唐銳敏 賈小云 朱文嬌 印敬明 楊 清,*

馬鈴薯熱激轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆及其耐熱性功能分析

唐銳敏1,2賈小云1朱文嬌2印敬明2楊 清2,*

1山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 山西太谷 030801;2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 江蘇南京 210095

馬鈴薯在田間生長(zhǎng)時(shí)常會(huì)受到各種不利環(huán)境的影響。夏季高溫常導(dǎo)致馬鈴薯塊莖產(chǎn)量和質(zhì)量的下降。因此, 闡明馬鈴薯對(duì)熱脅迫的響應(yīng)機(jī)制, 發(fā)掘耐熱相關(guān)基因, 對(duì)馬鈴薯耐熱性的提高意義重大。熱激轉(zhuǎn)錄因子(heat shock transcription factor A3, HsfA3)在植物機(jī)體內(nèi)的活動(dòng)影響到大量功能基因的表達(dá), 在植物響應(yīng)熱脅迫的過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。為了研究馬鈴薯中HsfA3的結(jié)構(gòu)和功能, 本研究通過(guò)RT-PCR從馬鈴薯品種Désirée中克隆到長(zhǎng)度為1506 bp的基因, 編碼501個(gè)氨基酸。StHsfA3的相對(duì)分子量為55.23 kD, 理論等電點(diǎn)為4.9, 屬于親水性蛋白。構(gòu)建-pBA002過(guò)表達(dá)載體, 并轉(zhuǎn)化馬鈴薯植株, 共鑒定得到5個(gè)獨(dú)立的過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯株系。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因植株葉片中的相對(duì)含水量(relative water content, RWC)以及丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量的測(cè)定發(fā)現(xiàn), 在高溫脅迫下, 轉(zhuǎn)基因植株葉片中的RWC顯著高于非轉(zhuǎn)基因植株, MDA含量顯著低于非轉(zhuǎn)基因植株, 說(shuō)明在耐熱過(guò)程中起到正調(diào)控作用。對(duì)、和在不同馬鈴薯植株中的表達(dá)分析顯示,過(guò)量表達(dá)誘導(dǎo)了和的表達(dá), 預(yù)示著StHsfA3可能協(xié)同StHsp26-CP和StHsp70來(lái)增強(qiáng)過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系的耐熱性。

馬鈴薯; 熱脅迫;; 基因克隆; 遺傳轉(zhuǎn)化; 功能分析

植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中經(jīng)常會(huì)受到各種不利環(huán)境如極端溫度、鹽漬化、干旱、重金屬等脅迫[1]。其中, 熱脅迫是對(duì)植物生長(zhǎng)繁殖影響最嚴(yán)重且最不易控制的因素之一[2]。而且, 溫室效應(yīng)的積累加劇了高溫的影響力, 從而造成農(nóng)作物減產(chǎn), 大大威脅了我國(guó)乃至全世界的糧食安全[1]。馬鈴薯營(yíng)養(yǎng)豐富, 種植廣泛, 是一種重要的糧蔬兼用型作物。然而馬鈴薯性喜涼冷, 不耐高溫。在夏季馬鈴薯栽培過(guò)程中, 高溫會(huì)嚴(yán)重影響其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程, 導(dǎo)致塊莖產(chǎn)量和質(zhì)量下降[3]。因此, 闡明馬鈴薯對(duì)熱脅迫的響應(yīng)機(jī)制,發(fā)掘耐熱相關(guān)基因, 對(duì)馬鈴薯耐熱性改良具有重要意義。

熱激轉(zhuǎn)錄因子(heat shock transcription factor, Hsf)作為熱脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的重要元件, 激活熱脅迫響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá), 在植物熱響應(yīng)調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵的作用[4]。與其他轉(zhuǎn)錄因子類似, Hsf家族成員的N端有1個(gè)保守的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu), 為Hsf的DNA結(jié)合域(DNA binding domain, DBD)[5]。與DBD區(qū)域相毗鄰的是寡聚域(oligomerization domain, OD), 由2個(gè)疏水的七肽重復(fù)序列(hydrophobic heptad repeats, HR-A和HR-B)和1段插入序列組成[5-6]。根據(jù)HR-A/B之間插入氨基酸殘基的數(shù)目不同, 可將Hsf分成A、B和C三大類。

與動(dòng)物和酵母相比, 植物中的Hsf家族成員十分豐富[7]。例如在擬南芥()[8]、番茄()[9]、水稻()[10]和楊樹(shù)()[11]中, 分別鑒定得到21、24、25和30個(gè)Hsf家族成員。這些Hsf成員在植物對(duì)各種復(fù)雜的非生物脅迫響應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[12]。例如, 在擬南芥中,、、和表達(dá)會(huì)受到低溫脅迫、鹽脅迫以及滲透壓脅迫的誘導(dǎo)[7,13-14]。在我們前期的研究中, 鑒定出27個(gè)馬鈴薯Hsf家族成員, 分屬A、B和C三大類。這些馬鈴薯家族基因?qū)崦{迫、干旱脅迫和冷脅迫均有不同程度的響應(yīng)[15]。

HsfA3是熱激轉(zhuǎn)錄因子A家族的一個(gè)成員。在正常條件下,表達(dá)屬于組成型表達(dá), 存在于細(xì)胞質(zhì)中; 而當(dāng)植物受到熱脅迫時(shí), 其表達(dá)為誘導(dǎo)型表達(dá), 作用在細(xì)胞核中[16]。研究表明, HsfA3在植物耐熱調(diào)控方面起著重要的作用。例如, 在擬南芥中,在DREB2A (dehydration-responsive element bindingprotein 2A)的調(diào)控作用下表達(dá), 并對(duì)熱脅迫做出響應(yīng), 從而級(jí)聯(lián)調(diào)控其下游一系列熱誘導(dǎo)基因表達(dá), 使植株獲得更高的耐熱性[17]。在番茄中, HsfA3能夠與MAP激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)直接相互作用來(lái)調(diào)控植物對(duì)熱脅迫的響應(yīng)[18]。在馬鈴薯中, 我們也發(fā)現(xiàn)在熱脅迫誘導(dǎo)下能夠高效表達(dá), 表明StHsfA3可能在馬鈴薯響應(yīng)熱脅迫的過(guò)程中起著重要的作用[15]。除了調(diào)控植物對(duì)熱脅迫響應(yīng)之外, HsfA3還參與了其他非生物脅迫應(yīng)答。在水稻中發(fā)現(xiàn), OsHsfA3不但參與了植物的耐熱調(diào)控, 同時(shí)也通過(guò)調(diào)節(jié)依賴脫落酸和活性氧水平的多胺生物合成來(lái)提高植株的耐旱性[19]。在擬南芥中過(guò)表達(dá)百合可以通過(guò)改變脯氨酸分解代謝來(lái)提高擬南芥植株的耐熱性和鹽敏感性[20]。

目前, 對(duì)的研究主要集中在擬南芥、番茄等模式植物中, 在馬鈴薯中尚未見(jiàn)到有關(guān)克隆和表達(dá)的報(bào)道。在前期研究中, 我們通過(guò)構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè),(PGSC0003DMG 400003219)和(PGSC0003DMG400027611)可能是的共表達(dá)基因, 它們之間可能存在某種調(diào)控關(guān)系[15]。為了研究在提高植物耐熱性方面的作用以及與相關(guān)之間潛在的表達(dá)調(diào)控關(guān)系, 本研究從馬鈴薯品種Désirée中克隆了的cDNA序列, 通過(guò)在馬鈴薯中過(guò)表達(dá)該基因并對(duì)其耐熱性功能進(jìn)行研究, 以期為揭示的調(diào)控機(jī)制提供基礎(chǔ), 同時(shí)也為馬鈴薯耐熱育種提供基因資源。

1 材料與方法

1.1 植物材料、菌株及載體

馬鈴薯品種Désirée, 由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)楊清教授實(shí)驗(yàn)室提供, 保存于MS培養(yǎng)基中, 置于溫度為(22 ± 1)℃、光周期為光照(16 h)/黑暗(8 h)的溫室中培養(yǎng)。將1月齡的組培苗轉(zhuǎn)移至試管中煉苗, 1周后移至基質(zhì)中生長(zhǎng)。菌株為大腸桿菌() DH5α和農(nóng)桿菌() GV3101。克隆載體pMD19-T (TaKaRa, 中國(guó)大連)和表達(dá)載體pBA002由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院喻德躍教授課題組提供。

1.2 馬鈴薯HsfA3的克隆及序列分析

1.2.1 總RNA的提取及cDNA的合成 取馬鈴薯品種Désirée的葉片約0.1 g, 利用RNA提取試劑盒(TaKaRa, 中國(guó)大連)提取樣品總RNA, 用不含RNase的DNase I (TaKaRa, 中國(guó)大連)消除基因組DNA的干擾。對(duì)所得RNA的完整性和濃度進(jìn)行檢測(cè)后, 取0.5 μg RNA, 利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche, Mannheim, Germany)合成cDNA第1鏈。將1 μL合成的cDNA用9 μL nuclease-free水稀釋作為模板。

1.2.2 馬鈴薯的分子克隆 根據(jù)NCBI網(wǎng)站中查到的馬鈴薯預(yù)測(cè)序列(XM_015306031.1)設(shè)計(jì)帶有I和I雙酶切位點(diǎn)的引物(P1, 表1)。以上述合成的cDNA作為模板, 進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 擴(kuò)增程序?yàn)?4℃ 5 min; 94℃ 50 s, 58℃ 50 s, 72℃ 90 s, 33個(gè)循環(huán); 72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳測(cè)定后通過(guò)凝膠回收試劑盒(Axygen Scientific Inc., Union city, USA)將目的片段回收, 然后將其連接至pMD19-T克隆載體中, 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α, 經(jīng)PCR檢測(cè)后, 對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序檢驗(yàn), 將測(cè)序正確的菌液加甘油凍存。

表1 本研究所使用的引物

1.2.3 馬鈴薯HsfA3的序列分析及系統(tǒng)發(fā)育分析

由ExPASy的PrptParam工具 (http://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)基因編碼的肽鏈氨基酸殘基數(shù)目、相對(duì)分子量、理論等電點(diǎn); 由NPSA-PRABI (http://npsa-pbil.ibcp.fr)和SWISS- MODEL (https://www.swissmodel.expasy.org/)在線分析獲得StHsfA3蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。使用 NCBI conserved domains (https://www.ncbi.nlm.nih. gov/Structure/cdd/)和SignalP 5.0 Server (http://www. cbs.dtu.dk/servers/SignalP/)分別預(yù)測(cè)StHsfA3的保守結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽。由ExPASy的ProtScale工具(http:// web.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl) 預(yù)測(cè)StHsfA3蛋白的疏水性; 用TMHMM Server v. 2.0 工具(http:// www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)在線分析得到StHsfA3蛋白跨膜結(jié)構(gòu)。由ClustalX 2.0和MEGA 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù), 采用鄰接法(Neighbor-Joining Method)作圖, 重復(fù)計(jì)算次數(shù)設(shè)為1000。

1.3 馬鈴薯HsfA3過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建及重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化

從上述保存的大腸桿菌菌液中提取質(zhì)粒, 用I和I對(duì)其進(jìn)行雙酶切, 回收目的片段; 同時(shí)用相同的酶將pBA002載體也進(jìn)行雙酶切并將載體大片段回收。然后將目的基因片段與酶切后的pBA002載體通過(guò)T4連接酶(Thermo Fisher Scientific, USA)連接, 并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101中。通過(guò)菌液PCR驗(yàn)證、酶切驗(yàn)證以及測(cè)序驗(yàn)證后, 將測(cè)序正確的含有-pBA002重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液加甘油保存到-80℃冰箱, 用于后續(xù)遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。

利用本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立的馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化體系[21], 將-pBA002重組子轉(zhuǎn)入馬鈴薯品種Désirée外植體中。經(jīng)預(yù)培養(yǎng)、共培養(yǎng)、愈傷誘導(dǎo)、芽分化和生根篩選后, 獲得轉(zhuǎn)基因馬鈴薯株系。

1.4 轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測(cè)

利用SDS法提取得到的抗性馬鈴薯植株以及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓甑目侱NA。為了檢測(cè)- pBA002重組質(zhì)粒是否轉(zhuǎn)入馬鈴薯植株內(nèi), 本研究設(shè)計(jì)了包含1段pBA002表達(dá)載體和1段基因片段的引物(P2, 表1)。以非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓甑目侱NA作為陰性對(duì)照,-pBA002重組質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照, 用該引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證, 程序如下: 94℃預(yù)變性4 min; 94℃變性50 s, 58℃退火45 s, 72℃延伸50 s, 33個(gè)循環(huán); 最后72℃延伸10 min。得到的PCR產(chǎn)物再經(jīng)電泳檢測(cè)。

1.5 相對(duì)含水量(RWC)測(cè)定

將1月齡的非轉(zhuǎn)基因植株(wild type, WT)以及轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株系(transgenic lines, L)的組培苗移栽到基質(zhì)中, 置于溫度為(22±1)℃, 光照周期為14 h光照/10 h黑暗的光照培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)2周, 再將它們分別分成2組, 一組放在35℃光照培養(yǎng)箱中; 另一組留在原來(lái)的培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)。處理8 h后取其葉片測(cè)定相對(duì)含水量。相對(duì)含水量的測(cè)定具體步驟如下: 秤取鮮重(fresh weight, FW)約為0.5 g的新鮮馬鈴薯葉片, 將其浸入水中, 一段時(shí)間后取出, 濾紙吸干表面水分, 稱重; 然后再把葉片浸入水中, 過(guò)段時(shí)間再取出, 吸干葉片表面水分后再稱重; 重復(fù)操作幾次, 直到重量穩(wěn)定, 此時(shí)葉片的重量為飽和鮮重(saturated fresh weight, SFW)。之后把吸水飽和的葉片放入紙袋, 置于溫度為105℃的烘箱內(nèi)殺青10 min, 再將烘箱溫度調(diào)到75℃繼續(xù)烘干葉片, 直至其重量不再變化。這時(shí)將葉片取出, 冷卻至室溫, 記錄其干重(dry weight, DW)。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3次試驗(yàn)重復(fù)。相對(duì)含水量計(jì)算公式如下:

1.6 丙二醛(MDA)含量測(cè)定

用與1.5同樣的方法處理馬鈴薯植株, 不同溫度處理8 h后取馬鈴薯葉片測(cè)定MDA的含量。采用硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid, TBA)法測(cè)定MDA含量[22], 其含量用“μmol g-1FW”來(lái)表示。取馬鈴薯植物新鮮葉片1 g, 剪碎后加入2 mL 5% TCA溶液, 于研缽中研磨成勻漿, 再加8 mL TCA, 將殘液移至10 mL離心管中。4℃, 4000′離心10 min; 取上清2 mL (對(duì)照中加入2 mL蒸餾水)至試管中, 加入2 mL 0.6% TBA溶液, 混勻后于沸水浴中煮沸10 min, 取出冷卻至室溫, 3000′離心15 min, 取上清量取其體積VS; 以對(duì)照管內(nèi)溶液為空白, 測(cè)定530 nm、600 nm和450 nm處的吸光值。每個(gè)樣本進(jìn)行3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3次試驗(yàn)重復(fù)。MDA含量用下列公式計(jì)算:

1.7 StHsfA3、StHsp26-CP和StHsp70的表達(dá)量檢測(cè)

用與1.5同樣的方法處理馬鈴薯植株, 處理2 h后分別取不同處理不同植株的葉片提取RNA, 采用熒光定量PCR方法檢測(cè)非轉(zhuǎn)基因植物和轉(zhuǎn)基因不同株系中的、和的表達(dá)量。這3個(gè)基因的引物見(jiàn)表1 (P3, P4, P5), 以為內(nèi)參基因, 引物為P6。按照FastStart Universal SYBR Green Master (ROX) (Roche, Mannheim, Germany)的使用說(shuō)明, 在ABI-7500實(shí)時(shí)定量PCR儀上(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)檢測(cè)候選基因的表達(dá)量。PCR反應(yīng)體系為20 μL, 包含10 μL SYBR-Green、6.8 μL ddH2O、2 μL稀釋后的模板以及各0.6 μL 10 μmol L-1的正反向引物。PCR反應(yīng)程序如下: 50℃ 2 min; 95℃預(yù)變性10 min, 95℃變性5 s, 60℃退火35 s, 共40個(gè)循環(huán)。根據(jù)2???Ct法, 對(duì)每個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)算。每個(gè)樣本進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)和2次試驗(yàn)重復(fù)。利用鄧肯多重測(cè)試法對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 StHsfA3基因的分子克隆及序列分析

根據(jù)NCBI網(wǎng)站中預(yù)測(cè)得到的馬鈴薯堿基序列設(shè)計(jì)加酶切位點(diǎn)的引物P1, 從馬鈴薯品種Désirée中克隆得到基因的cDNA全長(zhǎng)序列。經(jīng)軟件分析,從起始密碼子ATG到終止密碼子TAG的長(zhǎng)度為1506 bp (圖1-A), 共編碼501個(gè)氨基酸(圖1-B)。利用ExPasy網(wǎng)站的PrptParam工具預(yù)測(cè)StHsfA3蛋白的相對(duì)分子量為55.23 kD, 理論等電點(diǎn)為4.9。本研究發(fā)現(xiàn), 在StHsfA3氨基酸序列的C端含有4個(gè)中心是色氨酸殘基的短肽基序(圖1-B): DEELSMGFE、GAELDSFSS、LSDLDIDPL和GVDKPADGS, 該結(jié)構(gòu)使得HsfA3具有高效的轉(zhuǎn)錄激活功能。

A圖中: M: DNA 2000分子標(biāo)記; 1:的擴(kuò)增片段。B圖中: 紅線部分為4個(gè)中心是色氨酸(W)的短肽基序。

M: DNA 2000 marker; 1: amplified fragment ofin Fig. A; the motifs marked with red line are the four short peptide sequences containing tryptophan (W) in Fig. B.

對(duì)StHsfA3蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示, α螺旋、延伸鏈和無(wú)規(guī)則卷曲的氨基酸殘基數(shù)分別為117、13和368個(gè), 占整個(gè)氨基酸數(shù)目的23.35%、2.59%和73.45% (圖2-A)。無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成了該蛋白的活性中心, 所占比例最高, 說(shuō)明這部分結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。通過(guò)NCBI CD search功能對(duì)該蛋白進(jìn)行分析, 預(yù)測(cè)出其含有熱激轉(zhuǎn)錄因子Hsf典型的DBD結(jié)構(gòu)域(圖2-C)。其三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明, 該DBD結(jié)構(gòu)域含有3個(gè)α螺旋和4個(gè)β折疊片(圖2-B), 構(gòu)成了該蛋白最保守的結(jié)構(gòu)域。利用Signal P-5.0預(yù)測(cè)StHsfA3信號(hào)肽發(fā)現(xiàn), 該蛋白無(wú)信號(hào)肽(圖2-D), 為非分泌蛋白。

A: 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè); B: 三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè); C: 保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè); D: 信號(hào)肽預(yù)測(cè)。

A: secondary structure prediction; B: tertiary structure prediction; C: conservative domain prediction; D: signal peptide prediction.

利用ExPASy的ProtScale工具預(yù)測(cè)StHsfA3蛋白的疏水性發(fā)現(xiàn), 構(gòu)成StHsfA3蛋白的氨基酸中, 親水性氨基酸的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于疏水性氨基酸(圖3-A), 表明該蛋白屬于親水性蛋白?？缒そY(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析表明, StHsfA3蛋白沒(méi)有跨膜區(qū), 不屬于膜蛋白, 這與StHsfA3在細(xì)胞中的位置以及發(fā)揮的功能相適應(yīng)。

A: 圖中曲線得分在0以上說(shuō)明這部分氨基酸為疏水性, 分值越高疏水性越強(qiáng); 得分在0以下說(shuō)明氨基酸為親水性氨基酸, 分值越低親水性越強(qiáng)。B: 沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)域。

A: the curves above zero show that these amino acids are hydrophobic, and the higher score, the stronger the hydrophobicity; the curves below zero show that these amino acids are hydrophilic, and the lower score, the stronger the hydrophilicity. B: there is no transmembrane domain.

2.2 StHsfA3的系統(tǒng)進(jìn)化分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索到15個(gè)來(lái)自于其他植物物種的HsfA3氨基酸序列, 將馬鈴薯HsfA3蛋白序列與其他物種中的同源序列進(jìn)行比對(duì), 用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖4)。該系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)主要有兩大分支, 雙子葉植物HsfA3聚為一支, 單子葉植物HsfA3聚為一支。馬鈴薯HsfA3的氨基酸序列與番茄()、辣椒()和煙草()這些茄科植物的親緣關(guān)系比較近, 尤其與番茄的HsfA3親緣關(guān)系最近。

2.3 StHsfA3過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株的獲得

將克隆獲得的基因目的片段通過(guò)I和I雙酶切后插入到pBA002表達(dá)載體35S啟動(dòng)子, 構(gòu)建成::過(guò)表達(dá)載體(圖5-A), 并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。利用利福平(rifampicin, Rif)和壯觀霉素(spectinomycin, Spec)篩選出含有過(guò)表達(dá)載體的農(nóng)桿菌陽(yáng)性菌落, 并用PCR驗(yàn)證。提取農(nóng)桿菌質(zhì)粒, 經(jīng)限制性內(nèi)切酶I和I雙酶切后, 除了載體片段, 還得到1條長(zhǎng)度為1506 bp的目的片段(圖5-B), 說(shuō)明過(guò)表達(dá)載體已成功構(gòu)建。

利用ClustalX 2.1和MEGA 4.0軟件構(gòu)建來(lái)自16個(gè)物種的Hsf A3氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù), 重復(fù)計(jì)算次數(shù)設(shè)為1000。各物種名稱縮寫(xiě)及NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列號(hào)如下: MdHsfA3: 蘋果(XP_008391748.1); ZjHsfA3: 棗(XP_015898712.1); CsHsfA3: 柑橘(XP_006481891.1); AtHsfA3: 擬南芥(NP_195992.2); VrHsfA3: 豇豆(XP_014511066.1); GmHsfA3: 大豆(XP_003541445.1); PeHsfA3: 楊樹(shù)(XP_011016541.1); NtHsfA3: 煙草(XP_016473897.1); CaHsfA3: 辣椒(XP_016542894.1); SlHsfA3: 番茄(NP_001234854.1); OsHsfA3: 水稻(XP_015623061.1); ZmHsfA3: 玉米(NP_001147968.1); SiHsfA3: 狗尾草(XP_004952622.1); BdHsfA3: 二穗短柄草(XP_003575055.1); HvHsfA3: 大麥(AEB26588.1)。

The Neighbor-joining phylogenetic tree of HsfA3 amino acid sequences from 16 plant species was constructed by ClustalX 2.1 and MEGA 4.0, which was bootstrapped over 1000 cycles. Abbreviations for each species and database accession numbers are as follows: MdHsfA3:(XP_008391748.1); ZjHsfA3:(XP_015898712.1); CsHsfA3:(XP_006481891.1); AtHsfA3:(NP_195992.2); VrHsfA3:(XP_014511066.1); GmHsfA3:(XP_003541445.1); PeHsfA3:(XP_011016541.1); NtHsfA3:(XP_ 016473897.1); CaHsfA3:(XP_016542894.1); SlHsfA3:(NP_001234854.1); OsHsfA3:(XP_015623061.1); ZmHsfA3:(NP_001147968.1); SiHsfA3:(XP_004952622.1); BdHsfA3:(XP_003575055.1); HvHsfA3:(AEB26588.1).

將含有過(guò)表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌液侵染馬鈴薯組培苗莖段, 經(jīng)預(yù)培養(yǎng)、共培養(yǎng)、誘導(dǎo)愈傷、芽分化以及草丁膦生根篩選(圖5-C), 初步得到12株抗性植株。提取其葉片DNA, 利用引物P33進(jìn)行PCR驗(yàn)證, 最終鑒定得到5個(gè)的過(guò)表達(dá)馬鈴薯轉(zhuǎn)基因株系(圖5-D)。熒光定量結(jié)果顯示,在過(guò)表達(dá)馬鈴薯轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)量顯著高于非轉(zhuǎn)基因植株(圖5-E)。

A: 帶有酶切位點(diǎn)的載體示意圖。B: M: 1 kb plus DNA marker; P: 含有pBA002-載體的農(nóng)桿菌質(zhì)粒; 1, 2: 含有pBA002-載體的農(nóng)桿菌質(zhì)粒酶切結(jié)果。C: a. 預(yù)培養(yǎng); b. 芽分化; c. 生根篩選; d. 盆栽苗。D: M: DNA 2000 marker; WT: 非轉(zhuǎn)基因植株, 作為陰性對(duì)照; +: pBA002-農(nóng)桿菌質(zhì)粒, 作為陽(yáng)性對(duì)照; L1~L5: 轉(zhuǎn)基因株系。E: 不同植株中的表達(dá)量測(cè)定。**表示在0.01水平差異顯著。

Schematic diagram ofvector with site of restriction enzymes in Fig. A. M: 1 kb plus DNA marker; P: pBA002-plasmid; 1, 2: enzyme digestion identification of pBA002-plasmid in Fig. B. a: preincubation in darkness; b: bud formation; c: selection of transgenic lines; d: plants in pot in Fig. C. M: DNA 2000 marker; WT: non-transgenic potato plant, used as a negative control; +: pBA002-plasmid, used as a positive control; L1–L5: Transgenic lines in Fig. D. The expression levels ofwere determined in different plants in Fig. E. **: significantly different at the 0.01 probability level.

2.4 轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株的相對(duì)含水量(RWC)和丙二醛(MDA)含量分析

相對(duì)含水量和丙二醛含量是反應(yīng)植物在逆境狀態(tài)下生長(zhǎng)狀況的重要生理指標(biāo), 通?？捎糜阼b定植物抗逆境脅迫的能力。通過(guò)檢測(cè)非轉(zhuǎn)基因植株(WT)和轉(zhuǎn)基因植株(L)在適溫(22℃)和高溫(35℃)條件下葉片中的相對(duì)含水量發(fā)現(xiàn), 在適溫條件下, 馬鈴薯葉片中的相對(duì)含水量均保持在80%以上(圖6-A)。當(dāng)熱處理8 h之后, 不論是轉(zhuǎn)基因植株還是非轉(zhuǎn)基因植株, 其葉片的相對(duì)含水量都因葉片受到熱脅迫而呈現(xiàn)不同程度的下降, 而且熱處理后轉(zhuǎn)基因馬鈴薯葉片中的相對(duì)含水量仍然顯著高于非轉(zhuǎn)基因植株, 表明過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株比非轉(zhuǎn)基因植株在熱脅迫下的保水能力更強(qiáng), 因此耐熱性更高。

對(duì)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株和非轉(zhuǎn)基因植株在35℃高溫脅迫下和22℃適溫條件下葉片中MDA含量的檢測(cè)(圖6-B)發(fā)現(xiàn), 熱處理8 h后,植株葉片中的MDA含量均升高, 說(shuō)明它們都受到了熱脅迫引起的膜脂過(guò)氧化, 但轉(zhuǎn)基因各株系葉片中的MDA含量顯著低于非轉(zhuǎn)基因植株, 說(shuō)明過(guò)表達(dá)植株受到熱脅迫導(dǎo)致的膜脂過(guò)氧化程度低于普通非轉(zhuǎn)基因馬鈴薯, 因此,過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株比非轉(zhuǎn)基因植株耐熱性強(qiáng)。

WT: 非轉(zhuǎn)基因植株; L:過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系(L1、L3、L5三個(gè)株系); RWC: 相對(duì)含水量; MDA content: 丙二醛含量; 正常生長(zhǎng)溫度: 22℃; 高溫脅迫: 35℃; 處理時(shí)間: 8 h; 圖中的值是3個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)的結(jié)果, 每個(gè)試驗(yàn)3個(gè)重復(fù), 以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。根據(jù)Duncan’s多重測(cè)試, 柱形圖上不同小寫(xiě)字母表示< 0.05的顯著性差異水平。

WT: non-transgenic plants; L:overexpression transgenic plant lines; RWC: relative water content; MDA: malondialdehyde; temperature treatments: 22℃ (optimal temperature) and 35℃ (heat stress) for eight hours. Values are means ± SE of three independent experiments with three replicates in each experiment. Bars with different lowercase letters are significantly different at< 0.05 according to Duncan’s multiple range tests.

2.5 StHsfA3、StHsp26-CP以及StHsp70的表達(dá)量分析

利用qRT-PCR的方法, 本研究檢測(cè)了適溫(22℃)和高溫(35℃)條件下非轉(zhuǎn)基因植株和3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系葉片中的表達(dá)水平(圖7-A)。在適溫條件下, 轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)量均顯著高于非轉(zhuǎn)基因植株, L1、L3、L5中的表達(dá)量分別是非轉(zhuǎn)基因植株中的3.95、7.05和3.36倍。在高溫處理2 h后, 各植株中的表達(dá)量均受高溫誘導(dǎo)而上升, 且3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中該基因的表達(dá)量都顯著高于非轉(zhuǎn)基因植株。

在正常生長(zhǎng)條件下,過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株中和的表達(dá)量均顯著高于非轉(zhuǎn)基因植株中, 說(shuō)明過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)了和在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá), 但和是否是的靶基因, 是否被直接調(diào)控, 還需要進(jìn)一步研究。當(dāng)35℃處理2 h后, 所有植株中和的表達(dá)量都在高溫誘導(dǎo)下顯著上升, 且各轉(zhuǎn)基因株系中這2個(gè)基因的表達(dá)量顯著高于非轉(zhuǎn)基因植株(圖7-B, C)。

3 討論

馬鈴薯地上部分生長(zhǎng)的最適溫度為20~25℃, 塊莖形成的最適溫度為15~20℃[23-24]。高溫抑制馬鈴薯塊莖的形成和發(fā)育, 從而嚴(yán)重影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的積累。因此馬鈴薯耐熱基因的開(kāi)發(fā)和耐熱機(jī)制的研究對(duì)提高馬鈴薯的抗熱性具有重要意義。

熱激轉(zhuǎn)錄因子(Hsf)廣泛存在于各植物中, 在熱脅迫應(yīng)答方面具有十分重要的作用。隨著馬鈴薯全基因組測(cè)序工作的完成, 課題組前期已鑒定出27個(gè)馬鈴薯基因家族成員。其中,介導(dǎo)了一系列高溫脅迫響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控, 包括以及一些其他的功能基因, 在植物的熱響應(yīng)調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮重要作用[15]。

本研究從馬鈴薯品種Désirée中克隆得到基因。序列分析顯示,的cDNA長(zhǎng)度為1506 bp, 編碼501個(gè)氨基酸(圖1)。大多數(shù)A族Hsf具有1個(gè)包含氨基酸激活序列(AHA)的C端激活域(C-terminalactivation domain, CTAD)[25]。StHsfA3雖然屬于HsfA家族成員, 但在其CTAD區(qū)域不含AHA基序, 而是含有4個(gè)中心是色氨酸殘基的短肽基序(圖1-B)。該結(jié)構(gòu)在番茄HsfA3中也有發(fā)現(xiàn), 它與AHA功能相似, 使得HsfA3具有高效的轉(zhuǎn)錄激活功能[16]。經(jīng)研究證實(shí), 不含AHA基序的HsfA可與其他HsfA成員結(jié)合形成異聚體, 從而激活其轉(zhuǎn)錄活性[10,26]。StHsfA3蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示, 無(wú)規(guī)則卷曲所占比例最高(圖2-A), 它們構(gòu)成了該蛋白的活性中心, 激活了Hsf三聚體的形成, 促進(jìn)了該三聚體與基因啟動(dòng)子區(qū)的有效結(jié)合[5-6]。其DBD結(jié)構(gòu)域的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型含有3個(gè)α螺旋和4個(gè)β折疊片(圖2-B)。α螺旋和β折疊片一般作為蛋白質(zhì)的支架, 因此這部分構(gòu)成該蛋白最保守的結(jié)構(gòu)域。生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)到StHsfA3是無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽的親水性蛋白, 表明它既不是分泌蛋白也不是膜蛋白, 這與其在細(xì)胞中的位置以及發(fā)揮的功能相適應(yīng)。馬鈴薯HsfA3的氨基酸序列與番茄、辣椒和煙草這些茄科植物的親緣關(guān)系比較近, 尤其與番茄的HsfA3親緣關(guān)系最近, 表明馬鈴薯HsfA3可能與番茄HsfA3具有相似的功能和作用機(jī)制。

WT: 非轉(zhuǎn)基因植株; L:過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系(L1、L3、L5三個(gè)株系); 正常生長(zhǎng)溫度: 22℃; 高溫脅迫: 35℃; 處理時(shí)間: 2 h; 圖中的值是2次試驗(yàn)重復(fù)的結(jié)果, 每個(gè)試驗(yàn)3個(gè)生物學(xué)重復(fù), 以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。根據(jù)鄧肯多重測(cè)試, 柱形圖上不同小寫(xiě)字母表示< 0.05的顯著性差異水平。

WT: non-transgenic plants; L:overexpression transgenic plant lines; temperature treatments: 22℃ (optimal temperature) and 35℃ (heat stress) for two hours. Values are means ± SE of two experimental replicates with three biological replicates in each experiment. Bars with different lowercase letters are significantly different at< 0.05 according to Duncan’s multiple range tests.

為了研究基因的功能, 本研究通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將該基因轉(zhuǎn)入馬鈴薯植株, 最終獲得了5個(gè)獨(dú)立的過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系。在我們驗(yàn)證的3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中,的表達(dá)量均顯著高于非轉(zhuǎn)基因植株, 表明基因在強(qiáng)啟動(dòng)子CaMV 35S帶動(dòng)下高效表達(dá)[27]。然而在這3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中(L1、L3和L5),的表達(dá)量存在差異, 在L3中表達(dá)量最高, 在L5中表達(dá)量最低, 這可能是與目的基因插入的位點(diǎn)和在馬鈴薯中的拷貝數(shù)不同有關(guān)[27]。相對(duì)含水量(RWC)反映了植物的保水能力, RWC越小, 說(shuō)明水分虧缺越嚴(yán)重, 對(duì)逆境的耐受性越弱[28]。在高溫脅迫下, 活性氧的積累導(dǎo)致植物生物膜脂發(fā)生過(guò)氧化產(chǎn)生丙二醛(MDA), 因此MDA含量越高, 說(shuō)明植物生物膜受傷害程度越深, 對(duì)逆境的耐受性越弱[29]。因此, 這2個(gè)指標(biāo)側(cè)面反映植物耐熱性的強(qiáng)弱。本研究通過(guò)檢測(cè)各植株在高溫處理后葉片中的RWC和MDA含量的變化發(fā)現(xiàn), 高溫處理后轉(zhuǎn)基因植株中的RWC顯著高于非轉(zhuǎn)基因植株, MDA含量顯著低于非轉(zhuǎn)基因植株。這說(shuō)明過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株比非轉(zhuǎn)基因植株在熱脅迫下的保水能力更強(qiáng), 受到熱脅迫導(dǎo)致的膜脂過(guò)氧化程度更低, 預(yù)示馬鈴薯植株內(nèi)過(guò)表達(dá)提高了馬鈴薯植株的耐熱性。

在前期研究中, 通過(guò)構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn),、與處于同一個(gè)共表達(dá)模塊中, 表明和可能是的共表達(dá)基因[15]。本研究發(fā)現(xiàn), 在正常條件下生長(zhǎng)時(shí),過(guò)表達(dá)馬鈴薯轉(zhuǎn)基因株系中和的表達(dá)量均顯著高于非轉(zhuǎn)基因植株, 說(shuō)明在馬鈴薯植株中的過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)了和表達(dá)。當(dāng)受到熱脅迫后, 轉(zhuǎn)基因植株中受高溫誘導(dǎo)而大量表達(dá), 與此同時(shí),和也呈現(xiàn)出與表達(dá)量變化一致的趨勢(shì)。這說(shuō)明對(duì)和表達(dá)起到一定的正調(diào)控作用, 與我們前期的研究結(jié)果相一致。StHsp26-CP屬于葉綠體sHsp家族。研究發(fā)現(xiàn), 擬南芥中的葉綠體sHsp (AtHsp21)能夠與一種質(zhì)體核蛋白pTAC5 (plastid transcriptionally active 5)結(jié)合, 來(lái)維持質(zhì)體編碼RNA聚合酶(plastid-encoded RNA polymerase, PEP)的功能, 從而保護(hù)葉綠體[30]。馬鈴薯StHsp26-CP是否具有與AtHsp21相似的作用, 還需要進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。Hsp70是一類結(jié)構(gòu)最保守、分布最廣泛的熱激蛋白。它能夠幫助蛋白質(zhì)正確折疊, 或者將蛋白聚合物降解, 最后將其轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外, 從而減輕熱脅迫對(duì)細(xì)胞和組織的破壞[31]。

類似地, 在擬南芥中也發(fā)現(xiàn)一些基因表達(dá)與HsfA3的豐度有密切的關(guān)系。Sakuma等[32]通過(guò)在擬南芥中過(guò)表達(dá)的上游基因發(fā)現(xiàn),和3個(gè)基因(、和)的表達(dá)量均顯著上升。隨后, Yoshida等[17]進(jìn)一步證明, 熱脅迫下擬南芥能夠直接被DREB2A調(diào)控而上調(diào)表達(dá), 從而產(chǎn)生一系列等熱誘導(dǎo)基因的級(jí)聯(lián)表達(dá), 如、和。然而, Hsf介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程, 往往是不同的Hsf分子共同作用的結(jié)果。如Li等[33]研究表明, 擬南芥中HsfA2和HsfA3在相同的耐熱調(diào)控途徑中發(fā)揮作用, 且它們?cè)诘鞍姿缴夏軌蚧プ? 從而誘導(dǎo)下游耐熱基因大量表達(dá)。因此, 在馬鈴薯中和是否是作為StHsfA3的靶基因而受到StHsfA3直接調(diào)控, 還需進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本研究從馬鈴薯品種Désirée中克隆得到基因, 該基因cDNA全長(zhǎng)為1506 bp, 編碼501個(gè)氨基酸。該蛋白的相對(duì)分子量為55.23 kD, 理論等電點(diǎn)為4.9, 無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽, 屬于親水性蛋白。StHsfA3與茄科植物番茄HsfA3的親緣關(guān)系最近。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法共得到5個(gè)過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯株系。過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了植株的相對(duì)含水量, 降低了植株的MDA含量, 表明基因在馬鈴薯響應(yīng)熱脅迫過(guò)程中起正調(diào)控作用。過(guò)量表達(dá)誘導(dǎo)了和表達(dá), 推測(cè)StHsfA3可能協(xié)同StHsp26-CP和StHsp70增強(qiáng)過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系的耐熱性。

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附圖1 馬鈴薯基因的cDNA序列和對(duì)應(yīng)的氨基酸序列

Fig. S1 cDNA sequence of potatoand corresponding amino acid sequence

Cloning of potato heat shock transcription factorgene and its functional analysis in heat tolerance

TANG Rui-Min1,2, JIA Xiao-Yun1, ZHU Wen-Jiao2, YIN Jing-Ming2, and YANG Qing2,*

1College of Life Sciences, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi, China;2College of Life Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, Jiangsu, China

During potato cultivation in the field, various adverse environmental stresses would affect its growth status. Heat stress in summer always results in the decline of tuber yield and quality. Therefore, it is of great significance to reveal the response mechanism of potato to heat stress and explore heat resistant genes for potato breeding. The activity of HsfA3 (heat shock transcription factor A3) affects the expression of numerous functional genes and plays an important role in response to heat stress. In order to investigate the structure and function of potato HsfA3, thegene was isolated from potato cultivar Désirée by RT-PCR. The full-length cDNA ofwas 1506 bp encoding 501 amino acids. StHsfA3 was predicted to be a hydrophilic protein with an estimated molecular weight of 55.23 kD and a theoretical isoelectric point of 4.9. The vector of-pBA002 was constructed and transformed into potato plants. Totally five independent transgenic potato plants overexpressingwere obtained. The detection of relative water content (RWC) and malondialdehyde (MDA) content showed that the RWC was significantly increased while MDA content was significantly decreased in the transgenic plants compared with the non-transgenic plants under heat stress, suggesting that StHsfA3 played a positive regulatory role in enhancing the heat resistance of potato. Furthermore, the expression levels of,, andwere determined by qRT-PCR in different potato plants. The results exhibited that the expression levels ofandin the transgenic lines overexpressingwere significantly higher than that in non-transgenic plants, indicating that StHsfA3might act in synergy with StHsp26-CP andStHsp70 to increase the heat tolerance of the transgenic plants.

potato; heat stress;; gene cloning; genetic transformation; functional characterization

10.3724/SP.J.1006.2021.04114

本研究由國(guó)家青年科學(xué)基金項(xiàng)目(31900450), 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)科技創(chuàng)新基金項(xiàng)目(2018YJ28)和山西省優(yōu)秀博士來(lái)晉工作獎(jiǎng)勵(lì)資金科研項(xiàng)目(SXYBKY2018034)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation for Young Scientists of China (31900450), the Science and Technology Innovation Fund of Shanxi Agricultural University (2018YJ28), and the Award Fund for Outstanding Doctors Working in Shanxi (SXYBKY2018034).

楊清, E-mail: qyang19@njau.edu.cn

E-mail: ruimin_tang829@hotmail.com

2020-05-25;

2020-08-19;

2020-09-08.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20200907.1415.004.html