的檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序結(jié)果[21]完全一致, 因此, 利用此功能標(biāo)記可以準(zhǔn)確快速鑒定出水稻資源中是否含有氮高效、耐冷基因。

2.4 功能標(biāo)記對(duì)F2分離群體OsGRF4基因型的鑒定

為了進(jìn)一步驗(yàn)證功能標(biāo)記對(duì)雜合基因型的鑒定效果, 對(duì)川大粒/巨穗稻F2群體的22個(gè)單株進(jìn)行檢測(cè)。首先, 利用與共分離標(biāo)記GL2-11對(duì)F2的22個(gè)單株進(jìn)行基因型分析, 結(jié)果顯示有5個(gè)單株(泳道3、泳道6、泳道8、泳道11和泳道16)為純合型, 8個(gè)單株為純合型(泳道17~24), 9個(gè)單株能擴(kuò)出2種親本條帶為雜合型(圖4)。然后, 利用功能標(biāo)記對(duì)這22個(gè)單株進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 為了便于觀察分析, 根據(jù)GL2-11的結(jié)果將樣品以純合型、雜合型和純合型的順序排列。結(jié)果顯示, 如果是純合型(泳道3~7), 當(dāng)以PF+DMR+PR組合進(jìn)行擴(kuò)增時(shí), 能擴(kuò)出370 bp和488 bp的2條目標(biāo)帶,而PF+XMR+PR組合則只能得到1條488 bp的目標(biāo)帶;純合型(泳道17~24)的結(jié)果與純合型恰好相反; 而雜合型(泳道8~16), PF+DMR+PR組合和PF+XMR+PR組合均能擴(kuò)出370 bp和488 bp兩條目標(biāo)帶(圖5), 檢測(cè)結(jié)果與預(yù)期的結(jié)果完全一致。因此, 本文設(shè)計(jì)的功能標(biāo)記可以有效對(duì)純合、雜合型和純合3種基因型進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定, 適合用于基因的MAS育種。

A: PF+DMR+PR引物組合; B: PF+XMR+PR引物組合; M: 100 bp marker; 1: 川大粒; 2: 巨穗稻; 3: NIL-; 4: NIL-; 5~24: 農(nóng)香99, 玉針香, 湘晚秈17, 岡46B, BL122, 佳輻占, 農(nóng)香18, 明恢86, 新銀占, 玉柱香, R700, 豐源 B, 農(nóng)香29, 南洋占, R299, 02428, C418, P7144, 農(nóng)香16, CY016。

A: PF+DMR+PR; B: PF+XMR+PR; M: 100 bp marker; 1: Chuandali; 2: Jusuidao; 3: NIL-; 4: NIL-; 5–24: Nongxiang 99, Yuzhenxiang, Xiangwanxian 17, Gang 46B, BL122, Jiafuzhan, Nongxiang 18, Minghui 86, Xinyinzhan, Yuzhuxiang, R700, Fengyuan B, Nongxiang 29, Nanyangzhan, R299, 02428, C418, P7144, Nongxiang 16, CY016.

M: 100 bp marker; 1: 川大粒; 2: 巨穗稻; 3~24: F2分離單株。

M: 100 bp marker; 1: Chuandali; 2: Jusuidao; 3–24: individual plants isolated from F2population.

M: 100 bp marker; A: PF+DMR+PR; B: PF+XMR+PR; 1: 川大粒; 2: 巨穗稻; 3~24: F2分離單株。

M: 100 bp marker; A: PF+DMR+PR; B: PF+XMR+PR; 1: Chuandali; 2: Jusuidao; 3–24: individual plants isolated from F2population.

3 討論

MAS育種是利用與目標(biāo)基因緊密連鎖或者來(lái)自目標(biāo)基因內(nèi)部的分子標(biāo)記, 對(duì)雜交后代的基因型進(jìn)行快速準(zhǔn)確鑒定, 達(dá)到選擇目標(biāo)性狀的目的。它不受外界環(huán)境的干擾, 因此能顯著提高育種的效率, 已成為作物遺傳改良的重要輔助工具。根據(jù)基因組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè), 水稻大約有4~5萬(wàn)個(gè)功能基因, 目前有1000多個(gè)控制產(chǎn)量、品質(zhì)、株型以及抗生物逆境與非生物逆境的基因被克隆[23]。雖然已克隆的基因較多, 但是通過(guò)MAS手段在水稻育種中得以利用的卻是少數(shù), 主要是缺乏簡(jiǎn)單實(shí)用的分子標(biāo)記[24]。

開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)和實(shí)用的分子標(biāo)記是高效開(kāi)展作物MAS育種的基礎(chǔ)。早期開(kāi)發(fā)的大多是與目標(biāo)基因緊密連鎖或共分離的分子標(biāo)記, 這種標(biāo)記與目標(biāo)基因之間會(huì)發(fā)生重組交換, 容易導(dǎo)致假陽(yáng)性和選擇效率低。如程保山等[25]利用連鎖SSR標(biāo)記對(duì)育性恢復(fù)基因進(jìn)行選擇, 結(jié)果表明3726R系列的育性恢復(fù)力只有94.1%。梁毅等[26]利用共顯性InDel標(biāo)記對(duì)廣譜抗稻瘟基因進(jìn)行選擇, R640×谷梅4號(hào)組合的稻瘟病抗性選擇率只有95%。后來(lái)Andersen等[27]提出功能標(biāo)記的概念, 它是根據(jù)等位基因功能位點(diǎn)的DNA序列差異設(shè)計(jì)的標(biāo)記。由于來(lái)自基因本身, 功能標(biāo)記不會(huì)發(fā)生重組交換而導(dǎo)致假陽(yáng)性, 對(duì)目標(biāo)基因的選擇效率可以達(dá)到100%, 因此功能標(biāo)記在水稻MAS中被廣泛應(yīng)用[28-29]。胡雪嬌等[30]根據(jù)水稻耐高溫基因功能SNP (single nucleotide polymorphisms)的差異設(shè)計(jì)了dCAPS標(biāo)記, 可以對(duì)F2群體的不同基因型進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。陳濤等[31]根據(jù)除草劑抗性基因編碼區(qū)堿基差異開(kāi)發(fā)的功能標(biāo)記, 可以準(zhǔn)確區(qū)分3種不同的基因型, 并且選擇的結(jié)果與苗期除草劑的抗性完全一致。

水稻很多基因的功能是由于SNP的變異造成的, 比如水稻香味基因[32]稻瘟病抗性基因[33]粒重主效基因[34]抗除草劑基因[35]氮高效基因[36][37]究的氮高效、耐冷基因[17-22]。SNP檢測(cè)的主要方法是通過(guò)PCR擴(kuò)增, 然后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收測(cè)序。另一種方法是根據(jù)SNP信息開(kāi)發(fā)CAPS或者dCAPS標(biāo)記, 它受酶切位點(diǎn)的限制, 同時(shí)需要增加酶切的步驟。測(cè)序和酶切的方法增加了檢測(cè)成本和勞動(dòng)強(qiáng)度, 不適合檢測(cè)大量的遺傳材料。擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)PCR (amplification refractory mutation system PCR, ARMS-PCR)又稱等位基因特異性PCR (allele-specific PCR, AS-PCR), 其原理是根據(jù)目的基因SNP的差異分別設(shè)計(jì)特異引物, 只在匹配的基因型中有擴(kuò)增產(chǎn)物, 可以鑒定出包括雜合型的3種基因型。AS-PCR省去了測(cè)序和酶切的步驟, 具有快速和費(fèi)用低的特點(diǎn), 已廣泛用于水稻MAS育種。王軍等根據(jù)水稻稻瘟病抗性基因功能區(qū)域的核苷酸差異開(kāi)發(fā)了AS-PCR功能標(biāo)記, 可以準(zhǔn)確鑒定出的不同基因型[38]。后來(lái)在ARMS-PCR的基礎(chǔ)之上開(kāi)發(fā)了四引物擴(kuò)增受阻突變PCR (tetra-primer ARMS-PCR), 通過(guò)1次PCR擴(kuò)增就可以區(qū)分3種基因型[39]。然而Tetra-Primer ARMS-PCR的4條引物在同一PCR體系中, 引物的濃度比酶的濃度以及退火溫度都會(huì)影響擴(kuò)增效率和特異性, 因此很難避免擴(kuò)增效率低和非特異延伸的問(wèn)題, 最終導(dǎo)致檢測(cè)準(zhǔn)確性降低, 限制了其在MAS中的應(yīng)用[39-40]。

氮素是水稻生長(zhǎng)發(fā)育所必需的營(yíng)養(yǎng)元素, 水稻產(chǎn)量與氮肥的施用量密切相關(guān)。研究表明粳稻比秈稻的氮肥利用率要低[41]。過(guò)量施用氮肥會(huì)造成嚴(yán)重的生態(tài)環(huán)境問(wèn)題, 解決此問(wèn)題的關(guān)鍵是通過(guò)MAS培育氮高效利用的水稻品種。是氮高效利用的一個(gè)重要基因, 利用可以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)量和氮肥利用率的雙增長(zhǎng)[13]。此外,的突變類型屬于稀有變異[19,21], 是一種新的遺傳資源, 因此它在水稻遺傳育種中具有較大的應(yīng)用前景。Makoto Matsuoka在上評(píng)論說(shuō),將在可持續(xù)農(nóng)業(yè)中發(fā)揮巨大的作用[42]。開(kāi)發(fā)基因的功能標(biāo)記是開(kāi)展該基因MAS育種的前提。本研究對(duì)AS-PCR進(jìn)行了改進(jìn), 增加了1對(duì)外引物用作參考對(duì)照, 無(wú)論是哪種基因型都能擴(kuò)增出488 bp的條帶; 此外, 根據(jù)功能位點(diǎn)SNP3 (TC-AA)的突變開(kāi)發(fā)了相應(yīng)的內(nèi)引物。通過(guò)優(yōu)化篩選證明, 在3′端第4位引入錯(cuò)配堿基的引物組合比沒(méi)有引入錯(cuò)配的組合的擴(kuò)增效果要好, 最終確定PF+DMR+PR和PF+XMR+PR為基因最優(yōu)的功能標(biāo)記組合。通過(guò)2次PCR擴(kuò)增, 對(duì)水稻不同品種資源以及F2群體的進(jìn)行鑒定, 結(jié)合測(cè)序的結(jié)果, 證明本研究開(kāi)發(fā)的功能標(biāo)記可以同時(shí)對(duì)純合、雜合型和純合3種基因型進(jìn)行精準(zhǔn)快速鑒定。在利用基因進(jìn)行回交選育的過(guò)程中, 大多情況只需把目標(biāo)基因型AA純合和AA/TC雜合型篩選出來(lái)就可以, 利用本研究的PF+DMR+PR引物組合進(jìn)行1次PCR反應(yīng)就可以準(zhǔn)確快速篩選出2種目標(biāo)基因型。因此本研究開(kāi)發(fā)的功能標(biāo)記組合可以很好的應(yīng)用于相關(guān)資源基因鑒定與MAS育種。

4 結(jié)論

根據(jù)氮高效、耐冷基因功能區(qū)域存在的單核苷酸差異(TC-AA), 并在3′端第4位引入1個(gè)錯(cuò)配堿基, 開(kāi)發(fā)了AS-PCR功能標(biāo)記組合PF+DMR+PR和PF+XMR+PR。PF+DMR+PR能特異擴(kuò)增純合基因型; PF+XMR+PR能特異擴(kuò)增純合基因型; PF+DMR+PR與PF+XMR+PR均能擴(kuò)增出2條帶的為雜合型。該標(biāo)記可以對(duì)水稻品種資源以及F2群體的進(jìn)行精準(zhǔn)快速鑒定, 因此能用于分子育種培育氮高效、高產(chǎn)和耐冷水稻新品種。

[1] Ju C X, Buresh R J, Wang Z Q, Zhang H, Liu L J, Yang J C, Zhang J H. Root and shoot traits for rice varieties with higher gain yield and higher nitrogen use efficiency at lower nitrogen rates application., 2015, 175: 47–55.

[2] 霍中洋, 李杰, 張洪程, 戴其根, 許軻, 魏海燕, 龔金龍. 不同種植方式下水稻氮素吸收利用的特性. 作物學(xué)報(bào), 2013, 38: 1908–1919.Huo Z Y, Li J, Zhang H C, Dai Q G, Xu K, Wei H Y, Gong J L. Characterization of nitrogen uptake and utilization in rice under different planting methods., 2013, 38: 1908–1919 (in Chinese with English abstract).

[3] 陳琛, 張家星, 李萬(wàn)元, 唐東, 羅剛, 王祥菊, 莫蘭婧, 呂旻珈, 周娟, 梁國(guó)華, 黃建曄, 王余龍, 姚友禮, 董桂春. 氮高效水稻主要源庫(kù)性狀的基本特點(diǎn)及其調(diào)控. 中國(guó)水稻科學(xué), 2017, 31: 185–194. Chen C, Zhang J X, Li W Y, Tang D, Luo G, Wang X J, Mo L J, Lyu M J, Zhou J, Liang G H, Huang J Y, Wang Y L, Yao Y L, Dong G C. Fundamental features of source-sink characters and their regulation in high nitrogen efficiency rice lines., 2017, 31: 185–194 (in Chinese with English abstract).

[4] 蔣志敏, 王威, 儲(chǔ)成才. 植物氮高效利用研究進(jìn)展和展望. 生命科學(xué), 2018, 30: 1060–1071. Jiang Z M, Wang W, Chu C C. Towards understanding of nitrogen use efficiency in plants., 2018, 30: 1060–1071 (in Chinese with English abstract).

[5] Lin C M, Koh S, Stacey G, Yu S M, Lin T Y, Tsay Y F. Cloning and functional characterization of a constitutively expressed nitrate transporter gene,, from rice., 2000, 122: 379–388.

[6] Sun H, Qian Q, Wu K, Luo J, Wang S, Zhang C, Ma Y, Liu Q, Huang X, Yuan Q, Han R, Zhao M, Dong G, Guo L, Zhu X, Gou Z, Wang W, Wu Y, Lin H, Fu X. Heterotrimeric G proteins regulate nitrogen-use efficiency in rice., 2014, 46: 652–656.

[7] Zhang Y J, Tan L B, Zhu Z F, Yuan L X, Xie D X, Sun C Q.confers tolerance to nitrogen deficiency in rice., 2015, 81: 367–376.

[8] Fan X, Xie D, Chen J, Lu H, Xu Y, Ma C, Xu G. Over-expression ofin rice increased plant growth at different nitrogen supplies but decreased nitrogen use efficiency at high ammonium supply., 2014, 227: 1–11.

[9] Liu X, Huang D, Tao J, Miller A J, Fan X, Xu G. Identification and functional assay of the interaction motifs in the partner proteinof the two-component system for high-affinity nitrate transport., 2014, 204: 74–80.

[10] Hu B, Wang W, Ou S, Tang J, Li H, Che R, Zhang Z, Chai X, Wang H, Wang Y, Liang C, Liu L, Piao Z, Deng Q, Deng K, Xu C, Liang Y, Zhang L, Li L, Chu C. Variation incontributes to nitrate-use divergence between rice subspecies., 2015, 47: 834–838.

[11] Zhang J Y, Liu Y X, Zhang N, Hu B, Jin T, Xu H R, Qin Y, Yan P X, Zhang X N, Guo X X, Hui J, Cao S Y, Wang X, Wang C, Wang H, Qu B Y, Fan G Y, Yuan L X, Ruben G O, Chu C C, Bai Y.is associated with root macrobiotic composition and nitrogen use in field-grown rice., 2019, 37: 676–684.

[12] Fan X, Tang Z, Tan Y, Zhang Y, Luo B, Yang M, Lian X, Shen Q, Miller A J, Xu G. Overexpression of a pH-sensitive nitrate transporter in rice increases crop yields., 2016, 113: 7118–7123.

[13] Li S, TianY H, Wu K, YeY F, Yu J P, Zhang J Q, Liu Q, Hu M Y, Li H, Tong Y P, Harberd N P, Fu X D. Modulating plant growth-metabolism coordination for sustainable agriculture., 2018, 560: 595–600.

[14] Gao Z Y, Wang Y F, Chen G, Zhang A P, Yang S L, Shang L G, Wang D Y, Ruan B, Liu C L, Jiang H Z, Dong G J, Zhu L, Hu J, Zhang G H, Zeng D, Guo L B, Xu G H, Teng S, Harberd N P, Qian Q. Thenitrate reductase geneallele enhances rice yield potential and nitrogen use efficiency., 2019, 10: 5207.

[15] Tang W J, Ye J, Yao X M, Zhao P Z, Xuan W, Tian Y, Zhang Y Y, Xu S, An H Z, Chen G M, Yu J, Wu W, Ge Y, Liu X L, Li J, Zhang H Z, Zhao Y Q, Yang B, Jiang X Z, Peng C, Zhou C, Terzaghi W L, Wang C M, Wan J M. Genome-wide associated study identifies NAC42-activated nitrate transporter conferring high nitrogen use efficiency in rice., 2019, 10: 5279.

[16] Zhang W H, Sun P Y, He Q, Shu F, Wang J, Deng H F. Fine mapping of, a dominant gene for big grain rice.,2013, 1: 160–165.

[17] Che R H, Tong H N, Shi B H. Control of grain size and rice yield by GL2-mediated brassinosteroid responses., 2016, 2: 15195.

[18] Duan P G, Ni S, Wang J M, Zhang B L. Regulation ofbycontrols grain size and yield in rice., 2016, 2: 15203.

[19] Hu J, Wang Y X, Fang Y X. A rare allele ofenhances grain size and grain yield in rice., 2015, 8: 1455–1465.

[20] Li S C, Gao F Y, Xie K L. The OsmiR396c-OsGRF4-OsGIF1 regulatory module determines grain size and yield in rice., 2016, 14: 2134–2146.

[21] Sun P Y, Zhang W H, Wang Y H, Deng H F.controls grain shape, panicle length and seed shattering in rice., 2016, 58: 836–847.

[22] Chen X L, Jiang L R, Zheng J S, Chen F Y, Wang T S, Wang M L, TaoY, Wang H C, Hong Z L, Huang Y M, Huang R Y. A missense mutation in large grain size 1 increases grain size and enhances cold tolerance in rice., 2019, 70: 3851–3866.

[23] 胡海濤, 郭龍彪. 我國(guó)水稻分子生物學(xué)發(fā)展現(xiàn)狀及展望. 中國(guó)稻米, 2019, 25(5): 12–18. Hu H T, Guo L B. Present situation, progress and prospects of development of rice molecular biology in China., 2019, 25(5): 12–18 (in Chinese with English abstract).

[24] 黎裕, 王建康, 邱麗娟, 馬有志, 李新海, 萬(wàn)建民. 中國(guó)作物分子育種現(xiàn)狀與發(fā)展前景. 作物學(xué)報(bào), 2010, 36: 1425–1430.Li Y, Wang J K, Qiu L J, Ma Y Z, Li X H, Wan J M. Crop molecular breeding in China: current status and perspectives., 2010, 36: 1425–1430 (in Chinese with English abstract).

[25] 程保山, 洪德林, 萬(wàn)志兵, 郭媛. 與粳稻BT型細(xì)胞質(zhì)育性恢復(fù)基因連鎖的實(shí)用SSR標(biāo)記的篩選. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 34(1): 1–7. Cheng B S, Hong D L, Wan Z B, Guo Y. Screening of applicable SSR marker linked to restorer gene for BT-type cytoplasm inrice., 2011, 34(1): 1–7 (in Chinese with English abstract).

[26] 梁毅, 楊婷婷, 譚令辭, 文婷, 吳俊, 江南, 李智強(qiáng), 戴良英, 王國(guó)梁, 劉雄倫. 水稻廣譜抗瘟基因緊密連鎖分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)及其育種應(yīng)用. 雜交水稻, 2013, 28(4): 63–68. Liang Y, Yang T T, Tan L G, Wen T, Wu J, Jiang N, Li Z Q, Dai L Y, Wang G L, Liu X L. Development of the molecular marker tightly-linked with the broad-spectrum blast resistance geneand its breeding practice in rice., 2013, 28(4): 63–68 (in Chinese with English abstract).

[27] Andersen J R, Liibberstedt T. Functional markers in plants., 2003, 8: 554–560.

[28] 姚姝, 陳濤, 張亞?wèn)|, 朱鎮(zhèn), 趙慶勇, 周麗慧, 趙凌, 趙春芳, 王才林. 利用分子標(biāo)記輔助選擇聚合水稻、和基因. 作物學(xué)報(bào), 2017, 43: 1622–1631. Yao S, Chen T, Zhang Y D, Zhu Z, Zhao Q Y, Zhou L H, Zhao L, Zhao C F, Wang C L. Pyramiding,, andgenes by marker-assisted selection in rice (L.)., 2017, 43: 1622–1631 (in Chinese with English abstract).

[29] 馬建, 馬小定, 趙志超, 王帥, 王久林, 王潔, 程治軍, 雷財(cái)林. 水稻抗稻瘟病基因功能性分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)及其應(yīng)用. 作物學(xué)報(bào), 2015, 41: 1779–1790. Ma J, Ma X D, Zhao Z C, Wang S, Wang J L, Wang J, Cheng Z J, Lei C L. Development and application of a functional marker of the blast resistance genein rice., 2015, 41: 1779–1790 (in Chinese with English abstract).

[30] 胡雪嬌, 程燦, 涂榮劍. 水稻耐高溫基因的功能標(biāo)記的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用. 分子植物育種, 2019, 17: 7414–7419. Hu X J, Cheng C, Tu R J. Development and application of functional marker for thermo tolerance genein rice., 2019, 17: 7414–7419 (in Chinese with English abstract).

[31] 陳濤, 張善磊, 趙凌, 張亞?wèn)|, 朱鎮(zhèn), 趙慶勇, 周麗慧, 姚姝, 趙春芳, 梁文化, 王才林. ALS抑制劑類除草劑抗性水稻功能標(biāo)記的開(kāi)發(fā)與驗(yàn)證, 中國(guó)水稻科學(xué), 2018, 32: 137–145. Chen T, Zhang S L, Zhao L, Zhang Y D, Zhu Z, Zhao Q Y, Zhou L H, Yao S, Zhao C F, Liang W H, Wang C L. Development and verification of a functional marker associated with resistance to ALS inhibitor herbicide., 2018, 32: 137–145 (in Chinese with English abstract).

[32] Chen S H, Yang Y, Shi W W., encoding betaine aldehyde dehydrogenase, inhibits the biosynthesis of 2-acetyl-1-pyrroline, a major component in rice fragrance., 2008, 20: 1850–1861.

[33] Li W T, Zhu Z W, Chern M S. A natural allele of a transcription factor in rice confers broad-spectrum blast resistance., 2017, 170: 114–126.

[34] Fan C C, Yu S B, Wang C G. A causal C-A mutation in the second exon ofhighly associated with rice grain length and validated as a functional marker., 2009, 118: 465–472.

[35] Pan G, Zhang X Y, Liu K D. Map-based cloning of a novel rice cytochrome P450 genethat confers resistance to two different classes of herbicides., 2006, 61: 933–943.

[36] Hu B, Wang W, Ou S J. Variation incontributes to nitrate-use divergence between rice subspecies., 2015, 47: 834–838.

[37] Ma Y, Dai X Y, Xu YY.Confers chilling tolerance in rice., 2015, 160: 1209–1221.

[38] 王軍, 趙婕宇, 許揚(yáng), 范方軍, 朱金燕, 李文奇, 王芳權(quán), 費(fèi)云燕, 仲維功, 楊杰. 水稻稻瘟病抗性基因功能標(biāo)記的開(kāi)發(fā)和利用. 作物學(xué)報(bào), 2018, 44: 1612–1620.Wang J, Zhao J Y, Xu Y, Fan F J, Zhu J Y, Li W Q, Wang F Q, Fei Y Y, Zhong W G, Yang J. Development and application of functional markers for rice blast resistance genein rice., 2018, 44: 1612–1620 (in Chinese with English abstract).

[39] Ye S, Dhillon S, Ke X, Collins A R, Day I N. An efficient procedure for genotyping single nucleotide polymorphisms., 2001, 29: E88.

[40] 陳濤, 駱名瑞, 張亞?wèn)|, 朱鎮(zhèn), 趙凌, 趙慶勇, 周麗慧, 姚姝,于新, 王才林. 利用四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR技術(shù)檢測(cè)水稻低直鏈淀粉含量基因. 中國(guó)水稻科學(xué), 2013, 27: 529–534. Chen T, Luo M R, Zhang Y D, Zhu Z, Zhao L, Zhao Q Y, Zhou L H, Yao S, Yu X, Wang C L. Detection ofgene for low-amylose content by tetra-primer amplification refractory mutation system PCR in rice., 2013, 27: 529–534 (in Chinese with English abstract).

[41] Koutroubas S D, Ntanos D A. Genotypic differences for grain yield and nitrogen utilization inandrice under Mediterranean conditions., 2003, 83: 251–260.

[42] Wang F M, Matsuoka M. Improved nutrient use gives cereal crops a boost., 2018, 560: 563–566.

Development and application of functional marker for high nitrogen use efficiency and chilling tolerance genein rice

SUN Ping-Yong1, ZHANG Wu-Han1, ZHANG Li2, SHU Fu1, HE Qiang1, PENG Zhi-Rong1, and DENG Hua-Feng1,3,*

1State Key Laboratory of Hybrid Rice, Hunan Hybrid Rice Research Center, Changsha 410125, Hunan, China;2Nuclear Agriculture and Space Breeding Research Institute, Changsha 410125, Hunan, China;3Hunan Academy of Agricultural Sciences, Changsha 410125, Hunan, China

The use of molecular marker-assisted selection (MAS) to breed rice with high nitrogen-use efficiency is one of the most effective methods to reduce the amount of nitrogen fertilizer quantity and to develop the green and sustainable agriculture. The gene growth-regulating factor 4 () encodes a growth regulatory factor protein, and the mutation in the coding region from the nucleotides TC to AA in 487 and 488 substituted the amino acid serine for lysine, which resulting in enhancing nitrogen-use efficiency, increasing grain yield, and improving chilling tolerance in rice. In order to improve the selection efficiency ofin rice breeding, an allele-specific PCR (AS-PCR) marker combination, PF+DMR+PR and PF+XMR+PR, was developed based on the single nucleotide polymorphism in the functional region of thealleles. The functional marker was used to identify genotypes of different varieties and an F2population derived from Chuandali/Jusuidao. The three different genotypes oflocus could be accurately distinguished, which was further confirmed by sequencing. This functional marker is simple to operate and low-cost, and could provide a technical support when using MAS to breed new rice varieties of high nitrogen-use efficiency, high yields, and increased chilling tolerance.

rice; high nitrogen-use efficiency; chilling tolerance;gene; AS-PCR

10.3724/SP.J.1006.2021.02035

本研究由湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2019JJ50427, 2020JJ5287), 湖南省科技重大專項(xiàng)項(xiàng)目(2018NK1020-1)和湖南農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新資金項(xiàng)目(2020CX08, 2019TD06)資助。

This study was supported by the Natural Science Foundation of Hunan (2019JJ50427, 2020JJ5287), the Hunan Province Key Research and Development Program Project (2018NK1020-1), and the Hunan Agricultural Science and Technology Innovation Project (2020CX08, 2019TD06).

鄧華鳳, E-mail: dhf@hhrrc.ac.cn

E-mail: zlspy23@126.com

2020-05-22;

2020-08-19;

2020-09-10.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20200908.1547.002.html