李海蒙 周廣平 水 政 俞 輝 孫育海 洪 波

煙霧病是一種原因不明、以顱內(nèi)大動(dòng)脈閉塞伴顱底異常血管網(wǎng)生成為特點(diǎn)的疾病[1]。煙霧病的發(fā)生是多種因素共同作用的結(jié)果，具有易感基因的人群，在感染、炎癥在內(nèi)的多種因素作用下，導(dǎo)致顱內(nèi)大動(dòng)脈內(nèi)膜增厚伴纖維增生，最終導(dǎo)致相關(guān)血管狹窄甚至閉塞，并促使代償血管異常擴(kuò)張、增生，其中相關(guān)血清miRNA 的表達(dá)在其發(fā)生過程中起重要的作用。由于煙霧病的發(fā)病率具有明顯的地區(qū)和種族差異，提示不同種族的致病基因和發(fā)病機(jī)制存在多樣性[2]。目前，關(guān)于煙霧病的研究對象多集中在東亞人種[3]，而維吾爾族（簡稱維族）人群煙霧病的基因研究仍處于空白階段。本文以維族煙霧病病人為研究對象，通過miRNA芯片技術(shù)篩選煙血清異常表達(dá)的miRNA，隨后通過生物信息學(xué)方法分析跟煙霧病相關(guān)的基因，為維族煙霧病的診治提供參考。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 收集2017 年2 月至2018 年8 月新疆莎車縣人民醫(yī)院救治的8 例維族煙霧病與8 例維族健康者（對照組）的血樣。煙霧病均由腦血管造影證實(shí)且為雙側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈病變，排除文獻(xiàn)已證明可以伴有煙霧病綜合征的疾?。ㄖ袠猩窠?jīng)系統(tǒng)感染、結(jié)締組織病等）。兩組性別、年齡及白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血沉、血膽固醇水平等均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05，表1），但煙霧病組血糖水平明顯高于對照組（P＜0.05，表1）。8 例煙霧病臨床表現(xiàn)見表2。本研究獲得新疆喀什地區(qū)莎車縣人民醫(yī)院倫理委員會通過。

1.2 檢測方法

1.2.1 采血 采集外周靜脈全血約5 ml，30 min內(nèi)以4 000轉(zhuǎn)/min離心15 min，緩慢吸取上層血漿立即放置于-80 ℃冰箱保存后待測。

1.2.2 建立血清池 完成所有血漿收集后，每個(gè)標(biāo)本取150 μl血漿充分混勻，形成1.2 ml血清池。

1.2.3 提取血清總RNA 從血清池中取500 μl 樣本，加入500 μl TRIzol（美國Invitrogen 公司）充分旋渦震蕩后室溫靜置5 min，使其充分裂解；再加入200 μl異丙醇，充分混勻，4 ℃、12 000 轉(zhuǎn)/min 離心15 min后，吸取上清液1 ml；加入500 μl氯仿，搖勻，旋渦震蕩30 s，室溫靜置3 min，然后4 ℃、12 000轉(zhuǎn)/min離心15 min，吸取上層清液，加0.75 體積的異丙醇，搖勻后室溫靜置10 min，4 ℃、12 000 轉(zhuǎn)/min 離心10 min；收集含RNA 的沉淀，用75%乙醇重懸沉淀，4 ℃、8 000轉(zhuǎn)/min離心5 min，收集含RNA的沉淀，用300 μl DEPC水（美國Sigma公司）重懸沉淀待測。

1.2.4 測定RNA濃度 取1 μl含RNA的提取液，加入99 μl 的DEPC 水稀釋。采用SMA3000 光度計(jì)檢測，選擇“RNA”，將RNA 稀釋倍數(shù)設(shè)定為100。使用雙蒸水反復(fù)清洗比色杯3次，加入100 μl的DEPC水調(diào)零。加入稀釋好的RNA 提取液，開始檢測，分別測量A280 nm 和A260 nm 的光密度（optic density，OD）值，A260/A280值在1.8～2.0，以保提取RNA的純度。

表1 兩組基線資料比較

表2 8例煙霧病臨床表現(xiàn)

1.2.5 miRNA 測序及篩選 采用Exiqon miRCURY LNA microRNA 芯片（丹麥Exiqon 公司）高通量技術(shù)檢測miRNA 表達(dá)譜。應(yīng)用小芯片構(gòu)建單分子陣列，橋式PCR擴(kuò)增檢測信號。PCR每個(gè)循環(huán)中將四種熒光標(biāo)記的dNTP 和DNA 聚合酶添加到單分子陣列中，激光激發(fā)與dNTP 結(jié)合的標(biāo)記熒光信號，并使用計(jì)算機(jī)化分析系統(tǒng)將光信號轉(zhuǎn)換為測序堿基信息。通過標(biāo)準(zhǔn)化比較分析確定miRNA的最終讀數(shù)。

1.3 生物信息學(xué)分析 使用GenePix pro V6.0 軟件進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)分析，通過每個(gè)探針點(diǎn)獲得初始熒光強(qiáng)度值。標(biāo)準(zhǔn)化比較芯片之間的數(shù)據(jù)，重復(fù)芯片之間的數(shù)據(jù)分析，最終篩選出差異表達(dá)水平大于1.5或小于0.67倍的miRNA（P＜0.05）。將篩選出的差異表達(dá)的miRNA 利用targetscan 軟件進(jìn)行靶基因的預(yù)測和分析。得出的靶基因通過david 網(wǎng)站進(jìn)行基因功能詮釋和聚類分析、功能富集分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0軟件處理，計(jì)量資料以x±s表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)；檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)miRNA 的篩選 根據(jù)miRNA 表達(dá)芯片的分析數(shù)據(jù)，初步結(jié)果發(fā)現(xiàn)54個(gè)miRNA 位點(diǎn)存在差異表達(dá)，其中上調(diào)28 個(gè)，下調(diào)26 個(gè)。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，我們選擇表達(dá)水平變化倍數(shù)R 在0.67～1.5 篩選差異表達(dá)的miRNA，篩選出差異明顯的4 個(gè)miR?NAs，其中顯著上調(diào)3 個(gè)，分別是miR-188-5p、miR-4284 及miR-5100；顯著下調(diào)1 個(gè)，為miR-6277-3p。火山圖顯示明顯差異表達(dá)的miRNA（圖1）。

2.2 生物信息學(xué)分析 將上述差異表達(dá)的miRNA 分別在targentscan 網(wǎng)站上尋找靶基因，目標(biāo)積分80 以上的靶基因及功能。將靶基因做交集分析后，得出相互交集的靶基因有7 個(gè)，分別為MEX3A、FBXL18，、FZD2、AAK1、KAT7、CACLR、PLA2R1。根據(jù)交集和靶標(biāo)評分靠前的原則，鎖定25 個(gè)靶基因，經(jīng)David軟件GO分析出前10個(gè)靶基因（表3）。這些基因主要參與細(xì)胞和酶的代謝、活化、轉(zhuǎn)運(yùn)及感染和炎癥反應(yīng)，具體包括X 染色體的激活、鋅指蛋白、鋅離子的結(jié)合、細(xì)胞內(nèi)吞、蛋白代謝等。參考文獻(xiàn)后發(fā)現(xiàn)，某些鋅指蛋白和血管增生及新生血管形成有關(guān)，推測維吾爾族煙霧病發(fā)病可能和鋅指蛋白有一定的相關(guān)性。

3 討論

本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)的miR-4284 是近年來新發(fā)現(xiàn)的miRNA，其表達(dá)水平上調(diào)可能預(yù)示頸內(nèi)動(dòng)脈狹窄。miR-4284 在下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥病人血漿和血管組織中均明顯上調(diào)，在缺氧缺血清誘導(dǎo)的主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中明顯下調(diào)，缺氧缺血清誘導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中明顯上調(diào)[4]。

本文結(jié)果顯示維族煙霧病病人miR-6722-3p表達(dá)下調(diào)。有研究報(bào)道煙霧病病人血漿hsa-mir-6722-3p和hsa-mir-328-3p的差異表達(dá)[5]，基因分析和傳導(dǎo)通路分析顯示在煙霧病發(fā)病過程中，可通過miRNA-基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)功能。

表3 生物信息學(xué)分析篩選出的主要靶基因名稱及代碼

圖1 8例煙霧病差異表達(dá)miRNA的火山圖

鋅指蛋白含有短的我自折疊“指狀”結(jié)構(gòu)，并通過與Zn2+結(jié)合而穩(wěn)定。本文篩選出的靶基因中包含2 種鋅指基因，為ZFP91 和ZFP41，其中ZFP91 更值得關(guān)注，含有5個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域，同時(shí)具有轉(zhuǎn)錄因子特征性結(jié)構(gòu)基序[6]。Xu 等[7]報(bào)道ZFP91 是一種E3 泛素連接酶，負(fù)責(zé)Lys 185的hnRNP的泛素化以及蛋白酶體降解。此外，ZFP91 可以促進(jìn)pro-IL-ip 的產(chǎn)生和IL-1P的分泌[8]。我們推測，某種鋅指基因（如ZFP91等）可能是維族煙霧病發(fā)病的靶基因，通過激活或抑制miRNA（如miR-188-5p 等），在煙霧病的炎癥反應(yīng)過程或血管內(nèi)皮增生過程中，起著某種促進(jìn)作用，但具體作用機(jī)制需進(jìn)一步深入研究。

總之，遺傳因素和環(huán)境因素可能通過復(fù)雜的機(jī)制在維族煙霧病發(fā)病中發(fā)揮重要作用。希望未來能制造出整合這些因素的煙霧病動(dòng)物模型，進(jìn)一步證實(shí)。此外，煙霧病相關(guān)基因miRNA等在循環(huán)血液中的變化僅特異性地累及頸內(nèi)動(dòng)脈系統(tǒng)，而全身其他血管卻不受累，這種現(xiàn)象目前還無法完全解釋。