王小純 王露露 張志勇 秦步壇 于美琴 韋一昊 馬新明,*

研究簡報

小麥谷氨酰胺合成酶同工酶轉(zhuǎn)錄特點(diǎn)及其啟動子序列分析

王小純1,2王露露1張志勇1秦步壇1于美琴2韋一昊1馬新明1,*

1河南糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心 / 河南農(nóng)業(yè)大學(xué), 河南鄭州 450002;2河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 河南鄭州 450002

谷氨酰胺合成酶是小麥氮同化關(guān)鍵酶, 分為胞液型和質(zhì)體型(TaGS2)兩類, 其中胞液型TaGS又分為TaGS1、TaGSr和TaGSe。為了研究異源六倍體小麥A、B、D染色體組TaGS同工酶表達(dá)差異及調(diào)控機(jī)制, 本項目利用三代測序技術(shù)測定了TaGS同工酶基因轉(zhuǎn)錄水平, 依據(jù)中國春基因組序列克隆了豫麥49的12個TaGS同工酶啟動子, 并對其序列進(jìn)行了分析。結(jié)果表明, TaGS1主要由6B染色體基因轉(zhuǎn)錄, TaGSe和TaGSr主要由4D染色體基因轉(zhuǎn)錄, TaGS2主要由2D染色體基因轉(zhuǎn)錄, 不同TaGS同工酶轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)距起始密碼子ATG的距離不同。啟動子元件分析顯示, 6B染色體上的TaGS1啟動子有較多W-box、AC-I、ABRE、as-1和茉莉酸甲酯等響應(yīng)元件, 4D染色體上的TaGSe啟動子有較多脅迫響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子(MYB、MBS、LTR等)結(jié)合元件和植物生長素響應(yīng)元件, 4D染色體上的TaGSr啟動子有較多WRE3等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件, 2D染色體上的TaGS2啟動子有較多A-box、WRE3、ARE及AT富集區(qū)。不同TaGS同工酶啟動子順式元件種類、數(shù)目及排列順序均不同, 為進(jìn)一步研究GS同工酶調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

小麥; GS同工酶; 轉(zhuǎn)錄; 啟動子; 順式作用元件

氮是植物生長發(fā)育的必需元素, 在作物產(chǎn)量與品質(zhì)形成過程中起重要作用。谷氨酰胺合成酶(GS)是植物氮素同化和運(yùn)轉(zhuǎn)的關(guān)鍵酶[1], 根據(jù)亞細(xì)胞定位可分為胞液型(GS1)和質(zhì)體型(GS2)兩類[2], 小麥GS1包含GS1.1 (GS1)、GS1.2 (GSr)和GS1.3 (GSe)。GS2參與硝酸還原氨與光呼吸釋放氨同化, GS1參與葉片衰老過程中氮素的再利用[3], GSr參與根部系氮素同化運(yùn)轉(zhuǎn), GSe參與籽粒發(fā)育過程中氮素利用[4]。GS活性與小麥籽粒可溶性蛋白含量及產(chǎn)量密切相關(guān)[5-9]。水稻過表達(dá)GS1基因, 其GS活性及可溶性蛋白含量顯著提高[10], 過表達(dá)GS2可以增強(qiáng)水稻的光呼吸和光合作用強(qiáng)度, 水稻過表達(dá)GS2和煙草過表達(dá)GS2均提高抗鹽能力[11-12]。過表達(dá)GSr可提高水稻對鹽、干旱及冷脅迫的敏感性[13]。QTL定位證明GS與小麥產(chǎn)量呈正相關(guān)[6]。可見, GS與植物生長發(fā)育和抗逆密切相關(guān)。

小麥?zhǔn)钱愒戳扼w, 有A、B、D三個染色體組, 每組染色體都有一套TaGS同工酶基因, 比如GS1有3個基因編碼, 即和。以前報道小麥GSr和GSe只有2個基因[14], 可能存在未發(fā)現(xiàn)的GSr和GSe同工酶基因。啟動子位于基因的5'端非編碼區(qū), 其結(jié)構(gòu)和功能影響基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。Michael等[15]發(fā)現(xiàn)擬南芥GLN1:2啟動子在高氮條件下活性更高。擬南芥不同GS啟動子存在組織特異性, 與GS同工酶在植物中表達(dá)部位相吻合[16-17]。Gómez-Maldonado等[18]研究發(fā)現(xiàn), 松樹GS啟動子可與MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合提高GS同工酶的表達(dá)量從而調(diào)控體內(nèi)氮代謝。小麥染色體組復(fù)雜, 不同染色體組基因表達(dá)存在差異。董佳敏等[19]發(fā)現(xiàn)A、B、D染色體上的expansin (膨脹素)基因均有表達(dá), 脅迫處理后B染色體上的expansin表達(dá)量最高, D染色體表達(dá)量最低, 可見不同染色體上的啟動子調(diào)控方式不同。

有關(guān)植物GS功能及分布等研究報道較多, 但對GS啟動子研究相對較少, 小麥GS啟動子研究至今尚未見報道。本研究依據(jù)中國春基因組序列, 在A、B、D染色體上克隆12個GS同工酶啟動子, 利用Plant-CARE在線軟件對其進(jìn)行序列分析及功能預(yù)測, 利用三代測序技術(shù)測定了小麥不同染色體組上GS同工酶的轉(zhuǎn)錄水平, 為深入研究小麥A、B、D染色體組上不同GS同工酶表達(dá)調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗品種為具有豐產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)特點(diǎn)、氮素利用效率高的河南省當(dāng)家品種之一, 豫麥49 (YM49)。將成熟飽滿大小均勻一致的小麥種子放入清水中浸泡, 露白后分別移入Hoagland營養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)至三葉一心, 分別取其根系和葉片, 液氮處理后于–80℃冰箱保存。許昌實驗農(nóng)場大田種植的豫麥49, 于2018年10月16日機(jī)械播種, 播種前一次施入氮素量為225 kg hm–2, 其他管理同大田。于小麥開花16 d后分別選取有代表性的旗葉、穗下節(jié)及籽粒, 每個處理重復(fù)3次, 液氮處理后于–80℃冰箱保存。

1.2 三代測序

將上述所取的葉、穗下節(jié)、籽粒、根系樣品分別于液氮中研磨成粉狀, 送百邁客生物科技公司, 由公司分別提取各部位RNA并等量混合后測序。

1.3 TaGS同工酶基因查找

依據(jù)本實驗室前期克隆的小麥GS同工酶的cDNA序列[GenBank號分別為: TaGS1:1 (DQ124209), TaGS1:2 (AY491968), TaGS1:3 (AY491970)和TaGS2 (DQ124212)], 在中國春小麥基因組文庫(http://plants.ensembl.org/ Triticum_aestivum/Info/Index)中查找小麥GS基因。利用ClustalX軟件進(jìn)行序列對比, 確定編碼GS同工酶的基因, 預(yù)測上游的啟動子位置。

1.4 引物設(shè)計

以1.3查找的中國春TaGS同工酶啟動子序列為模板, 利用Premier 5.0設(shè)計擴(kuò)增目的片段的引物。上游引物(S)在ATG上游2000 bp左右, 下游引物(A)在ATG下游500 bp左右(表1)。擴(kuò)增目的序列包含啟動子及ORF的5′端,由華大基因合成引物。

1.5 豫麥49基因組提取及啟動子克隆

利用CTAB法[20]提取YM49基因組DNA。以YM49基因組DNA為模板進(jìn)行PCR: 95℃預(yù)變性180 s; 95℃變性15 s, 退火15 s (退火溫度詳見表1), 72℃延伸160 s, 循環(huán)35次; 72℃穩(wěn)定5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后, 切取與目的片段大小一致的條帶, 利用膠回收試劑盒(諾唯贊, DC301)回收目的條帶, 然后與pTOPO載體(艾德萊, DR01)連接, 轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌, 利用卡那抗性平板篩選陽性克隆, 進(jìn)行PCR驗證后送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.6 啟動子序列分析

測序后利用ClustalX軟件與中國春小麥GS基因進(jìn)行序列對比, 并利用在線軟件Plant-CARE (http://bioinformatics. psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對啟動子序列進(jìn)行順式作用元件分析。

1.7 轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)預(yù)測

將三代測序的TaGS同工酶mRNA序列5′端A/G定為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn); 若5′端沒有A/G, 沿克隆的啟動子序列上游尋找最近的A/G定為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。根據(jù)克隆的啟動子序列, 距轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)最近的TATA-box為RNA聚合酶II識別位點(diǎn)[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 TaGS同工酶在小麥染色體中表達(dá)特點(diǎn)

TaGS同工酶種類多, 且同源性高, 利用qPCR不能準(zhǔn)確反應(yīng)各染色體上TaGS的表達(dá)情況。三代測序可以獲得YM49的TaGS同工酶全長轉(zhuǎn)錄本, 便于準(zhǔn)確區(qū)分各個TaGS基因。為了得到小麥所有TaGS同工酶表達(dá)信息, 選擇花后16 d根系、節(jié)間、葉片、籽粒及苗期根系與葉片組織RNA等量混合測序。三代測序數(shù)據(jù)分析顯示, 不同染色體組的TaGS同工酶表達(dá)量存在差異。其中TaGSr基因表達(dá)量最高, TaGSe基因表達(dá)量最低。TaGS1位于6號染色體長臂(L), 在A、B、D染色體上的表達(dá)量依次為6B> 6A>6D; TaGSe和TaGSr位于4號B、D染色體長臂(L)或A染色體短臂(S)。TaGSe在不同染色體上的表達(dá)量依次為4D>4A>4B; TaGSr在A、B、D染色體上的表達(dá)量依次則為4D>4B>4A; TaGS2位于2號染色體長臂(L), 在A、B、D染色體上的表達(dá)量依次為2D>2B>2A (圖1)。

表1 TaGS同工酶啟動子擴(kuò)增引物

2.2 TaGS同工酶啟動子克隆

TaGS同工酶基因轉(zhuǎn)錄受其啟動子元件調(diào)控, 為了探索其基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制, 對A、B、D染色體上的TaGS同工酶啟動子進(jìn)行了克隆。首先以YM49基因組為模板, 利用特異性引物(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 分別擴(kuò)增到A、B、D染色體上的TaGS1、TaGSr、TaGSe及TaGS2基因的啟動子片段(圖2)。將與表1一致的目的片段回收, 與pTOPO載體連接轉(zhuǎn)化DH5α, 提取質(zhì)粒, 并進(jìn)行PCR鑒定后(圖3), 相應(yīng)菌株進(jìn)行測序, 結(jié)果表明YM49與中國春的GS啟動子序列同源性為100%。

箭頭所指為目的片段。M: DNA分子量標(biāo)記。The arrows are the pointed to the target segment. M: marker.

箭頭所指為目的片段。M: DNA分子量標(biāo)記。The arrows are the pointed to the target segment. M: marker.

2.3 TaGS同工酶啟動子序列分析

利用Plant-CARE在線軟件對克隆測序的12個TaGS同工酶啟動子進(jìn)行分析, 發(fā)現(xiàn)存在功能不同的多種順式元件(圖4)。包括基本起始元件CAAT-box和TATA-box; 脫落酸、水楊酸、生長素、赤霉素及茉莉酸等激素響應(yīng)元件; 光響應(yīng)元件; 厭氧、防御及低溫等脅迫響應(yīng)元件; 分生組織表達(dá)調(diào)控元件及柵欄葉肉細(xì)胞分化元件等組織特異性元件; 細(xì)胞周期及晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)元件; MYB、MYC等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn), 以及as-1、W-box、dOCT及WRE3等未知功能響應(yīng)元件。

不同TaGS同工酶啟動子結(jié)構(gòu)不同, 同一TaGS同工酶在不同染色體上有其特殊的響應(yīng)元件。6A染色體上的TaGS1啟動子存在生長素響應(yīng)元件和晝夜調(diào)控元件, 6B染色體上TaGS1啟動子存在防御和脅迫響應(yīng)元件, 6D染色體上TaGS1啟動子存在MYBHv1結(jié)合位點(diǎn)。TaGSe在4A染色體上存在干旱響應(yīng)元件及MYB結(jié)合位點(diǎn), 在4B染色體上存在MYBHv1結(jié)合位點(diǎn)、分生組織表達(dá)調(diào)控元件, 在4D染色體上存在赤霉素響應(yīng)元件、生長素響應(yīng)元件、低溫響應(yīng)元件、MYBHv1結(jié)合位點(diǎn)、分生組織表達(dá)調(diào)控元件。TaGSr在4A染色體上存在A-box、MYC, 在4B染色體上存在赤霉素響應(yīng)元件、水楊酸響應(yīng)元件、缺氧特異性誘導(dǎo)元件、細(xì)胞周期調(diào)控元件, 在4D染色體上存在MYBHv1結(jié)合位點(diǎn)。TaGS2在2A染色體上存在赤霉素響應(yīng)元件、厭氧誘導(dǎo)調(diào)控元件, 在2B染色體上存在茉莉酸甲酯響應(yīng)元件, 在2D染色體上存在赤霉素響應(yīng)元件、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件、厭氧誘導(dǎo)調(diào)控元件。

基于TaGS同工酶啟動子克隆與序列分析, 結(jié)合三代測序結(jié)果, 對不同TaGS同工酶基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)進(jìn)行了預(yù)測(圖5)。結(jié)果表明: 胞液型TaGS(包括TaGS1、TaGSe和TaGSr)在A、B、D染色體上的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于ATG上游約–88~ –249 bp, 且不同染色體組之間存在差異。TaGS1位于6號染色體, 在A、B、D染色體上轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)分別位于ATG上游–202 bp、–249 bp、–171 bp; TaGSe和TaGSr位于4號染色體, TaGSe在A、B、D染色體上轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)分別位于ATG上游–110 bp、–139 bp、–191 bp; TaGSr在A、B、D染色體上轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)分別位于ATG上游–88 bp、–89 bp、–107 bp。質(zhì)體型TaGS2在A、B、D染色體上的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)距ATG最遠(yuǎn), 差異也最大, 約–111~ –631 bp。TaGS2位于2號染色體, 在A、B、D染色體上轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)分別位于ATG上游–111 bp、–631 bp、–448 bp。

小麥不同TaGS同工酶啟動子存在特異的響應(yīng)元件, 不同的環(huán)境條件下、不同的生長發(fā)育時期、不同的組織器官影響不同染色體上的TaGS同工酶轉(zhuǎn)錄水平不同, 而轉(zhuǎn)錄本5′端非編碼區(qū)與翻譯起始效率密切相關(guān), 進(jìn)一步影響TaGS同工酶表達(dá)量及生物活性, 從而影響小麥的氮素利用、產(chǎn)量和品質(zhì)。

3 討論

啟動子是基因表達(dá)的開關(guān), 可分為組成型、組織特異型和誘導(dǎo)型3種類型[22], 啟動子上的順式作用元件與基因表達(dá)水平密切相關(guān)。前人研究表明, 順式作用元件的種類、數(shù)量、順序及距離可能會影響轉(zhuǎn)錄的起始及轉(zhuǎn)錄水平[23-24]。啟動子上游存在的增強(qiáng)子或抑制子可能增強(qiáng)或降低基因的表達(dá)水平。栽培小麥不同染色體上的TaGS同工酶啟動子元件不同, 可能響應(yīng)不同環(huán)境條件, 以確保TaGS表達(dá)水平, 使小麥具有豐產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的特性。本實驗室前期TaGS同工酶活性測定及Western 雜交表明花后16 d小麥旗葉及子粒GS同工酶條帶最多, 表達(dá)量也最大[13]。為了獲得小麥GS同工酶轉(zhuǎn)錄本及轉(zhuǎn)錄量全面信息, 本研究以豫麥49花后16 d各組織器官及苗期葉片和根系為材料, 采用三代測序技術(shù)研究了TaGS同工酶在不同染色體上的表達(dá)特點(diǎn), 發(fā)現(xiàn)豫麥49不同染色體的GS1、GSr、GSe和GS2表達(dá)量不同, 但GSr、GSe和GS2都是D染色體基因表達(dá)量最大, D組染色體使栽培小麥從二粒小麥進(jìn)化到現(xiàn)在的多粒小麥, 根系、葉片及籽粒主要GS同工酶的大量表達(dá)是氮素同化的基礎(chǔ), 也是產(chǎn)量形成的基礎(chǔ)。

研究啟動子的方法主要是生物信息學(xué)預(yù)測分析及實驗驗證, 本文利用生物信息學(xué)對TaGS的12個啟動子序列進(jìn)行分析, 發(fā)現(xiàn)每個啟動子中存在多個TATA-box, 結(jié)合三代測序數(shù)據(jù)分析表明在A/G上游可能只有1個TATA-box是RNA聚合酶II識別位點(diǎn), 不同TaGS啟動子的起始轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)與TATA-box距離差別又十分大, 可能意味著起始轉(zhuǎn)錄的機(jī)理不盡相同; 每個啟動子都有許多光響應(yīng)元件, 但是只有TaGS2酶表達(dá)量及活性受光照強(qiáng)度影響[13], 當(dāng)利用啟動子與構(gòu)建重組載體轉(zhuǎn)化擬南芥時, 發(fā)現(xiàn)只有GS2-2AL啟動子受光誘導(dǎo)(結(jié)果尚未發(fā)表)。Plant-CARE在線分析還發(fā)現(xiàn)每個GS啟動子除了基本調(diào)控元件CAAT-box外, 還存在多種非生物脅迫應(yīng)答元件, 如缺氧/厭氧調(diào)控元件、干旱響應(yīng)原件、低溫響應(yīng)原件等以及轉(zhuǎn)錄因子如MYB、MYC等結(jié)合位點(diǎn), 啟動子上的順式元件特點(diǎn)與基因功能密切相關(guān)[25]。乙烯、茉莉酸和赤霉素處理使大豆基因啟動子活性增強(qiáng)[26], 干旱可誘導(dǎo)小麥啟動子活性[27], 小麥基因啟動子響應(yīng)干旱、低溫及ABA[28], 松樹的GS啟動子可與MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合從而提高GS同工酶的表達(dá)量[18]等。TaGS同工酶啟動子元件數(shù)量及種類不同, 對外界環(huán)境應(yīng)答不同, 可能是TaGS同工酶差異表達(dá)及在A、B、D染色體上差異表達(dá)的原因。但是這些啟動子元件是否真正存在, 哪個部位的響應(yīng)元件起作用, 以及如何響應(yīng)外界環(huán)境的變化等還需要進(jìn)一步驗證。

不同顏色代表不同類型的響應(yīng)元件, 顏色和形狀代表一個具體的響應(yīng)元件。紅色: 激素響應(yīng)元件; 綠色: 功能未知的響應(yīng)元件; 藍(lán)色: 基礎(chǔ)元件; 黑色: 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn); 紫色: 脅迫響應(yīng)元件; 粉色: 組織特異性響應(yīng)元件; 黃色: 光響應(yīng)元件。

Different colors represent different types of response elements; color and shape represent a specific response element. Red: hormone response element; Green: unknown function response element; Blue: basic element; Black: transcription factor binding site; Purple: stress response element; Pink: tissue specific response element; Yellow: light response element.

TATA-box為RNA聚合酶II識別位點(diǎn)。TATA box is the RNA polymerase II recognition site.

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Transcription characteristics of wheat glutamine synthetase isoforms and the sequence analysis of their promoters

WANG Xiao-Chun1,2, WANG Lu-Lu1, ZHANG Zhi-Yong1, QIN Bu-Tan1, YU Mei-Qin2, WEI Yi-Hao1, and MA Xin-Ming1,*

1Collaborative Innovation Center of Henan Grain Crops, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, Henan, China;2College of Life Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, Henan, China

As a key enzyme for nitrogen assimilation in wheat, glutamine synthetase is grouped into two classes: cytosolic GS and chloroplastic GS (TaGS2), and cytosolic GS includes TaGS1, TaGSr, and TaGSe. In order to study the expression characteristics and regulatory mechanisms of GS isozymes in chromosome A, B, and D of heterohexaploid wheat, transcripts of TaGS isoforms were analyzed based on the third-generation sequencing technology transcriptome analysis, and 12 promoters of TaGS isozymes of Yumai 49 were cloned based on Chinese Spring genome, and the sequence of the promoters were analyzed. The results showed that TaGS1 was mainly transcribed on chromosome 6B, TaGSe and TaGSr on chromosome 4D, and TaGS2 on chromosome 2D. Furthermore, the distance from initiation codon ATG to initiation site of transcript for each promoter of TaGS was distinct. Promoter element analysis showed that the promoter of TaGS1 in 6B had more W-box, AC-I, ABRE, as-1, and methyl jasmonic response elements, the promoter of TaGSe in 4D had more stress response elements (MYB, MBS, LTR, etc.) and auxin response element, the promoter of TaGSr in 4D had more WRE3 and transcript factor response elements, the promoter of TaGS2 in 2D had more A-box, WRE3, ARE, and an AT enrichment region. In summary, the number, type and order of cis-elements of different promoters of TaGS isozymes were distinct, which provided the foundation for further study on the regulation mechanism of TaGS isozymes.

wheat; GS isoforms; transcription; promoter; cis-element

10.3724/SP.J.1006.2021.01046

本研究由國家重點(diǎn)研發(fā)計劃項目(2016YFD0300205)和河南省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目(S2010-01-G04)資助。

This study was supported by the National Key Research and Development Program of China (2016YFD0300205) and the Modern Agricultural Technology System in Henan Province (S2010-01-G04).

馬新明, E-mail: xinmingma@126.com

E-mail: xiaochun.w@163.com

2020-06-03;

2020-10-17;

2020-11-02.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20201030.1707.010.html